成纤维细胞同步化研究
成纤维细胞生长因子13的研究进展
成纤维细胞生长因子13的研究进展作者：戴江波安宁张文亮吕淑楠王旭来源：《健康周刊》2017年第29期【摘要】成纤维细胞生长因子（Fibroblast Growth Factor，FGF）13，是对人类卵巢细胞进行高通量测序得到的产物[1]。
FGF13因其N端缺乏典型的分泌序列，无法被分泌到细胞外，也无法与FGF受体的胞外端结合，又被称为成纤维细胞生长因子同源性因子（Fibroblast Growth Factor Homologous Factors，FHFs）2[2]。
本文探讨了FGF13的结构特点，FGF13在神经、肌肉发育中的影响以及在疾病中的表达。
【关键词】成纤维细胞生长因子13；结构；生理学功能；疾病1 FGF13的结构特点1.1 FHFs家族成员FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14作为成纤维细胞生长因子家族中的一类特殊成员，因为在结构上与其他FGFs家族成员存在差异，又被称为成纤维细胞生长因子同源性因子。
FHF-3、FHF-1、FHF-2、FHF-4共同构成FHFs亚家族[3]。
FHFs亚家族成员与FGFs家族成员间的同源性仅有30%-50%，而FHFs亚家族成员间的同源性高达60%-70%，FGF-13与 FGF-8氨基酸水平相似度高达70%[4]。
FHFs亚家族成员与FGFs其他家族成员在结构上有不一样的特性，FHFs亚家族的四个成员只有一个共同的核心区域[5， 6]，研究表明该核心区域为晶体结构域[7]。
此外，该家族成员的N端上缺乏分泌信号序列，因此不能被分泌到细胞外，都储存于胞内，也不能与FGF受体胞外端结合进一步激活。
故FHFs也称为细胞内的成纤维细胞生长因子。
1.2 FGF13的结构与表达FGF-13是人类卵巢癌细胞文库高通量测序的分子克隆产物。
FGF-13的编码蛋白质由216个氨基酸组成，分子量为22KDa[1]。
FGF13 N末端存在由23个氨基酸组成的疏水区，缺乏自身的信号分泌序列，因此FGF13不能被分泌到细胞外[8]。
中成药抑制成纤维细胞胶原沉积的作用研究
中成药抑制成纤维细胞胶原沉积的作用研究*杨剑，韩立峰，邵睿，张鹏，郝佳，常艳旭，高秀梅，王涛（天津中医药大学中医药研究院，天津301617）*基金项目：天津市科技重大专项与工程项目（20ZXGBSY00050）。
作者简介：杨剑（1987-），女，博士，副研究员，主要研究方向为特发性肺纤维化的药理及制剂研究。
通讯作者：王涛，E-mail ：******************.cn·新型冠状病毒肺炎·2020年初新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎）的突发给中国人民健康和经济发展带来了巨大打击。
该疫情被世界卫生组织列为国际关注的公共突发卫生事件。
短短两个月事件造成全国7万余人感染，3000余人死亡，疫情波及30个国家，引起了世界范围的恐慌。
近年世界范围多次出现病毒性呼吸道传播疾病，包括2003年严重急性呼吸综合征（SARS ）、2009年H7N9流感、2012年中东呼吸综合征（MERS ）等相关疫情。
疾病发生频率逐渐加快，病毒变异迅速，从常规抗病毒化学药物、疫苗研发规律来看，临床有效治疗药物缺乏，治疗手段难以及时跟进。
如何发挥中医药防疫抗病能力成为中医药研究者的重要课题。
在新型冠状病毒感染后，体液中迅速大量产生多种细胞因子，形成细胞因子风暴，导致人体免疫系统紊乱，引起急性呼吸窘迫综合征、多器官衰竭等症[1]。
细胞因子风暴需药物及时干预，以避免过多的组织液肺部渗出，影响呼吸功能[2]。
大量临床证据证实，病毒侵染呼吸系统，造成肺损伤后可引起肺纤维化。
SARS 流行期间，有45％的患者在感染后1个月肺部表现出“毛玻璃”外观。
跟踪病例研究显示，有27.8％的SARS 幸存者肺功能下降，肺纤维化程度增加。
肺纤维化是病毒性肺炎患者恢复期的常见后遗症，缺乏有效临床治疗药物。
本研究收集了多种上市中成药，筛选抗成纤维细胞胶原沉积活性药物，为病毒感染肺损伤者的愈后干预提供科学依据。
1实验部分1.1仪器与材料KO-250E 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；IKA RV 10旋转蒸发仪，德国IKA 公司；Milli-Q 超纯水制备仪，Millpore 公司；超声裂解仪，宁波新芝生物科技有限公司；DC300F 倒置相差显微镜，德国Leica 公司；多功能酶标仪，Tecan 公司；倒置显微镜，日本Nikon 公司；NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞株及MRC5人源成纤维细胞株均来自ATCC ；转化生长因子-β1（TGF-β1），R&D system 公司；SB431542，美国Selleck 公司；DMEM 培养基、胎牛血清均购于美国Gibco 公司；1%青/链霉素，美国HyClone 公司；乙醇、二甲基亚砜（DMSO ）等化学试剂均为分析纯，天津康科德科技有限公司。
CD90＋和CD90－成纤维细胞亚群脂成纤维细胞转化的研究-论文
本课题为全国高校博士点基金资助（课题编号20050610064）通讯作者：罗清礼，Email:******************CD90＋和CD90－成纤维细胞亚群脂成纤维细胞转化的研究唐 莉 罗清礼 廖咏川 何为民四川大学华西医院眼科，四川成都（610041） Email:******************摘要 目的 依据培养的甲状腺相关性眼病患者眼眶成纤维细胞是否表达CD90分为两个亚群，分离这两个细胞亚群，将眼外肌来源的和眶脂肪/结缔组织来源的CD90+和CD90-的成纤维细胞分别诱导转化为脂肪细胞，观察比较它们各自的转化率，明确对脂肪形成起主要作用的成纤维细胞亚群。
方法 免疫磁分离法分离CD90+和CD90-的眼眶成纤维细胞，诱导CD90+和CD90-成纤维细胞亚群转化为脂肪细胞，分别于诱导后第5、10、15、20天油红O染色，计数染色阳性细胞，计算脂成纤维细胞的转化率。
结果 TAO病人眼外肌来源CD90＋成纤维细胞基本不能转化为脂成纤维细胞。
眼外肌来源的CD90-成纤维细胞、眼眶脂肪/结缔组织来源的CD90+成纤维细胞、眼眶脂肪/结缔组织来源的CD90-脂成纤维细胞转化率分别为： 10%、40%、72%。
结论 眼眶成纤维细胞具有解剖部位异质性，CD90+和CD90-成纤维细胞功能不同，具有分化为脂肪细胞功能的脂成纤维细胞主要是CD90-的眶脂肪/结缔组织成纤维细胞。
关键词 甲状腺相关性眼病；眼眶成纤维细胞亚群；脂成纤维细胞；中图分类号： R 777.501 文献标识码 AThe study of lipofibroblast differentiation of CD90 + andCD90 - orbital fibroblasts subsetsTang Li, Luo Qingli,Liao Yongchuan,He weimingDepartment of Ophthalmology,West China Hospital,Sichuan University, Chengdu,610041AbstractObjective To isolate CD90+ and CD90- subsets from orbital fibroblasts of patients withthyroid-associated ophthalmopathy ,and determine whether CD90 + and /or CD90 - fibroblasts can differentiate into lipocyte. Methods CD90+ and CD90- subsets were isolated from orbitalfibroblast by immunomagnetic separation ,and induced to transform into lipocyte. after induction, the cells were stained with oil red at the fifth 、tenth 、fifteenth 、twentieth day, and the stained positive cells were counted to measure the transformation efficiency of lipofibroblast. Results CD90+ fibroblast isolated from extraocular muscles with thyroid-associated ophthalmopathy did not have the ability of lipofibroblast differentiation .While CD90-fibroblast isolated fromextraocular muscles and CD90+ and CD90-fibroblast isolated from orbital connective tissue/fat can transform into lipofibroblas,their transformation efficiency were 10%、40% and 72%,respectively.Conclusion Orbital fibroblast have heterogeneity with respect to anatomic site. The function of CD90+ and CD90-fibroblast is different, the lipofibroblast that has an ability to differentiate towards lipocyte is main CD90-fibroblast of Orbital adipose/connective tissue. Keywords Thyroid associated ophthalmopathy; orbital fibroblasts subsets; Lipofibroblast;1. 引言甲状腺相关眼病（Thyroid associated ophthalmopathy, TAO）是眼科常见病，主要表现为眶周水肿、眼球突出、暴露性角膜炎、复视和压迫性视神经病变等临床改变，眼眶组织的病理研究证实病变主要累及眼外肌与眼眶脂肪/结缔组织，正是眼眶脂肪增多、眼外肌纤维化、亲水性细胞外基质的大量堆积导致了上述一系列的临床表现。
细胞同步化的方法和原理
细胞同步化的方法和原理细胞同步化是一种实验技术，用于使细胞在特定的时间点进入同一阶段，以便研究细胞周期中的特定过程。
细胞同步化有多种方法和原理，下面将详细介绍几种常用的细胞同步化方法。
1.药物处理法：药物可以通过抑制或促进细胞周期中的特定步骤来实现细胞同步化。
常用的细胞同步化药物包括阿霉素（thymidine）、奎宁（quinine）、羟基尿嘧啶（hydroxyurea）、科莫西定（colcemid）等。
这些药物可以通过不同的机制延长或缩短特定阶段的时间，从而使细胞同时进入同一阶段。
以阿霉素为例，它是一种嘌呤类物质，可抑制DNA合成过程。
将细胞在含有阿霉素的培养基中培养一段时间后，移除阿霉素，细胞会在短时间内同时进入S期。
这是因为细胞会在阿霉素的抑制下停滞在G1/S检查点，一旦移除阿霉素，细胞便立即进入S期完成DNA复制。
2.紫杉醇处理法：紫杉醇是一种微管相关的药物，可以抑制纺锤体的动态稳定，阻碍有丝分裂的进行。
在细胞同步化实验中，可以通过紫杉醇处理使细胞停滞在G2期，待紫杉醇去除后，细胞会几乎同时进入有丝分裂。
紫杉醇的作用机制是结合并稳定微管，抑制微管的动态重组过程，导致纺锤体无法形成或功能异常，从而阻碍有丝分裂过程的进行。
这种方法的优点是同步化效果好，适用范围广，但缺点是对细胞的影响较大，使用时需要谨慎操作。
3.温度敏感细胞株法：温度敏感细胞株是一种特殊的细胞系，其细胞周期的某个阶段对温度敏感。
通过调节培养温度，可以使细胞同时进入或阻碍特定阶段。
例如，一些温度敏感的蛋白质在非限制温度下正常工作，在限制温度下失去功能。
因此，将这些细胞株在限制温度下培养一段时间后，再将温度恢复到非限制温度，细胞便会同时进入同一阶段。
温度敏感细胞株同步化的原理是利用温度对特定蛋白质的影响，调控细胞周期的进程。
温度敏感蛋白质的功能通常与物种的生存和繁殖相关，因此这种方法适用于一些特定类型的细胞。
4.同步化电流冲击法：电流冲击法是一种通过施加短暂的电流刺激，使细胞进入特定阶段的方法。
植物细胞同步化的研究及应用进展
植物细胞同步化的研究及应用进展摘要：使植物组织细胞同步化的处于某个特定的时期，或进入同步性的生长，可以为深入研究植物细胞活动机制特别是和细胞周期相关的活动带来便利。
本文中重点介绍了适用于植物的人工同步化一般方法及原理及研究，植物全培养细胞同步化技术的方法流程及应用，以及国内外细胞同步化技术在细胞遗传、细胞生物学、植物分子生物、细胞工程等领域中研究应用的进展情况。
并对细胞同步化的不足和应用潜力作了探讨。
关键词：细胞同步化全培养同步化细胞同步化目前的定义(synchronization)是指生物组织细胞或培养物同时通过某个特定细胞时期，包含了获得同一阶段的细胞组织或培养物，或者细胞组织或培养物进入同步性生长两层含义[1]。
存在自然和人工同步化，自然发生的同步化多在一些低等生物菌类及某些动植物精母细胞减数分裂时期中发现，人工同步化是指利各种理化处理方法以获得处于某个特定阶段的细胞群或同步化生长的组织或细胞系[2]。
异步化的组织细胞由于在生理生化组成表达等方面的复杂性对一些研究不利，促使学者们开展人工同步化研究，在动物细胞培养物中实现了可同步于g1-m各期的同步化方法流程，成为一种细胞生物学研究手段或研究模型，应用在动物细胞生理生化等基础研究中；细胞同步化也应用于癌症的治疗中，如利用癌细胞处于不同时期对药物辐射等的敏感性不同提高癌症治疗效果，并开发出了相应的药物及治疗体系[3]。
植物细胞同步化首先应用在旺盛分裂的植物根尖上，由于是部分细胞同步化（partial synchronization），其应用也受到限制[4]。
随着植物细胞工程的发展，产生了植物细胞全培养同步化（whole-culture synchronization）技术，并被应用于诸如植物细胞周期等细胞学、生化分子、细胞工程等领域的研究中。
本文将就细胞同步化的基本方法、原理，在植物中的主要研究应用情况及进展做一定介绍。
并对植物细胞同步化研究中存在的问题和不足以及进一步的应用潜力做一讨论。
成纤维细胞活化蛋白的研究进展_刘维
·专题综述·成纤维细胞活化蛋白的研究进展①刘维刘美燕②吴沅皞（天津中医药大学第一附属医院风湿科，天津300193）中图分类号R392文献标志码A文章编号1000-484X （2015）06-0842-04①本文受国家自然科学基金面上项目（No.81273709）、教育部高等学校博士学科点专项科研基金（No.20131210110003）和天津市高等学校科技发展基金计划（No.20120220）资助。
②天津中医药大学，天津300193。
作者简介：刘维（1962年－）女，医学博士，教授，主任医师，博士生导师，风湿免疫科主任，主要从事风湿免疫病学研究，E-mail ：fengshiliuwei@163．com 。
近年来，越来越多的文献报道成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast activation protein ，FAP ）在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。
FAP 是肿瘤相关成纤维细胞（Tumor-associated fibroblast ，TAF ）的特异性标志物之一，具有特殊的生物学特性，基因组稳定，丰富、特异地表达于肿瘤间质，在促进肿瘤细胞的生长、侵袭、转移及免疫抑制中扮演重要角色。
近来研究发现，FAP 在类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis ，RA ）和骨关节炎（Osteoarthritis ，OA ）中与正常人群比较也有差异性高表达。
FAP 有望成为判断肿瘤预后的重要标志，同时成为个体化治疗肿瘤、类风湿关节炎等疾病的新靶标。
本文对FAP 在肿瘤临床诊断、提高患者生存率、判断疾病预后，及其与类风湿关节炎病理机制相关的研究进展做以综述。
1FAP 的研究概况1.1FAP 的主要生物学特性FAP 最初被认为是细胞表面抗原F19，是一种可被诱导产生的细胞表面糖蛋白，由761个氨基酸组成，二聚体分子量为170kD ，有两个97kD 的亚基，它最早是由Rettig 等［1］在1986年运用单克隆抗体（F19）在体外培养的活化成纤维细胞中发现的。
成纤维细胞激活在组织纤维化、自身免疫病和肿瘤中作用的研究进展
成纤维细胞激活在组织纤维化、自身免疫病和肿瘤中作用的研
究进展
顾馨;许宇佼;孙家锐;刘蕴瑶;强磊
【期刊名称】《中国药理学与毒理学杂志》
【年(卷),期】2024(38)3
【摘要】成纤维细胞广泛分布于全身组织和器官中,参与细胞外基质的合成和重塑,介导组织损伤修复、炎症反应和免疫调节等生理病理过程。
在组织纤维化、自身免疫病和肿瘤患者的病灶中均发现大量激活的成纤维细胞,其主要通过分泌胶原蛋白和纤维蛋白参与组织纤维化,影响肿瘤微环境,同时还分泌多种炎症因子和生长因子在自身免疫病和肿瘤中发挥免疫调节作用。
近年研究表明,调控成纤维细胞激活能够有效延缓上述疾病的发生发展,以成纤维细胞激活标志物为靶标能够监测相关疾病的发展和治疗进程。
因此,以成纤维细胞为靶点的治疗药物和诊疗手段有望在组织纤维化、自身免疫病和肿瘤等临床诊疗中实现新突破。
【总页数】12页(P200-211)
【作者】顾馨;许宇佼;孙家锐;刘蕴瑶;强磊
【作者单位】中国药科大学基础医学与临床药学学院
【正文语种】中文
【中图分类】R963
【相关文献】
1.肝纤维化中肌成纤维细胞的作用及TGF-β/Smads通路的研究进展
2.肿瘤相关成纤维细胞在肿瘤免疫抑制中的作用及其应用研究进展
3.转化生长因子β_1和碱性成纤维细胞生长因子在肾脏纤维化中的作用研究进展
4.肿瘤相关成纤维细胞对结直肠癌肿瘤微环境中免疫细胞调节作用的研究进展
5.组织或器官纤维化中成纤维细胞EphrinB2表达的研究进展
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细胞周期同步化概念
优点：同步化程度高，适用于任何培养体系。可将几乎所 有的细胞同步化。
缺点：产生非均衡生长，个别细胞体积增大。
2）中期阻断法（M期抑制法）：利用破坏微管的药物将细胞 阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒 性较少。 优点：无非均衡生长现象；缺点：可逆性较差。
细胞周期中各时期的特征
G1期：细胞表面有泡状物，染色质去凝集；蛋白质、糖 类、脂质等开始合成。
① 周期中细胞（cycling cell）：是指在细胞周期中连续运转 的细胞，有丝分裂活性高，又称为连续分裂细胞或可育细胞， 如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞、造血干细胞、雄性个体的 生精细胞等。 ② 静止期细胞（quiescent cell）：指的是暂时离开细胞周期， 停止细胞分裂，去执行一定的生物学功能，但在适当的刺 激下可重新进入细胞周期的细胞，又称为G0期细胞或休眠细胞， 如淋巴细胞、肝、肾细胞等。 ③ 终末分化细胞：指不可逆地脱离细胞周期，丧失分裂能力，
胞质分裂。
植物细胞成膜体的形成
细菌的细胞周期
慢生长细菌细胞周期过程与真核细胞周期过程有一定相
似之处。其DNA复制之前的准备时间与G1期类似。分裂之 胞周期也基本具备四个时期。
细菌在快速生长情况下，如何协调快速分裂和最基本的
DNA复制速度之间的矛盾？ 快速生长的细菌，在上一次细胞分裂结束时，细胞内的DNA 经复制到一半进程，以保证迅速进行下一次分裂。
流式细胞分选仪测定法(Flow Cytometry) 缩时摄像技术
标记有丝分裂百分数法（PLM)
原理：是一种常用的测定细胞周期时间的方法。其原理是对 测定细胞进行脉冲标记、不同时间取样做细胞放射性自显影， 找出正处于有丝分裂的分裂期细胞，计算其中带3H标记的细 胞占有丝分裂细胞的百分数。
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不同浓度秋水仙素和nocodazole对绒山羊成纤维细胞周期同步化的影响杨惠茹，肖红梅，蔡婷，俎红丽，于新蕾，刘志红，李金泉，王志新（内蒙古农业大学动物科学学院动物遗传育种与繁殖重点实验室，呼和浩特 010018 ）摘要：本文旨在探索更加优化的条件，使绒山羊成纤维细胞经处理后更多的处于有丝分裂G2/M 期。
本研究分别采用秋水仙素和nocodazole （诺考达唑）试剂对绒山羊成纤维细胞进行周期同步化处理，用流式细胞仪检测G2/M 期的细胞数量进行比对，观测最佳作用浓度。
结果表明，秋水仙素的使用浓度不宜过大；其次，添加秋水仙素时间的不同也会对试验结果产生明显的影响。
另外在相同条件下，经nocodazole处理的绒山羊成纤维细胞周期同步化效果比秋水仙素好，最优的处理条件是300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞24 h，所得G2/M期的细胞所占比例为15.10%。
结果提示对于绒山羊的成纤维细胞来说，细胞周期同步化处理时，选择nocodazole更好一些。
关键词：绒山羊；成纤维细胞；秋水仙素；nocodazole（诺考达唑）；细胞周期同步化；流式细胞仪Dolezel等（2011) 报道随着测序技术的发展，使用流式细胞仪分离单条染色体，将拓展测序技术应用的领域，对于山羊这种大基因组动物更有广泛的应用价值。
流式细胞术可以分选出指定的染色体，能快速精确地检测染色体数目和结构的畸变，以及非整倍体和染色体缺失。
目前已在l7个植物物种中利用流式细胞术对染色体进行分析与分选。
Macas等（1993）利用FCM对碗豆的流式核型进行分拣，结合PCR技术对其DNA进行物理定位，成功实现了USP基因、碗豆球蛋白基因和假基因在相应染色体区域上的定位。
施家琦等 (1998) 在人类的染色体分选研究中，通过采用流式细胞技术分离染色体实现对人二倍体成纤维细胞的单分散染色体核型的分析及分选。
最近的研究中，Yang等（2011) 通过流式技术分离出单个染色体已经完成了基因组的测序工作。
翟中和等（1992) 采用流式分离单条染色体工作的核心在于富集足量同步化的中期染色体的细胞核型，因此细胞同期化的处理是研究中最基础最为重要的一步。
细胞周期时间长短的主要差别在G1期，而S期、G2期和M 期的总时长相对恒定，尤其是M期持续的时间更为恒定，常常仅持续半小时左右。
通过添加有丝分裂抑制剂，来阻滞细胞的有丝分裂使其停滞在G2/M 期，人工调控增加G2/M期的细胞数量，为单条染色体分选做前期准备。
目前，秋水仙素是一种最为常用的有丝分裂抑制剂，起作用机理在于抑制中期纺锤体的形成。
nocodazole是一种类似于秋水仙素的细胞微管抑制剂,也可阻止微管蛋白聚合和纺锤体形成,使细胞同步于M期,从而使大部分细胞的发育停滞在G2/M期和M期，与秋水仙素试剂相比毒性较低。
Tanaka等（1995）研究表明采用nocodazole处理法对大鼠进行同期化处理后，M 期细胞的数量显著增加。
因此，本研究将采用这两种试剂对成纤维细胞同期化的最优化条件做探索。
1 材料和方法1.1材料1.1.1 试剂耗材和动物秋水仙素、nocodazole、胎牛血清（Hyclone）、，0.25%胰酶（Gibco）、DMEM/F12培养基（Hyclone）、无水乙醇（国产）、DPBS（Hyclone）、青链霉素（Gibco）、PI(碘化丙啶)、15 mL离心管（corning）、50 mL离心管（corning）、细胞培养瓶（corning）25 cm2、塑料吸管。
本研究选用绒山羊公羊耳源组织，来自于内蒙古鄂尔多斯农场。
1.1.2 主要仪器设备流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )、CO2恒温培养箱 ( Galaxy A，RXBiotech) 、超净工作台 ( ZHICHENG，XHJH-1112B)、倒置相差显微镜( NIKON BIOPHOT) 、离心机( Eppendorf Centrifuge 5415R) , 超纯水仪(Milli一Q)1.2 方法1.2.1 绒山羊成纤维细胞的培养选取一只健康的成年绒山羊公羊，用剪毛剪将公羊耳尖部的毛除净快速剪下耳尖约 1 cm2组织块，经过一系列处理后，将组织块均匀分布于25 cm2的培养瓶中，置于37 ℃ ,5%CO2的培养箱中贴壁培养，待细胞慢慢从组织中爬出且基本长满80%培养瓶后，进行传代培养。
1.2.2 同步化处理正常细胞作为对照组，用含0.07 ug/mL的秋水仙素对指数生长期的成纤维细胞作用4 h,12 h,16 h,18 h,24 h，用含0.15 ug/mL的秋水仙素作用18 h后收集细胞，分别观察其结果，用含100 ng/mL、300 ng/mL、1 ug/mL的nocodazole分别处理成纤维细胞18 h后，观察其结果，用含100 ng/mL、300 ng/mL、1 ug/mL的nocodazole分别处理成纤维细胞24 h后，观察其结果，最后上流式细胞仪检测。
1.2.3 流式细胞仪分析用含0.02% EDTA，0.25%的胰酶消化经同步化处理后的细胞，收集于15 mL离心管中，用PBS 洗涤2遍（1000rpm，5min）弃掉上清，先加入少量PBS混匀细胞，再加入95%乙醇或无水乙醇（-20 ℃预冷）到待测细胞悬液中，使其终浓度为70%乙醇，边加边在振荡器上震荡混匀（一滴一滴缓慢加入），混匀后直接放4 ℃冰箱过夜（细胞固定后最多可放15天），检测时再用PBS洗涤后，加PI染色，用流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )检测G0、G1、S、G2、M各期的细胞。
2. 结果2.1正常细胞G2/M期比例正常细胞对照组，第五代成纤维细胞经过72小时的培养，基本已经长满了整个培养瓶，汇合程度达90%以上，生长旺盛，形态正常结构完整呈长梭形（图 1 ）。
收集该细胞使用流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )检测，结果表明G2/M期所占比例为0.18%，细胞基本处于非生长期（图2 ）。
图 1 第五代成纤维细胞1 00倍镜下观察结果图 2 正常细胞G2/M期所占比例（备注：Dip G1为细胞G1期所占比例，Dip G2为细胞G2期所占比例，Dip S为细胞S期所占比例）2.2秋水仙碱不同作用时间下G2/M期所占比例采用0.07 ug/mL秋水仙素对指数生长期时成纤维细胞作用4、12、16、18和24 h后收集细胞，使用流式细胞仪检测，结果表明G2/M期所占比例分别为0.64%、4.63%、7.07%、10.88%和0.05%。
而0.07 ug/mL秋水仙素处理18 h，收集检测G2/M期所占比例最高为10.88%。
（图 3 ）图 3 秋水仙碱处理下G2/M期所占比例（备注：Dip G1为细胞G1期所占比例，Dip G2为细胞G2期所占比例，Dip S为细胞S期所占比例）2.3不同浓度nocodazole和不同处理时间下G2/M期所占比例采用100 ng/mL、300 ng/mL、1 ug/mL的nocodazole分别作用于指数生长期的成纤维细胞，18 h后收集，流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )检测，结果表明G2/M期所占比例分别为7.43%、14.34%、11.82%，而100 ng/mL、300 ng/mL、1 ug/mL的nocodazole分别处理成纤维细胞24 h后，G2/M期所占比例分别为9.23%、15.10%、12.10%。
而300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞18 h，收集检测G2/M期所占比例最高为14.34%。
（图 4 ），300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞24 h，收集检测G2/M期所占比例最高为15.10%。
（图 5 ）图 4 300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞18 h G2/M期所占比例（备注：Dip G1为细胞G1期所占比例，Dip G2为细胞G2期所占比例，Dip S为细胞S期所占比例）图 5 300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞24 h G2/M期所占比例（备注：Dip G1为细胞G1期所占比例，Dip G2为细胞G2期所占比例，Dip S为细胞S期所占比例）3. 讨论3.1正常培养的成纤维细胞未经任何处理72 h后检测G2/M期所占比例正常的成纤维细胞，未经过任何处理经过72小时的培养后镜下观察，细胞生长旺盛，已经长满整个培养瓶，结构完整且形态正常，说明细胞在72 h内已经进行多次有丝分裂。
且收集检测处于G2/M期的细胞所占比例仅为0.18%。
说明细胞已经过了指数生长期而处于平台期，基本不再分裂，增殖。
刘春霞等（2007) 通过基本方法培养细胞，可以使单层的细胞处于对数增殖期，轻微震荡，M 期细胞则易脱离器壁，悬浮于培养液中再继续培养、收集，则可获得一定数量的G2/M期细胞，赵雪萍等（2007) 通过这样的方法收集的细胞不受药物伤害且同步化程度高，缺点是获得的细胞数量较少。
3.2成纤维细胞经过不同浓度的秋水仙素的处理后检测G2/M期所占比例由于绒山羊的成纤维细胞生长时间较长，所以0.07ug/mL秋水仙素对指数生长期的成纤维细胞作用18h时，G2/M期所占比例为10.88%是最高的，而在相同的作用时间内，秋水仙素的浓度增高到0.15ug/mL，G2/M期所占比例为0.02%，秋水仙素的浓度增大，其毒性相对较大，细胞无法承受对其的作用而衰竭、死亡。
所以添加秋水仙素可以抑制（微管聚合）有丝分裂的形成，将细胞阻断在有丝分裂中期，但是，细胞没有分裂，添加秋水仙素是起不到分裂抑制作用的。
适当浓度的秋水仙素处理,可使培养细胞停顿于分裂中期；如处理过度会使染色体凝缩，秋水仙素的浓度过大也会阻碍其分裂增殖，甚至使得不能恢复正常的细胞周期进而衰竭死亡；低浓度的秋水仙素对细胞的毒性相对减少，作用时间延长，可以使秋水仙素在细胞分裂时对其产生抑制作用，使细胞停留在G2/M期。
3.3成纤维细胞经过不同浓度的nocodazole处理后检测G2/M期所占比例经过秋水仙素处理的细胞G2/M期的比例虽然明显增高，但是所得比例最高仅为10%，仍然没有达到制作染色体悬液所需要的比例，因此选用另外一种抑制动物细胞有丝分裂的抑制剂nocodazole来试图提高G2/M期所占比例。
Qian等（2010)报道nocodazole常被用于细胞增殖、分裂指数、抗肿瘤机制等方面的研究，其可以和微管中的β-tubulin结合，抑制有丝分裂时纺锤体的功能，并破坏高尔基体的结构，诱导细胞阻滞在G2/M期。