细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养
㈠、概述
整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。
小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。
㈡、[试剂]
1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。
2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。
3、D-Hanks溶液（pH7.2-7.8）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4？7H2O0.09g，酚红0.01g1L
㈢、[实验步骤]
1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取
出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化
5min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min 振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。
（为节约时间，以下步骤省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中（37℃5%CO2）培养。
小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养
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病理 、 药理 等方 面 已开 展 了 多项 基 础 研 究 。其 中体 外 培养 的心 肌细 胞 可保 持 结 构 及 功 能 上 的某 些 特
原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定
原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定＊程阔菊，黄河，杜智勇，李洪，杨天德△【摘要】目的建立原代乳小鼠心肌细胞的培养方法，评价心肌细胞的存活状况并鉴定心肌细胞纯度。
方法应用胰酶联合胶原酶共同消化3d内C57乳小鼠心脏，台盼蓝染色判断心肌细胞存活率，α－actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度。
结果利用3d内乳鼠心脏可成功培养原代小鼠心肌细胞，台盼蓝染色显示细胞存活率大于95%，α－actin免疫荧光染色显示心肌细胞纯度达95%以上。
结论严格控制实验条件，可成功培养高存活率和高纯度的小鼠心肌细胞。
【期刊名称】重庆医学【年(卷),期】2013(000)022【总页数】3【关键词】乳小鼠；心肌细胞；分离；纯化；培养；鉴定各种基因敲除及转基因小鼠已广泛应用于心血管疾病动物模型的建立，已为心血管疾病机制的研究作出了巨大贡献。
体外心肌细胞培养作为一种体外实验研究模型，可以排除神经、体液的干扰而独立地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发生、发展机制，但由于小鼠心肌细胞的分离和培养比较困难，所以一直限制了医学科研工作者在细胞生物学水平上对心血管疾病方面的深入研究。
本实验室在以往的经验基础上，摸索出了一套成熟可行、简单可靠的小鼠心肌细胞培养方法，获得的心肌细胞存活率高且纯度高。
本文对此培养方法做一简单介绍，并对其中的关键影响因素做详细的探讨。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物1～3d龄野生型C57新生乳鼠，SPF级，由第三军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（渝）2007－0003。
1.1.2 主要仪器与试剂显微眼用镊、眼科剪、显微镊、显微剪（上海医疗器械有限公司），器械使用前清洗干净并经高压灭菌（121℃，20min）。
二氧化碳培养箱、倒置显微镜（OLYMPUS）、超净工作台（苏净安泰）、低温台式离心机（Sigma）。
小牛血清、DMEM／F12、胰酶、胶原酶Ⅱ（GIBCO），BrdU－溴脱氧尿苷（Sigma），青霉素、链霉素（华美生物工程公司），anti－α－actinin（Millipore），组织固定液（Alphelys），Triton X－100（Amresco），SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（Invitrogen），Alexa goat anti－mouse IgG（H＋L）（Invitrogen）。
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法原代培养是指直接从体内取下的细胞、组织和器官，经过清洗、剪切、分散等步骤后，立即进行培养的过程。
小鼠细胞原代培养取材方法主要包括以下步骤：1. 实验前准备：在超净工作台或生物安全柜中进行，确保无菌环境。
2. 取材：选择健康的成年小鼠，使用颈椎脱臼法处死小鼠。
用70-75%酒精对烧杯进行消毒，将整个小鼠浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟进行消毒。
3. 打开腹腔：取出小鼠，将其放在不锈钢手术盘中，用无菌手术剪打开腹腔。
4. 取出组织：小心将所需组织从体内取出，放入无菌培养皿中。
5. 清洗组织：用70-75%酒精擦拭培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗的Hanks液洗涤组织数遍以去除血污。
6. 剪切组织：在体视显微镜下操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊子或眼科剪将组织剪碎至1立方毫米的肉糜状。
7. 消化组织：将剪碎的组织放入含解离液或培养基的50ml离心管中，用10ml弯头滴管对组织进行吹打5-10次，然后用1ml枪头的吹打组织，最后用200μl的尖端进行吹打。
8. 过滤分散：将上述组织悬液通过70μm过滤器过滤，切碎和分散的组织悬浮液。
9. 离心收集细胞：在1200rpm、4℃下离心10分钟，弃掉上清液，加入配置好的细胞培养基重悬细胞。
10. 接种细胞：将细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。
注意事项：取材过程应在无菌环境中进行，确保整个过程不受到污染。
操作时要小心，避免损伤组织。
使用的仪器和器皿均应进行消毒处理。
培养基和试剂应选择适宜的种类和浓度。
培养条件要保持恒定，包括温度、湿度、CO2浓度等。
在实验过程中要密切观察细胞生长情况，及时发现和处理异常情况。
以上是小鼠细胞原代培养取材方法的简要步骤，具体操作可能因实验需求和条件而有所不同。
建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并咨询专业人士的建议和指导。
乳鼠原代心肌细胞培养方法
乳鼠原代心肌细胞培养方法
实验动物
出生1~3天的健康乳鼠（Wistar），雌雄不分。
药品与试剂
DMEM/F12基础培基，Brdu ，胰蛋白酶（1:250），Ⅱ型胶原酶（sigma)，胎牛血清（hyclone），双抗（青霉素-链霉素）
原代心肌细胞培养
1．出生后1~3天的乳鼠，雌雄不分。
将乳鼠在75%乙醇中浸泡5秒左右，于无菌条件下取出心脏，置于平皿中，用PBS溶液反复洗涤3次，并除去大血管及脂肪组织，眼科剪剪碎至约1mm3。
2．用0.1%的Ⅱ型胶原酶和0.06%的胰蛋白酶在37℃恒温摇床中震荡消化5~7次，每次5min。
收集除第一次之外各次所得的消化液，并及时加入到含10%胎牛血清的DMEM培养液中终止消化。
（第一次的消化液中含较多血细胞，故弃去，也可视清洗的情况而定）
3．终止后的消化液用200目筛过滤去除未消化组织块，1000rpm离心10min 收集细胞。
4．离心后弃上清，用全培基将细胞沉淀充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，接种于培养瓶中，CO2培养箱差速贴壁1.5小时。
5．收集未贴壁的细胞悬液，重新接种于培养瓶中，前3天加用0.1 mmol/L Brdu抑制非心肌细胞的生长。
6．培养2~3天，待贴壁心肌细胞连成片状同步搏动后，消化接种于不同的培养板中，供进一步实验用。
细胞工程实验三：乳鼠心肌细胞的原代培养-治
将细胞混悬液1 000 r/min离心10 min
去上层，收获细胞
实战程序 第四大步骤：清洗细胞，培养细胞
细胞沉淀用PBS溶液和DMEM清洗3次 弃上清液 加4ml含20%小牛血清的DMEM培养液制 成细胞悬液，置于培养瓶中 培养24 h后即可见细胞贴壁和细胞收缩
【注意事项】
组织块必须漂洗 2~3 次以除去组织的钙离 子、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑 制作用。 胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免 毒性产生，而且动作要轻，以避免蓬松的细 胞随漂洗而失去。
【实验结果与分析】
记录心肌细胞的培养及动态观察。
实验三 动物细胞的原代培养
【实验目的】
掌握实体组织材料的原代细胞培养的 基本思路。 掌握动物组织中细胞的分离和原代培 养的方法。
【实验原理】（参考教材P128）
原代细胞培养是从供体取得组织细胞在体外
进行的首次培养
是一项基本技术
是建立细胞系的第一步
【实验原理】
原代细胞的分离和制作常采用的方法
用镊子小心剥离心包膜
剪去心房（心脏上半部分）及主动脉
PBS溶液清洗心室组织3次（至没有血时）
将心室组织剪成1~3 mm3碎块后，转移至
离心管
用PBS清洗3遍
实战程序 第三大步骤：消化组织，获得细胞
加0.125%胰蛋白酶（2ml）
37℃水浴中旋摇消化10 min 吸上层（细胞在悬液中，未消化好的组织块在底层） 细胞悬液转至小烧杯 加等体积无血清培养基终止反应，反复3-5次
【实验材料与器材】
本实验用品
每组1个：乳鼠、解剖器械、小烧杯、细胞 培养瓶、移液枪（1ml）及枪头 每组2个：离心管、培养皿
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
小鼠细胞实验培养步骤
小鼠细胞试验培养步骤小鼠细胞常用的分别方法有两种，一种是贴块法，一种是消化法，这两种方法都可以用于分别和培养原代细胞。
一、试验分别和培养步骤1. 小鼠颈椎脱臼处以死刑后，剃除腹胸部的被毛，放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。
2. 取出小鼠，在无菌环境下打开胸腔，取出心脏组织，注入盛有无菌1×PBS的培养皿中，洗净组织表面的血液。
3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞，浸泡完成后赶忙转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。
4. 清洗完成后，用剪刀镊子搭配除掉自动脉弓和心房组织，仅保管心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。
5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块，之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。
A. 贴块法6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织，室温消化3—5 min。
7. 消化完成后，添加数毫升FBS停止消化，之后吸弃液体，加PBS清洗组织块1伺次后，用200 ul吸头将组织块平均接种于T—25培养瓶的培养面上，之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中，静置2—4h。
8. 待组织处于略微脱水的状态时，小心添加2ml培养基，添加时注意尽量不要将组织块冲起，要使培养基接触全部的组织块。
9. 之后放入培养箱中连续培养，一般2—4天后成纤维细胞会从组织块四周爬出，待爬出的细胞有较多数量时，可将细胞消化下来，去除组织块，转入另一培养瓶中培养。
B. 消化法6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上层混悬液弃去。
7. 余下组织加入混合消化液10 ml，37℃水浴震荡消化10 min；吸取上层悬液至另一离心管中，加入适量FBS停止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3—5次，直至组织块消化。
乳鼠心肌细胞的培养ppt课件
实 验 目 的 意 义 实 验 材 料
实 验 方 法
操作步骤及人员落实 预 期 结 果
目的：掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培 养过程中的无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的 观察方法。 意义：原代培养是指直接从机体取出细胞、组织 和器官后立即置于培养基中培养，使细胞得以生 存、生长和繁殖。原代培养细胞离体时间短，细 胞保持体内原有的基本性质，适用于研究。 一般说来，幼稚状态的组织和细胞（如动物的胚 胎、幼仔的脏器）等更容易进行原代培养。
•消 化 组 织
•培 养 细 胞
前 期 准 备
1. 将备用物品（手术 器械、培养皿、烧 杯、离心管等）进 行高压灭菌； 2. 用酒精擦拭层流台， 将高压灭菌后的物 品放入层流台，紫 外线消毒30分钟。
用镊子夹住小鼠尾巴将小 鼠在酒精中浸泡两次，约 2~3秒； 2. 用剪刀将小鼠头部剪去； 3. 将动物固取材器官范围的 被毛，定在解剖板上并将 胸部剪开暴露出心脏，用 另一个剪刀将小鼠心脏剪 下； 4. 放入装有预冷的Hanks液的 培养皿中，将心脏剪开,剪 碎组织至1mm³左右，清洗 残留的血液。
1.
1. 将心肌组织转移至另一个装有预冷的Hanks液的培 养皿中进一步剪碎心脏后，加入等体积的0.125％ 胰酶； 2. 将心肌组织转移至离心管中，用吸管反复吹打（使 消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来）10min, 静置2min后，弃上清； 3. 再次加入Hanks液和等体积的0.125％胰酶，常温下 用吸管反复吹打10min，静置2min后将上层液转移 至100ml容器中，加入含10%小牛血清的1640培养 基终止消化； 4. 重复上一步骤至组织完全消化，适当控制消化时间。
仪器：培养箱（调整至37℃）、培养瓶、
小鼠心肌细胞的原代培养注意事项
小鼠心肌细胞的原代培养注意事项
一、实验前准备
1.1 材料准备
1.2 设备准备
1.3 环境要求
二、小鼠心肌细胞的原代培养操作步骤
2.1 小鼠心肌细胞的分离和培养基的配制
2.2 小鼠心肌细胞的原代培养
三、培养基的更换和维护
3.1 培养基的更换
3.2 细胞状态观察和维护
四、实验中常见问题及解决方法
4.1 细胞污染问题及解决方法
4.2 细胞生长不良问题及解决方法
4.3 细胞死亡问题及解决方法
五、实验安全注意事项
5.1 实验室安全措施要求
5.2 实验过程中个人防护措施要求
六、实验结果的分析和记录方式
6.1 实验结果的观察和记录方式
6.2 数据处理和结果分析方法
七、实验结束后处理方式
7.1 培养皿、试管等废弃物处理方式要求7.2 试剂废弃物处理方式要求。
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。
2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。
3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。
4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。
5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。
封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。
第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。
之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。
放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。
这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。
（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。
5只鼠铺一个培养瓶。
4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。
心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。
注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。