鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞制作方法
鸡胚成纤维细胞制作方法
试剂：无Ca2+、Mg2+的Hank’s液
0.25%胰酶
生长液----Hank’s液ml +0.5%水解乳蛋白ml +小牛血清10～15ml+庆大霉素1ml 材料：小烧杯×1、小烧瓶×1、注射器×1、镊子×2、剪刀×1、平皿×1、滴管数支、200目铜网×1、小漏斗×1、刻度尖底离心管×1
方法：
1、选取9～11日龄鸡胚1只，大头朝上，分别用碘酒、酒精消毒，用镊子破壳和壳膜，取出胚体，放入平皿中。
2、用无Ca2+、Mg2+的Hank’s液洗胚体2～3次。
3、弃去鸡胚的头、脚、翅及内脏，剪碎胚体并转入小烧瓶中。
4、用无Ca2+、Mg2+的Hank’s液振荡洗涤，静置片刻，待胚块沉淀后吸去上清，重复3次。
5、加无Ca2+、Mg2+的Hank’s液至终体积约4ml，加1ml 0.25%胰酶（终浓度0.625%），置37℃消化至胚块“起毛”（大组织块边缘似纤毛运动），约5分钟。
6、弃上清，加入含小牛血清的Hank’s液，用滴管反复吹打至见不到组织块。
7、用200目铜网过滤至刻度尖底离心管中，2000r/min×10min。
8、弃上清，加入少量生长液吹散细胞沉淀，按细胞压积（1：300）加生长液，分装入细胞培养瓶，置培养箱培养。
鸡胚成纤维细胞(CEF)的制作及细胞培养
鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。
2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。
3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。
（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。
（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。
（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。
（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。
（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。
（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。
DMSO一定要配成10%。
鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10－15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。
10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
鸡胚成纤维细胞制备实验
42生物技术世界BIOTECHWORLD细胞培养是病毒学研究的重要手段,是进行病毒性疾病诊断必不可少的工具。
泛地应用于病毒的分离、鉴定,人工感染的细胞培养物制成的弱毒疫苗和灭活疫苗以及筛选异源和同源的弱毒株都离不开细胞的培养工作。
[1]病毒能在易感的组织和单层细胞内增殖,并可产生细胞病变。
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞,由胚胎时期的间充质细胞分化而来。
鸡成纤维细胞具有相对容易获得、增值能力强、适应性强、良好的耐受性、性状较稳定等特点,所以被广泛的应于在病毒培养等领域。
鸡胚成纤维细胞培养可分为原代细胞培养、传代细胞培养。
原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程,自供体体内取出组织分散单个成单个细胞接种于培养液中为初次培养,从初次培养到第一次传代培养为原代细胞培养。
由组织刚刚分离出来的细胞能够分裂增殖,形成单层细胞。
[2]1 所需材料:鸡胚:9-10日龄SPF 鸡胚消化液:含0.25％胰蛋白酶(预先置于37℃温箱中);培养基:用DMEM培养基,含10%胎牛血清;洗液:pH7.2的PBS洗液;器具与物品:无菌剪刀、镊子、平皿、细胞培养瓶;带两层纱布的无菌烧杯,CO2培养箱、超净工作台、显微镜、高压灭菌锅、水浴箱、培养瓶、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉等。
2 操作[3]2.1 操作前的准备(1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
(2)用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
(3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
(4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。
(5)准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
2.2 成纤维细胞制备(1)取9-11日龄的鸡胚。
先用75%的酒精喷淋整个鸡胚,消毒后置于超净工作台内先后用碘酒和酒精对气室及周边进行擦拭消毒。
用无菌剪刀、镊子打开蛋皮,取出鸡胚,放入灭菌好的平皿中,去除鸡头、鸡翅、鸡爪、内脏。
实验报告——精选推荐
实验报告细胞培养实验写报告内容1⽬的2 原理3材料与⽅法（操作步骤）4实验结果5结论或结果分析实验⼀鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养实验⼆滤泡性⼝炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）实验三 Hep-2细胞的传代培养实验四 VSV TCID50滴定实验五⼲扰素活性（效价）的测定实验六 VSV中和试验（稀释⾎清固定病毒法）实验⼆鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养⼀、⽬的1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；2、掌握活细胞的显微镜下观察；3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断⽅法。
⼆、原理离体动物组织通过温和的⼿段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和⽓相环境，并给予充⾜合适的营养条件，能⽣存、⽣长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，⽐如肌⾁细胞的收缩功能；上⽪细胞的分泌功能等。
通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第⼀次进⾏传代之前的这⼀段时期称为原(初)代培养。
原代细胞最接近体内细胞的特性，因⽽对外界环境的变化也最敏感，因此⽐较适合病毒的增殖，药物的作⽤机制等的研究。
三、材料（按2⼈/组的量发放）四、操作步骤1、在DMEM和Hank’s 液中分别⽆菌操作以1％的量加⼊双抗，吸出10～15mlHank’s 液⾄⽆菌平⽫中备⽤；2、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚⽓室外卵壳；3、取出两只⽆菌平⽫，并标记①和②，待⽤。
4、⼤镊⼦轻敲卵壳顶部然后⼩⼼去掉⽓室外卵壳；5、消毒镊⼦后⼩⼼撕破卵膜，两⼈互相配合取出鸡胚置于盛有Hank’s 液的平⽫①中，⼩⼼去头、内脏、⽖和粘液及⾎球，洗涤后置于盛有Hank’s 液的平⽫②中，再充分洗涤；6、取出洗净的组织块置于⼤青霉素瓶中，在⽕焰附近⽤⽆菌眼科剪⼑将其剪成约0.5～1mm3的⼩块（约250次），此时体积约0.5ml；⽤Hank s’液洗涤两次。
7、按照10倍量加⼊0.25％胰蛋⽩酶，调节pH⾄约7.3～8.0（⾁眼观为⾁红⾊）盖上瓶塞，写好标记；8、将上述细胞瓶置于37℃⽔浴中，开始计时，约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化。
胚的培养实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握胚胎培养的基本原理和操作步骤。
2. 学习在体外条件下模拟胚胎发育过程，观察胚胎的形态变化和生长情况。
3. 探讨不同培养条件对胚胎发育的影响。
二、实验原理胚胎培养是指将受精卵或早期胚胎置于体外的人工培养系统中，模拟体内环境，使其继续发育和生长。
通过胚胎培养，可以研究胚胎发育的规律，筛选优良胚胎，以及进行胚胎基因编辑等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 受精卵或早期胚胎- 培养基：DMEM/F12、KSR、Hams F12- 胎牛血清（FBS）- 促性腺激素（如hCG）- 透明质酸酶- 胚胎培养皿- 显微镜- CO2培养箱- 移液器- 计时器2. 实验仪器：- 超净工作台- 恒温箱- 高压灭菌器- 电子天平四、实验步骤1. 准备培养基：- 将DMEM/F12、KSR、Hams F12培养基按照说明书比例配制，并加入胎牛血清（FBS）。
- 将培养基在无菌条件下过滤除菌，并分装于培养皿中，备用。
2. 胚胎处理：- 将受精卵或早期胚胎置于超净工作台中，用消毒后的移液器吸取一定量的透明质酸酶，轻轻涂抹在胚胎表面。
- 适当放置一段时间，使透明质酸酶作用于胚胎表面，使其分散成单个细胞。
3. 胚胎培养：- 将处理后的胚胎放入装有培养基的培养皿中，放入CO2培养箱中培养。
- 每天观察胚胎的生长情况，记录胚胎的形态变化和细胞分裂情况。
4. 不同培养条件实验：- 将胚胎分别置于不同浓度的胎牛血清（FBS）培养基中培养，观察胚胎的生长情况。
- 将胚胎置于不同温度、pH值、氧气浓度等条件下培养，观察胚胎的生长情况。
5. 结果记录与分析：- 记录不同培养条件下胚胎的形态变化、细胞分裂情况以及生长速度。
- 对实验结果进行统计分析，探讨不同培养条件对胚胎发育的影响。
五、实验结果1. 正常培养条件下：- 胚胎在正常培养条件下能够正常发育，细胞分裂速度较快，形态变化明显。
2. 不同胎牛血清（FBS）浓度条件下：- 随着胎牛血清（FBS）浓度的增加，胚胎的生长速度和细胞分裂速度逐渐加快。
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。
2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。
3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。
4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。
5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。
6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。
7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。
8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。
9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。
10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。
11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。
12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。
13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。
14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。
15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。
鸡胚的实验报告
一、实验目的1. 了解鸡胚培养的基本原理和操作步骤；2. 掌握鸡胚培养过程中细胞的分离、培养和传代技术；3. 观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
二、实验原理鸡胚培养是一种在体外培养鸡胚细胞的方法，主要用于研究细胞生物学、分子生物学和发育生物学等领域。
通过将鸡胚组织中的细胞分离出来，并在特定的培养条件下进行培养，可以观察到细胞的生长、形态和增殖情况，从而研究细胞的生物学特性。
三、实验材料1. 新鲜鸡蛋：选用新鲜鸡蛋，确保蛋壳完整，无破损；2. 实验器材：解剖刀、剪刀、镊子、解剖盘、培养皿、移液枪、培养箱、显微镜等；3. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶等；4. 其他：消毒剂、无菌操作台、无菌棉签等。
四、实验步骤1. 鸡胚的获取：将新鲜鸡蛋在37℃温水中浸泡10分钟，使蛋壳软化，然后用解剖刀在鸡蛋的一端切开，取出鸡胚。
2. 鸡胚的解剖：将鸡胚放在解剖盘上，用剪刀剪开卵黄囊，取出卵黄囊膜，用镊子取出鸡胚成纤维细胞。
3. 细胞的分离：将鸡胚成纤维细胞放入装有DMEM培养基的培养皿中，用胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后加入胎牛血清终止消化，然后用移液枪吹打细胞，使细胞分散。
4. 细胞的接种：将分散的细胞接种到培养皿中，放入培养箱中培养。
5. 细胞的观察：在显微镜下观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
6. 细胞的传代：待细胞生长到一定密度后，用胰蛋白酶消化细胞，将细胞分离成单个细胞，再进行接种。
五、实验结果1. 鸡胚成纤维细胞在培养过程中，呈扁平梭形，细胞质丰富，细胞核明显。
2. 随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，细胞密度逐渐增大。
3. 在显微镜下观察，细胞形态规则，生长旺盛。
4. 经过传代培养，细胞仍保持良好的生长状态。
六、实验讨论1. 鸡胚培养过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
2. 培养基的质量对细胞的生长和增殖有重要影响，需选用优质培养基。
3. 细胞传代次数过多，可能导致细胞生长缓慢、形态发生变化，影响实验结果。
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鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞培养
1、准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、
75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局:点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚:取9-10日龄鸡胚，(注:鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低)用新
洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污;如怀疑组织可能污染，可先
置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切:用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织:将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的
胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml(组织消化液以及胰酶的配置见微
生物指导)结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化:将其置入37?水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器
消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10,15分钟。
一般约12
分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间
太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离:在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水
解乳蛋白Hank，s液少许。
(制法见微生物试验实习指导)，用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的
组织块。
低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟，吸出上清(可以不离心吸掉上清)，
加入适量含有血清的培养液。
10、计数:用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培
养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，
说明液体变酸，可用NaHCO调整。
分装在细胞培养瓶中。
视细胞多少而定加入培养基。
3
培养基为0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液. 11、将其置入co2细胞培养箱中，37度。
瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
培养24小时进行观察。
一般在24,48小时可形成单
层细胞。
传代
1. 倾倒培养瓶内旧培养液。
2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。
3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。
4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。
注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。
5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。
6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。