细胞周期同步化
细胞周期与细胞同步化
(一)M期同步化方法 期同步化方法 1．振荡收集法 ． 该法利用M期细胞变圆易脱落的特点， 该法利用 期细胞变圆易脱落的特点， 期细胞变圆易脱落的特点 将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间 隔振荡， 期细胞脱落， 隔振荡，使M期细胞脱落，逐步收集培 期细胞脱落 养基，并补充新的培养基。 养基，并补充新的培养基。收集的细胞 度冰箱中保存， 放4度冰箱中保存，离心沉淀后即获得 度冰箱中保存 M期细胞。 期细胞。 期细胞
3．N2阻断法 ． 此方法较秋水仙胺阻抑法好。 此方法较秋水仙胺阻抑法好。 (1)将细胞传代培养至指数生长期。 将细胞传代培养至指数生长期。 将细胞传代培养至指数生长期 (2)将培养瓶置于 2罐中通人适量 将培养瓶置于N 将培养瓶置于 CO2(约相当于罐中体积的 ％)。 约相当于罐中体积的5％ 。 约相当于罐中体积的 (3)关闭好 2罐，接上 2管子及压力 关闭好N 接上N 关闭好 缓缓向罐中充气一直到压力为80表，缓缓向罐中充气一直到压力为 90磅为止。 磅为止。 磅为止
尽管建立了细胞株获得了细胞克隆但这些细胞的生命周期并不是完全同步的即在某一时间只有少数细胞进行着有丝分裂活动表现出细胞分裂的不同在研究工作中除了要调节细胞的培养环境为之创造与机体内细胞基本相同的生存条件还要研究细胞内调控使之按照人的意愿生长或合成产物
第八章 细胞周期与细胞同步化
培养的有机体细胞的增生与体内细 胞一样， 胞一样，也是借助于细胞有丝分裂 而实现的。 而实现的。 细胞从一次有丝分裂结束到下一次 有丝分裂结束所经历的全过程， 有丝分裂结束所经历的全过程，成 为细胞周期。 为细胞周期。
二、细胞同步化
在一般培养条件下， 在一般培养条件下，群体中的细胞 处于不同的细胞周期时相之中。 处于不同的细胞周期时相之中。 为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、 为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、 基因表达或凋亡， 基因表达或凋亡，常需采取一些方法使 细胞处于细胞周期的同一时相， 细胞处于细胞周期的同一时相，这就是 细胞同步化技术。 细胞同步化技术。
细胞周期同步化PPT课件
2021/3/7
CHENLI
4
（1）.人工选择同步化
• 人工选择同步化：人为的将处于不同细胞 周期的细胞分离开，从而获得不同时期细 胞群体的方法。
• 人工选择同步化的方法：
（1）.有丝分裂选择法密
（2）度梯度离心法
2021/3/7
CHENLI
5
有丝分裂选择法（反复振摇法）
• 利用有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的 附着性降低的特点。此法的特点是细胞不 受药物等的伤害，同步化程度高，放入 37℃环境中，收集的细胞即可同步分裂。 缺点是分裂细胞一般占1%-2 ％，分离的细 胞数量少。
2
同步化方法
• 1.自然同步化 • 2.人工同步化 • （1）人工选择同步化 • （2）人工诱导同步化
2021/3/7
CHENLI
3
1.自然同步化
• 自然同步化在自然界中，细胞自然同步化 的现象在动、植物及粘菌中都有所发现， 它们不受人为条件的干扰，因而有可能在 接近自然的条件下进行观察。
• 缺点：自然同步化受到很多条件的限制。
11
2.2 DNA分裂中期阻断法
• 某些药物可抑制微管的聚合，将细胞阻断 于有丝分裂中期。非平衡生长问题不十分 明显。但长时阻断释放后许多细胞不能恢 复正常的细胞周期。
• 中期阻断药物最常用者为秋水仙素或其衍 生物秋水仙酰胺。
2021/3/7
CHENLI
12
DNA分裂中期阻断法的优缺点
• 优点：操作简便，效率高 • 缺点：这些药物的毒性相对较大，若长时
2021/3/7
CHENLI
10
DNA合成阻断法优缺点
• 优点：同步化程度高，适用于任何培养体 系，可将几乎所有的细胞同步化。
细胞同步化的方法和原理
细胞同步化的方法和原理
细胞同步化是一种通过控制细胞周期，使大量细胞在相同时间点进入特定细胞周期阶段的方法。
主要应用于细胞生物学研究、细胞遗传学和细胞生理学等领域。
常用的细胞同步化方法包括药物处理法、放射线辐射法和营养限制法。
下面将详细介绍这些方法及其原理：
1. 药物处理法：通过给细胞添加特定的化学物质来控制细胞周期。
例如，使用细胞周期抑制剂（如阿霉素、异烟肼、氟乙酰胺等）可以阻止细胞进入或退出特定的细胞周期阶段，从而实现细胞同步化。
此外，还可以利用细胞周期促进剂（如脱氧胸腺嘧啶、多巴胺等）来促进细胞进入特定的细胞周期阶段。
2. 放射线辐射法：通过短暂暴露细胞于放射线（如X射线或紫外线），可引发DNA损伤和细胞凋亡等反应，从而导致细胞同步化。
在辐射后，生存的细胞会重新开始增殖，并在相同的时间点进入细胞周期特定阶段。
3. 营养限制法：通过控制细胞培养基的营养成分，如氨基酸、葡萄糖等，可以限制细胞的生长和增殖速度，从而实现细胞同步化。
在特定的营养条件下，细胞会在一定时间内停滞于同一个细胞周期阶段。
这些方法的原理是通过干扰细胞周期的正常进行，使大量细胞在特定的细胞周期阶段同时进入或停滞，以便研究某一特定阶段的细胞生理过程或细胞周期调控机制。
不同的方法适用于不同类型的细胞和
研究目标，选择合适的方法需要根据具体实验需求和细胞特性来确定。
细胞周期同步化
细胞周期同步化在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。
不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此,需要获得周期一致性的细胞。
利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体.细胞周期同步化(synchronization）是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相（除了G0期的细胞）的现象。
细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。
DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。
高浓度TdR（胸腺嘧啶核苷）双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法.它可逆地抑制DNA 合成,而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处.其原理是: Td Ｒ是细胞DNA 合成不可缺少的前体,但向培养基中加入过量TdＲ,可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成.它将细胞同步于G1 /S期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大.TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。
羟基脲、5—氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂,它们与TdR作用相似,均可通过抑制DNA 合成达到同步化的目的。
中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。
秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。
中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。
细胞周期同步化常用的方法
细胞周期同步化常用的方法在一般培养条件下，群体中的细胞处于不同的细胞周期时相之中。
为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，常需采取一些方法使细胞处于细胞周期的同一时相，这就是细胞同步化技术。
细胞同步化的方法有选择同步化和诱导同步化，其中，选择同步化常用的方法有有丝分裂选择法和细胞沉降分离法。
选用DNA合成抑制剂可逆地抑制S期细胞DNA合成而不影响其他细胞周期运转，最终可将细胞群体阻断在G1/S期交界处；一些抑制微管聚合的药物，因抑制有丝分裂装置的形成和功能行使，可将细胞阻断在有丝分裂中期，即使细胞同步于M期。
一、M期同步化方法1．振荡收集法该法利用M期细胞变圆易脱落的特点，将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间隔振荡，使M期细胞脱落，逐步收集培养基，并补充新的培养基。
收集的细胞放4℃冰箱中保存，离心沉淀后即获得M期细胞。
2．秋水仙素阻抑法（1）将细胞传代培养至指数生长期。
（2）加入秋水仙胺，使最终浓度为0.05－0.1μg/mL培养基，作用6－7 h。
如使用秋水仙素，使用浓度应加大5～10倍。
（3）振荡收集细胞，800 r/min离心5－10 min，弃上清，收集的沉淀细胞即为M期细胞。
加入一定量培养基将细胞接种到培养瓶中或直接进行离体实验。
由于秋水仙素或秋水仙胺对细胞有一定毒性，用量较小或作用时间较短细胞活性尚可恢复，而用量过大或时间过长则细胞不能存活，因此使用时应严格控制其剂量和作用时间。
3．N2阻断法此方法较秋水仙素阻抑法好（1）将细胞传代培养至指数生长期。
（2）将培养瓶置于N2罐中通入适量CO2（约相当于罐中体积的5％）。
（3）关闭好N2罐，接上N2管子及压力表，缓缓向罐中充气一直到压力为80-90磅/英寸2为止。
（4）将N2装置放在37℃培养箱中10－16 h（通常过夜）。
次日从培养箱中取出，然后缓缓将N2放出（最好放出窗外）。
（5）取出细胞在镜下观察同步化效果，用振荡法收集细胞于离心管中。
细胞周期同步化
细胞周期同步化借助某种实验手段(自然地或经人为地),使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相的现象。
细胞周期同步化分：自然同步化和人工同步化。
自然同步化：是自然界存在的现象, 在动、植物细胞都有发现。
它们不受人为条件的干扰, 因而有可能在接近自然的条件下进行观察, 但自然同步化的细胞群体受到诸多条件的限制, 对结果有很大的影响。
人工同步化：是利用细胞培养的方法, 用各种理化因素处理获得的同步化生长的细胞。
常用的细胞人工同步化的方法分为选择同步化、诱导同步化或者两者的结合。
同步化分类及方法（一）自然同步化1．多核体如粘菌只进行核分裂，而不发生胞质分裂，形成多核体。
数量众多的核处于同一细胞质中，进行同步化分裂，使细胞核达108，体积达5~6cm。
疟原虫也具有类似的情况。
2．某些水生动物的受精卵如海胆卵可以同时授精，最初的3次细胞分裂是同步的，再如大量海参卵受精后，前9次细胞分裂都是同步化进行的。
3．增殖抑制解除后的同步分裂如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。
（二）人工同步化1．选择同步化1) 有丝分裂选择法：使单层培养的细胞处于对数增殖期，此时分裂活跃，分裂指数高,MI高。
有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性低，此时轻轻振荡，M期细胞脱离器壁，悬浮于培养液中，收集培养液，再加入新鲜培养液，依法继续收集，这样每隔1h摇一次并收获一次，倾出培养液贮存于2~4℃冰箱中保存可连续收集24h，则可获得一定数量的中期细胞。
其优点是，操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害，缺点是获得的细胞数量较少。
（分裂细胞约占1%～2%）2）细胞沉降分离法：不同时期的细胞体积不同，而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比，因此可用离心的方法分离。
其优点是可用于任何悬浮培养的细胞，缺点是同步化程度较低。
2．诱导同步化1）DNA合成阴断法：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成，而不影响其他时期细胞的运转，最终可将细胞群阻断在S期或G/S交界处。
细胞周期同步化有哪些方法？
细胞周期同步化有哪些方法？在一般培养条件下，群体中的细胞处于不同的细胞周期时相之中。
为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，故常需借助某种自然或人工的实验手段，使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相的现象，这就是细胞同步化技术。
由于细胞群体受到多种条件限制，对结果有很大影响，所以一般采用人工同步方法，下面就来介绍几种常用的方法。
M期同步化法01振荡收集法该法利用M期细胞变圆易脱落的特点，将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间隔振荡，使M期细胞脱落，逐步收集培养基，并补充新的培养基。
按照此法继续收集，可得到一定数量的M期细胞。
优点：方法简单，同步化程度高且不受药物伤害，能够真实反应细胞周期状况；缺点：由于M期较短，得到的细胞很少，并且只适用于贴壁细胞。
02秋水仙素阻抑法秋水仙素可以抑制微管聚合，因而能有效地抑制细胞纺锤体的形成，将细胞阻断在细胞分裂中期。
此方法也比较简单，将细胞培养至指数生长期，加入秋水仙素，使培养基最终浓度为0.25~0.5μg/mL，作用6~7min，收集细胞800r/min离心5~10min，弃上清，沉于管底的细胞即为M期细胞。
注意：由于秋水仙素对细胞有一定毒性，用量较小或作用时间较短时细胞活性尚可恢复，而用量过大或时间过长则细胞不能存活，因此使用时应严格控制其剂量和作用时间。
03N2阻断法细胞培养至指数生长期后将培养瓶置于N2罐中并通适量CO2 ，约相当于罐中体积的5%。
关闭好N2罐，接上N2管子及压力表，缓缓向罐中充气一直到压力为80~90磅/英寸为止。
将N2装置放在37℃培养箱中10~16h(通常过夜)。
次日从培养箱中取出，然后缓缓将N2放出。
取出细胞在镜下观察同步化效果，用振荡法收集细胞于离心管中。
800r/min离心10min收集细胞。
优点：此方法较秋水仙素阻抑法好。
S期同步化法01胸腺嘧啶核苷（T dR）双阻断法胸腺嘧啶核苷（T dR）是一种DNA合成可逆抑制剂（阻断S期，去除后S期可继续进行）。
细胞周期的同步化
• 在某高等动物细胞Z的细胞周期中，各时期经历时间依次为G1期 （DNA合成前期）8 h，S期（DNA合成期）6 h，G2期（DNA 合成后期）5 h，M期（分裂期）1 h。某DNA合成抑制剂能特异 地抑制DNA的合成，对S期以外的细胞无影响，但可以阻止这些 细胞进入S期而停留在G1/S交界处，抑制剂解除后所有细胞能继 续进行细胞周期运转。将一定数量的Z细胞和一定剂量的抑制剂 加入细胞培养液中培养一段时间，然后洗脱抑制剂，并更换培养 液培养一段时间，第二次加入抑制剂培下列 叙述正确的是
利用一定方法使细胞群体处于细胞周期的同一阶段，称为细胞周 期同步化．以下是能够实现动物细胞周期同步化的三种方法．回 答下列问题： （1）DNA合成阻断法：在细胞处于对数生长期的培养液中添加适 量的DNA合成可逆抑制剂，处于_______期的细胞不受影响而继续 细胞周期的运转，最终细胞会停滞在细胞周期的_______，以达 到细胞周期同步化的目的． （2）秋水仙素阻断法：在细胞处于对数生长期的培养液中添加 适量的秋水仙素，秋水仙素能够抑制______________，阻止染色 体移向两极，使细胞周期被阻断，即可实现细胞周期同步化．经 秋水仙素处理的细胞______（填“会”或“不会”）被阻断在间 期． （3）血清饥饿法：培养液中缺少血清可以使细胞周期停滞在间 期，以实现细胞周期同步化，分裂间期的特点是_____________ __________________________________（答出1点即可）．
• 〔考点〕细胞周期 及细胞周期的同步化
• A. 实验开始时，培养液中的处于M期细胞占的比例可能为 10% • B. 第一次加入的抑制剂处理时间应不小于13 h • C. 第一次加入的抑制剂处理应使细胞处于G1/S交界处 • D. 第一次加入的抑制剂洗脱后，细胞培养时间应大于6 h、 小于14 h时第二次加入抑制剂 • 〔答案〕D • 〔解析〕实验开始时，培养液中的处于M期细胞占的比例 可能为5%，Ａ错；第一次加入的抑制剂处理时间应不小 于14h，B错；第一次加入的抑制剂处理应使细胞处于S期 和G1/S交界处，C错；第一次加入的抑制剂洗脱后，细胞 培养时间应使S期细胞全部出S期，至少6 h、最前S期细 胞到达下一周期G1/S交界处要14 h，D正确。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。
不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。
利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。
细胞周期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。
细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。
DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。
高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。
它可逆地抑制DNA 合成，而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。
其原理是: Td Ｒ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。
它将细胞同步于G1 /S期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大。
TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。
羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。
中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。
秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。
中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。
过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。
秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。
经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。
将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。
由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成G1/G0期（1倍），S期（1-2倍）和G2/M期（2倍）。
流式细胞仪可以根据DNA含量在不同时间内的变化,从而确定细胞周期的长短,也可以直接标记DNA复制（放射性同位素标记）,统计细胞数量与标记细胞的百分比,对细胞周期进行综合分析.连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程为细胞周期(cell cyc1e)。
细胞周期包含四个阶段：①G1期(first gap),又称合成前期，指前一次有丝分裂完成到DNA复制前的一段时期；②S期(synthesis phase),即DNA合成期，为真核细胞分裂(cell pision)间期中进行DNA合成的阶段；③G2期(second gap),为DNA合成后期，指DNA合成结束至有丝分裂开始之间的一个阶段；④M期 (mitosis or pision) ,又称D期，是染色体真正开始分离时期。
细胞周期又可分为有丝分裂期（M期）和分裂间期(即G1→S→G2)两个时期。
尽管细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异，但相对而言M期最短，S期较长。
流式细胞仪（flow cytometer；FCM）的工作原理是在样品管中放入待测细胞，在气体的压力下使待测细胞进入充满鞘液的流动室。
在细胞流动室里单细胞悬液被鞘流液包绕通过流动室内一定孔径的孔，形成细胞柱。
然后通过对流动液体中单列的细胞进行逐一检测，得到单个细胞的光散射和荧光指标，在功能水平上定量分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等的物理、化学特征等多个参数。
流式细胞仪不仅可以根据不同时间内DNA含量的变化来确定细胞周期的长短，还可以直接用放射性同位素标记DNA复制，通过统计细胞数目与比较各时相细胞的百分比来检测是否达到预期目的，从而对细胞周期各时相进行综合分析。
流式细胞分析法与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，已成为当代最先进的细胞定量分析技术。
Hela细胞周期时间为21 h，其中G1期为10 h，S期为7 h，G2期为3 h，M期为1 h。
一、S期同步化方法（胸腺嘧啶核苷双阻断法，两次可让细胞同步化到G1/S期）胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法：在处于对数生长期细胞的培养基中首次加入过量的DNA合成抑制剂TdR，能可逆地抑制S期细胞的DNA生成，而不作用其他细胞阶段的运转，导致大多数细胞群被同步化于G1/S期交界处，但仍有部分细胞处于S期范围；移去胸腺嘧啶核苷，细胞再培养一段比S期较长而短于G2、M、G1三期总和的时间，让它们完全越过S 期，但又不使按周期发展最快的细胞进入下一个S期。
第二次胸腺嘧啶核苷处理，当细胞继续运转至G1/S交界处时，被过量的胸腺嘧啶核苷抑制而停止。
细胞则于G1/S期边界汇集，再次撤掉胸腺嘧啶核苷，加入完全培养基，使细胞继续生长，则细胞同时启动于S 期。
5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度AdR和GdR等DNA合成抑制剂均可抑制DNA合成使细胞同步化，由于高浓度胸腺嘧啶核苷对S期细胞的毒性较小，因此常用胸腺嘧啶核苷双阻断法诱导细胞同步化。
其优点是同步化程度高，适用于任何培养体系。
几乎可将所有的细胞同步化，缺点是造成非均衡生长，个别细胞体积增大。
二、M期同步化方法（振荡收集法）该法利用M期细胞变圆易脱落的特点。
在处于对数增殖期的单层贴壁细胞（分裂活跃，M 期多）中加入Nocodazole。
一段时间后，多数细胞被阻滞与M期，轻轻振荡或拍击培养瓶，M期细胞则与瓶壁脱离，悬浮在培养液中，收集培养液，之后再加入新鲜培养液，按照此法继续收集，可得到一定数目的M期细胞。
振荡收集法操作简单，同步化程度高并且细胞不受药物伤害，能够真实反映细胞周期状况，缺点是由于M期较短，被分离出的细胞很少，只能应用于贴壁细胞。
收集到的有丝分裂期的细胞可以贮存在冰上，然后处理其余的培养瓶。
三.实验用品1.材料：Hela细胞。
2.试剂：%胰蛋白酶液、无血清细胞培养液、DAPI试剂、Hank’s液、2mmol/L TdR、70％乙醇（保存于4℃）、RNase-A（10mg/ml,-20℃保存）、PI（650 g/ml，避光保存于-20℃）、PBS (pH 保存于4℃)、秋水仙胺、秋水仙素。
3.器材：培养瓶、移液器、枪头、5ml注射器、试管、离心管、封口膜、微量移液器、Tips、烧杯、废液缸、细胞培养设备、倒置显微镜、台式离心机、水浴、4℃冰箱、二氧化碳培养箱、N2罐、流式细胞仪、超净工作台。
四.实验步骤(一)S期同步化方法（TdR双阻断法）(1) 取指数生长期细胞。
(2) 第一次阻断：将对数生长期细胞的培养基换成含2mmol/L的新鲜TdR培养液。
(3) 37℃、5%CO 二氧化碳培养箱中培养12h(4) 第一次释放：弃去含有胸腺嘧啶核苷的培养基，用Hanks液对贴壁细胞漂洗2～3次，并更换不含TdR的新鲜培养基，继续培养16h。
(5) 第二次阻断：弃去培养液，再加入浓度为2mmol/LTdR的新鲜培养基，37℃、5%CO 培养12h。
(6) 第二次释放：重复第（4）步骤，此时的细胞大部分出去G1/S期边界，同步化细胞随时间推移逐渐进入S期。
（二）M期同步化方法（振荡收集法）(1) 取生长于占瓶底面积60%～80%的细胞一瓶，轻轻摇晃或拍击培养瓶，使松动细胞脱落而悬浮在培养液中，并用离心管收集。
(2) 用Hank洗涤2次，漂洗液收集到离心管。
(3) 600rpm离心5分钟，并用培养液将细胞浓度调整为×105个/ml接种于培养瓶。
(三)利用流式细胞术分析细胞周期时相(1) 将细胞传代培养至指数生长期，吸弃细胞培养上清，用Hanks液洗涤细胞一次，胰酶消化细胞，完全培养基终止，收集细胞。
1200rmp 5min离心，弃去上清。
(2) 4℃预冷的PBS漂洗细胞沉淀2次，1500rmp离心5分钟，收集细胞。
(3) 快速将细胞悬液注入预冷的70%乙醇中，封口膜封口。
4℃固定过夜（可长至2周）。
(4) 1500rmp 离心5分钟去固定液，收集固定细胞，用 PBS使细胞重悬并转至试管中吹打均匀（防止细胞破碎）。
PBS漂洗2次。
(5) 细胞染色液配制：40×加碘化丙啶（PI）母液（2 mg/ml）：100×RNA酶A母液（10 mg/ml）：1×PBS =25：10：1000。
(6) 细胞染色：根据细胞量，加入一定体积的细胞染色液（1～）重悬，使上机时细胞通过率为200～350 Cell/s。
(7) 用300目（孔径40～50 m）的筛网过滤于流式上机管中，上机检测。
(8) 样品分析测定及打印。
(四) 秋水仙素阻抑法(1)将细胞培养至指数生长期。
(2)加入秋水仙素，使培养基最终浓度为～μg/mL，作用6～7小时。
(3)收集细胞，800rpm离心5～10分钟，弃去上清，沉于管底的细胞即为M期细胞。
(五)N2阻断法(1)将细胞传代培养至指数生长期。
(2)将培养瓶置于N2罐中并通入适量CO2(约相当于罐中体积的5％)。
(3)关闭N2罐，连接N2管子和压力表，慢慢向罐中充入氮气直到压力为80～90磅／英寸为止。
(4)将N2装置放在37℃培养箱中10～16小时。
次日取出，然后缓缓放出N2(最好放出窗外)。
(5)取出细胞观察同步化效果，并用振荡法收集细胞于离心管中。
(6)800rpm离心10分钟，收集细胞。
（六）G1期和G2期细胞的获得1．G2期细胞的获得根据细胞周期测定的数值，使用胸腺嘧啶核苷双阻断法使细胞同步化于G1/S期交界处后，使细胞释放胸腺嘧啶核苷后继续培养。
其培养时间应大于S期时间并小于S期与G2期总和的时间。
然后先用振荡收集法使已进入M期的细胞脱落瓶壁，弃去上清培养基；再用胰酶消化，加入新鲜培养基制成细胞悬液，离心收集细胞，即为G2期细胞。
2．G1期细胞的获得(1)向用胸腺嘧啶核苷双阻断法获得的细胞中加入一定量的培养基，继续培养大于S+G2+M期小于一个周期的时间即可获得G1期细胞。
(2)向细胞中加入缺乏异亮氨酸的培养基进行培养，培养时间超过一个细胞周期，即可获得G1期细胞。
Chemical/pharmacol ogical inhibitionof DNA replication/synthe sis or mitotic spindle formationLovastatin Inhibition of HMG-CoAreductase (cholesterolsynthesis) and theproteasomeEarly G1Mimosine Inhibitionof thymidine,nucleotidebiosynthesis,inhibition ofCtf4/chromatin bindingLate G1;G1/SThymidineTdRExcess thymidine-induced feedbackinhibition of DNAreplicationG1/SAphidicolin Inhibition of DNApolymerase-α and DNApolymerase-δG1/SHydroxyurea Inhibition ofribonucleotidereductaseG1/SColchicineColcemideInhibition ofmicrotubulepolymerizationG2/MNocodazole Inhibition ofmicrotubulepolymerizationG2/MMitogen or growth factor withdrawal Serum starvation Growth restriction–induced quiescenceG0/G1Amino acidstarvationGrowth restriction–induced quiescenceG0/G1Density arrest ContactinhibitionCell-cell contact–induced activation ofspecifictranscriptionalprogramsG1。