心脏成纤维细胞原代细胞培养
原代小鼠心肌成纤维细胞提取
原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热3min，适当振荡；[循环1]5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
成纤维细胞原代培养
利用组织块可以成功地培养得到原代培养的人皮肤真皮成纤维细胞。
培养中应该注意以下事项：①一般皮肤主要取白手术过程中切除的部分组织，方法似外科取断层皮片手术操作，但组织一般2—3cm 即可，注意取材时不要用碘酒消毒．此外，不要切取太厚，要尽量去除皮下组织，如果皮下脂肪太厚会影响组织块的贴壁，不易于日后细胞的游出．②尽量去除表皮，如有表皮未被完全剔除，则可能造成表皮细胞竞争生长，最为常见的为角质形成细胞的污染，它可以和成纤维细胞共同生长．虽说在今后的传代培养时可通过细胞纯化方法适当去除，但这种混和生长状态会对后续实验产生影响．所以，一旦发现细胞污染，应立即停止实验，重新培养．③在剪切组织块时要注意保持组织块湿润，可向其表面滴加几滴培养液，要始终保持其成湿润状态，这一点要特别注意而且十分重要．剪切时要掌握好时间，尽量在短时间内完成．④组织块在最初贴壁时不是很牢固，所以开始加液不应太多，以刚刚浸没组织块为易，特别要注意，在最初几天时要减少移动培养瓶次数，避免过多晃动而造成组织块脱壁，最好在开始3 d内不换液．⑤文献报告成纤维细胞培养多在CO 培养箱内进行，培养箱内环境为CO 浓度50 ml／L，湿度95％，培养瓶为开放式．因其湿度，温度及氧气与人体内实际情况较为接近，所以适合成纤维细胞的成长．但开放式培养的同时也增加了细胞培养污染的机率，所以，可以根据自己实验室的条件选用合适的培养方法，如半开放式和充气后密闭瓶口，其效果也十分理想．但同时要密切观察培养液的pH变化，以保持适宜的酸碱度．⑥细胞培养失败的最常见原因是污染，其中以微生物污染最常见，污染一旦明确，多数将无法救治，应尽快弃之，以防止污染扩大，影响其他细胞．因此，应在各个阶段严格遵守无菌操作原则，把好每一关口，尽可能禁止其他污染的物品进入操作环节，以避免造成时间、人力、物力的浪费．。
原代细胞分离培养鉴定2(SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞)
原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞）目录 3 原代分离——SD 大鼠心肌细胞的分离4 原代分离——SD 大鼠心肌成纤维细胞的分离SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维的分离目的与意义（心肌细胞）心肌细胞体外培养可以为心肌细胞生理、药理及心血管相关研究提供有效、稳定的实验模型，在医学领域有着广泛的应用前景。
体外培养的心肌细胞可保存其形态结构和功能上的某些特点，同时去除了体内外各种限制因素的影响 , 具有精确和重复性好等优点, 可广泛用于心肌结构、病理生理、电生理、药理及毒理、受体及作用机制、心室肌细胞损伤模型及药物保护等的研究。
其次，大鼠动物模型广泛用于心血管系统疾病的基础研究。
目的与意义（心肌成纤维细胞）心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成。
非心肌细胞占细胞总数的 70%，其中 90%以上的非心肌细胞由心肌成纤维细胞组成。
近年来，人们逐渐了解到非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能，与风湿性心脏病、心肌炎、心肌肥厚、慢性心肌缺血、心肌梗死、炎症等病理状态均密切相关，因此 ,对心肌成纤维细胞的生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重点。
心脏 大鼠的心脏位于胸腔内，两侧隔心包与左、右肺紧邻，背侧有气管、支气管和食管。
腹侧借较宽的胸心包韧带和胸骨相连，腹前方与胸腺相贴，后面靠近膈。
C腹侧面B A心肌细胞根据组织学特点、电生理特性分为两类：工作细胞：普通心肌细胞：如心房肌细胞、心室肌细胞，无自律性，主要执行收缩功能；自律细胞：特殊分化的心肌细胞，组成心脏特殊传导系统，如窦房结细胞，收缩功能基本丧失；DESD Rat心脏HE染色F7心肌成纤维细胞 1、 心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts ，CFS)遍布于心肌组织，包绕心肌细胞并连接心肌细 胞间质。
CFS 参与细胞外基质的合成和沉积，与心脏发育、结构、细胞信号系统、物质代 谢等密切相关；它还可与心肌细胞、其它CFS 甚至内皮细胞之间相互接触，影响电机械功 能、细胞因子分泌和血管生成。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
人成纤维细胞的原代培养方法及步骤
人成纤维细胞的原代培养方法及步骤
材料准备
成纤维细胞
人成纤维细胞完全培养基
实验步骤
水浴锅37℃预热。
完全培养基温浴到37℃。
在15mL离心管中加入5mL以上完全培养基备用。
从-80℃冰箱中取出细胞，放入37℃水浴锅中，快速晃动，使冻存液迅速融化。
注意融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化迅速、均匀；且晃动时应避免水没过管盖造成污染；管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时，即停止水浴。
继续晃动冻存管，至冰晶融化。
用75%医用酒精擦拭冻存管外表面。
在超净台中打开冻存管，用巴氏吸管或移液枪吸取细胞冻存悬液，转移至先前准备的离心管中。
用1mL完全培养基洗涤冻存管1次，收集残留细胞，减少损失。
细胞悬液以250×g，离心4min。
离心后去除上清。
加入2mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。
将细胞接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中。
加入足量完全培养基，1个T25培养瓶中培养基总量不少于5 mL。
摇匀细胞，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中。
注意接种2h内不可移动、观察细胞。
这会严重影响细胞贴壁，造成状态不佳、细胞聚团、贴壁不均匀等情况。
复苏次日，观察细胞状态，并更换新鲜的完全培养基或传代。
之后，每2天更换一次完全培养基，直到细胞生长至90%汇合，即需传代。
通常用人成纤维细胞传代比例为1:3，72h内生长至可传代汇合度。
请根据细胞实际生长情况调整传代比例。
原代成纤维细胞培养基配方
原代成纤维细胞培养基配方1.引言1.1 概述成纤维细胞是一类常见的细胞，广泛存在于人体各个组织中，包括皮肤、血管、肌肉和内脏等。
在细胞培养技术的发展过程中，原代成纤维细胞培养基的配方变得越来越重要。
原代成纤维细胞培养基是一种提供养分和适宜环境的培养液，可以维持原代成纤维细胞的生长和增殖。
原代成纤维细胞培养基的配方包括多种关键成分，如培养基基础成分、生长因子、附加物等。
不同的组分可以提供细胞所需的营养和信号物质，使细胞能够在体外环境下继续生长和繁殖。
原代成纤维细胞培养基配方的研究对于细胞生物学、组织工程和再生医学等领域具有重要意义。
通过优化培养基的配方，可以提高原代成纤维细胞的增殖速度和存活率，同时改善其功能和特性，为细胞研究和临床应用提供更好的工具和基础。
然而，目前关于原代成纤维细胞培养基的配方研究还比较有限。
不同实验室和研究者之间存在着很大的差异，配方的选择和调整仍然依赖经验和试错。
因此，进一步的研究和探索仍然是十分必要和迫切的。
本文将深入探讨原代成纤维细胞培养基配方的概念和重要性。
我们将详细介绍培养基的组成、各种成分的作用机制，并总结现有研究的进展和局限性。
最后，我们将展望未来的研究方向，希望通过进一步的研究和探索，为原代成纤维细胞培养基的配方优化和应用提供更好的指导和支持。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括以下内容：文章结构部分的主要目的是为读者提供对整篇文章的摘要和框架。
通过描述文章的组织结构，读者可以更好地理解文章的内容和逻辑顺序。
首先，本文将介绍原代成纤维细胞培养基的概念和重要性。
这一部分将讨论成纤维细胞在生物医学和生命科学研究中的重要作用，以及为什么培养基对于细胞培养的成功和细胞功能的研究是至关重要的。
其次，本文将详细介绍原代成纤维细胞培养基的组成。
这一部分将讨论培养基中各种组分的作用和功能，如营养物质、生长因子、酶和血清的添加等。
读者将了解到培养基中各种组分的重要性和对细胞生长和功能的影响。
原代培养中成纤维细胞的抑制
尽量除去杂质细胞：现在一般的做法是：将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶中培养1~2小时，然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞，再接种到6孔或24孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速，而心肌通常在4h后才开始贴壁，这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。
（2）机械划除法
原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。
（3）反复贴壁法
成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。
方法：
1.取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠,大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死，将处死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔，分离胸主动脉,用2ｍｌ注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入D-Hank’s液,驱除残血,取主动脉弓至肾动脉一段，两端结扎剪断，放入60℃预热无菌水中2秒。然后置于准备好的RPMi1640培养基（含双抗）中。
【wangtsy】胰岛的分离与纯化
取新生1-3天SD大鼠10-15只，无菌条件下剖腹取出胰腺置入无菌培养皿中，用眼科剪去除非胰腺组织，4℃Hanks液清洗三次后，用眼科剪反复剪切至<0.5mm3组织块，取浓度为1g/L的V型胶原酶溶液5-10ml与之混合,转入三角烧瓶中，于37℃恒温水浴振荡器消化30-40min，加入两倍体积4℃Hanks液终止消化，用吸管反复吹吸后过80目筛网，滤液以800rpm低速离心70s去上清液，并用4℃Hank's液低速离心清洗2次，除去单个腺泡及上皮细胞。加入含2.5mg/L碘乙酸的PRMI1640完全培养基（含10%胎牛血清、10mmol/L HEPES缓冲液、1mmol/L丙酮酸钠、100000u/L青霉素G钾、100mg/L链霉素、71.5umol/L β-巯基乙醇）中制成细胞悬液,接种于75ml玻璃培养瓶中,于37℃,5%CO2,95%空气条件下培养5h后，用无血清培养基低速离心清洗3次,以除去成纤维细胞。然后用正常完全培养基培养24h，转瓶弃去贴壁细胞，用无血清培养液低速离心洗涤两次，沉淀物即为纯化胰岛。再用PRMI1640完全培养基养吧，可长成胰岛单层细胞。
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乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养
一、实验动物
1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。
二、试剂及配制
高糖DMEM(gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。
培养液:DMEM培养基：FBS：双抗100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）
酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH7.2 ～7.4)稀释,配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ
型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH7.2～7.4) 中,配成0.1%的胶原酶消化液。
0.1%胰蛋白酶及
01%Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。
三、实验仪器
超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机⋯⋯
四、组织消化和分离细胞
1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。
用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。
2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。
用眼科虹膜剪在剑
突处正中线
稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部 , 取
出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。
3、将鼠心脏全部取出后 , 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清
洗3次, 去除血污。
4、将心脏剪成约1mm×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪
刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。
5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍,37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器 ,60r/min 搅拌
10min, 吸管轻轻吹打组织块 1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。
6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。
五、培养细胞
1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后,1200r/min离心4min, 弃上清,
细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。
2、剩余组织块重复上述过程若干次, 直到组织块消失 , 分次收获细胞。
3、将分次收获的细胞悬液集中离心 1次, 将所有细胞沉淀集中于一个离心管加适量培养液再
离心1次。
4、弃上清液加10ml接种培养液吹打几次以散开所有的细胞团接种于培养瓶
中
, 在5%CO2、
95%空气、37 ℃培养箱中放
置
1.5h。
（1h）
5、用预温
至
37℃的接种培养液轻轻洗刷培养瓶后收集培养液。
6、留下的贴壁细胞(主要含心肌成纤维细
胞
)加入含胎牛血清的培养
液
10ml继续培
养
, 未贴
壁的细胞混悬液分瓶后在同样条件下再
培养
1.5h(60min), 再收集贴壁细胞。
根据心肌细胞和心肌成纤维细胞贴壁时间的不同, 成纤维细胞贴壁速度较快, 先附于瓶底。
这样采用
反复差速贴壁1h,获得成纤维细胞。
7、每2天换液1次。
培养的心肌成纤维细
胞2～3 天约80%～90%细胞融合,用0.25%胰蛋
白酶消化液按1×105/ml细胞密度接种传代培养
(约
1∶3) 。
（培养心肌成纤维细胞2~3d
至80%~90%细胞融合,用0.15%胰蛋白酶消化传代(1：3) 。
第2~4代细胞用于实验。
）
六、细胞质量评价
台盼蓝染色、光学显微镜观察。
（详见文献）
倒置显微镜下观察, 心肌成纤维细胞生长迅
速
,2~3d 即呈融合状
态
, 细胞排列紧
密
,
有的交叉重叠生长, 与心肌细胞不
同
, 心肌成纤维细胞呈梭
形
, 胞体较
大
, 细胞浆透
明
,
细胞核较大, 呈椭圆
形
, 通常
含
2~3 个核, 无自发性搏动。
参考文献：
1、张乃菊，陈天平，祝晓光.乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养[J]. 蚌埠医学院学报,2010，35（6）：558-561.
2，陈勇兵, 陈如坤, 陈力, 等.乳鼠心肌成纤维细胞培养方法的改进[Ｊ].江苏医药,2005, 31(3):189-190.。