原代新生大鼠心肌细胞的分离与培养
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的细胞类型，对于心脏生理学和病理学研究具有重要意义。
在研究心脏疾病发生发展机制、药物筛选及分子生物学研究中，大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是必不可少的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）动物：健康的大鼠（2）工具：手术刀、剪刀、镊子、针头、离心管、培养皿等（3）试剂：PBS、Hanks液、COLLAGENASE、TRYPSIN、DNA酶I2. 心肌细胞的分离（1）准备心肌组织：选取健康的大鼠，进行心肌组织的分离。
将动物取出心脏，迅速放入含有PBS的离心管中，冷藏备用。
（2）组织的机械分离：将心脏取出后进行机械分离，去掉多余的结缔组织等。
（3）酶消化：将组织加入COLLAGENASE、TRYPSIN等酶进行消化，使细胞释放。
（4）滤网过筛：将酶消化后的组织经过滤网过筛，得到心肌细胞的悬液。
（5）细胞纯化：使用密度梯度离心法或其他方法对心肌细胞悬液进行纯化，得到较纯的心肌细胞。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 形态学鉴定（1）显微镜观察：将得到的心肌细胞悬液放入培养皿中，通过显微镜观察心肌细胞的形态。
（2）心肌细胞的特征：心肌细胞具有两个或多个横纹和中央的单核的细胞核，且具有特殊的形状和排列方式。
2. 免疫细胞化学鉴定（1）选取适当的心肌细胞标记物：如肌球蛋白、酸性肌球蛋白等（2）进行免疫细胞化学染色：使用特异性抗体对心肌细胞进行染色，观察标记物的表达情况。
（3）通过显微镜观察：观察心肌细胞的染色情况，以确定其特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）培养基配方：DMEM/F12培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素+适量营养因子（2）pH值调节：将配制好的培养基进行pH值调节至7.42. 大鼠心肌细胞的培养（1）培养皿涂层：将培养皿内涂覆明胶或胶原等基质蛋白，有利于细胞的附着生长。
原代细胞分离培养鉴定2(SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞)
原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞）目录 3 原代分离——SD 大鼠心肌细胞的分离4 原代分离——SD 大鼠心肌成纤维细胞的分离SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维的分离目的与意义（心肌细胞）心肌细胞体外培养可以为心肌细胞生理、药理及心血管相关研究提供有效、稳定的实验模型，在医学领域有着广泛的应用前景。
体外培养的心肌细胞可保存其形态结构和功能上的某些特点，同时去除了体内外各种限制因素的影响 , 具有精确和重复性好等优点, 可广泛用于心肌结构、病理生理、电生理、药理及毒理、受体及作用机制、心室肌细胞损伤模型及药物保护等的研究。
其次，大鼠动物模型广泛用于心血管系统疾病的基础研究。
目的与意义（心肌成纤维细胞）心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成。
非心肌细胞占细胞总数的 70%，其中 90%以上的非心肌细胞由心肌成纤维细胞组成。
近年来，人们逐渐了解到非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能，与风湿性心脏病、心肌炎、心肌肥厚、慢性心肌缺血、心肌梗死、炎症等病理状态均密切相关，因此 ,对心肌成纤维细胞的生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重点。
心脏 大鼠的心脏位于胸腔内，两侧隔心包与左、右肺紧邻，背侧有气管、支气管和食管。
腹侧借较宽的胸心包韧带和胸骨相连，腹前方与胸腺相贴，后面靠近膈。
C腹侧面B A心肌细胞根据组织学特点、电生理特性分为两类：工作细胞：普通心肌细胞：如心房肌细胞、心室肌细胞，无自律性，主要执行收缩功能；自律细胞：特殊分化的心肌细胞，组成心脏特殊传导系统，如窦房结细胞，收缩功能基本丧失；DESD Rat心脏HE染色F7心肌成纤维细胞 1、 心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts ，CFS)遍布于心肌组织，包绕心肌细胞并连接心肌细 胞间质。
CFS 参与细胞外基质的合成和沉积，与心脏发育、结构、细胞信号系统、物质代 谢等密切相关；它还可与心肌细胞、其它CFS 甚至内皮细胞之间相互接触，影响电机械功 能、细胞因子分泌和血管生成。
新生SD大鼠心肌细胞的原代分离和培养
模型。
１ 实 验 材 料 １．１ 实 验 动 物 。出 生７２ｈ内 的 ＳＤ 大 鼠 ，购 自 南 通 大 学 实 验 动 物 中 心 。 １．２ 主 要 试 剂 。Ｌ－ＤＭＥＭ、Ｂｒｄｕ、胰 蛋 白 酶 、胶 原 酶 Ⅰ 、胎 牛 血 清 。
２ 实 验 方 法 ２．１ 心 肌 细 胞 的 分 离 培 养 。取 出 生７２ｈ内 的 ＳＤ 大鼠 ，７５％ 酒 精 浸 泡 消 毒 ，颈 椎 脱 臼 致 死 ，于 超 净 工 作 台 内 快 速 打 开 乳 鼠 胸 腔 取 出 心 脏 ，置 于
体 外 培 养 的 原 代 心 肌 细 胞 具 有 良 好 的 节 律 性 和 收 缩 性 ，且 不 受 体 液 、神 经 等 体 内 多 种 复 杂 因 素 的 影 响 ，被 广 泛 应 用 于 心 血 管 疾 病 的 发 病
机 理 以 及 药 物 治 疗 机 制 的 研 究 。 ［１，２］ 但 心 肌 细 胞 再 生 能 力 差 ，不 能 传 代 ，
且 易 受 其 他 非 心 肌 细 胞 的 污 染 。到 目 前 为 止 ，心 肌 细 胞 的 体 外 培 养 技 术
仍 存 在 一 定 的 缺 陷 ，限 制 了 各 种 体 外 心 肌 实 验 模 型 的 理 想 建 立 。 本 实 验
采用 胰 蛋 白 酶 和 胶 原 酶 Ⅰ 联 合 消 化 的 方 法 ，获 得 了 具 有 较 高 存 活 率 和 搏 动性 研 究 提 供 可 靠 的 实 验
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健 康 之 路 ２０１６ 年 ９ 月 第 １５ 卷 第 ９ 期 Ｈｅａｌｔｈ ｗａｙ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１６ Ｖｏｌｕｍｅ １５ Ｎｏ．９
新生 ＳＤ 大鼠心肌细胞的原代分离和培养
胡 君 熊存全 周红成 吴争鸣
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞是心肌细胞的主要来源之一，在心脏疾病的研究中具有非常重要的作用。
为了开展相关研究，需要对大鼠心肌细胞进行分离鉴定以及培养，以下是一份详细的操作
步骤。
1. 器材准备
（1）无菌试剂：试剂瓶/管、离心管、移液器、细胞培养基等。
（2）消毒器材：无菌吸管、离心机、高压灭菌器、悬浮液制备仪等。
（3）实验器材：显微镜、培养箱、细胞计数板、细胞离心机等。
2. 心肌细胞的分离
（1）准备新鲜的大鼠心脏组织。
（2）将心脏组织放入离心管中，加入PBS洗涤1-2次。
（3）将心脏组织切成小块，加入预先调配好的组织消化液（如DMEM/F12加入胰蛋白酶），37℃放入恒温水浴中消化2-3次。
（4）将消化的样本离心，去除上清液，加入预备的培养基，悬浮细胞。
（5）进行筛选，并将心肌细胞分离，最终得到心肌细胞。
（1）将分离好的心肌细胞放置在显微镜下观察其形态。
（2）进行免疫荧光染色，使用特定的心肌细胞抗体进行染色，观察细胞核及膜表达，判断其是否为心肌细胞。
（1）将鉴定好的心肌细胞放入预备好的细胞培养基中。
（2）放置于37℃恒温培养箱中，维持培养基液位。
（3）每2-3天更换一次新的培养基。
以上就是大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养的操作步骤，具体操作时应注意操作规范
和实验安全，保证实验结果的准确性和可靠性。
新生大鼠心肌细胞原代培养方法
（ ． ０ ９ Ｍ ｓ ｒ ｄ ｇｅ ａ ｄｄ ｔ ｏ Ｔａ ｊ ｎｖ ｒ ｔ ｏ Ｔ ａ ｉｏ ａ Ｃ ｉｅｅＭｅ ｉ ｎ ，ｉｎｉ ３ ０ ９ ： ． １ ２ ０ ａ ｔ — ｅｒｅＣ ｎ ｉａ ｆ ｉ ｉ Ｕ ｉｅｓ ｙ ｆ ｒｄｔ ｎ ｌ ｈ ｓ ｄ ｉｅ Ｔ ａ ｊ ０ １ ３ ２ ｅ ｅ ｎｎ ｉ ｉ ｎ ｃ ｎ
原 代 心 肌 细 胞 培 养 技 术 被 广 泛 应 用 于 心 血 管 疾病 的研 究 之 中 ， 有 操 作 简 便 、 济 、 重 复 性 等 具 经 可
拘 。由天 津市 山川 红 实 验 动 物科 技 有 限 公 司 提供 ， 动物合 格证 号 ：０ ４ ３ 。 ０ ０ ０ ６
优点 ， 同时排 除 了神 经 、 液 等 因素 的干 扰 ， 可 从 体 并
Ｔａ ｉ ｉｅｓｔ ｆ ｒｄｔ ｎ ｌＣ ｉｅｅ Ｍｅ ｉｉｅ Ｔ ａ ｉ ０ １ ３） ｉｎｉ Ｕｎｖ ｒｉ ｏ ａ ｉｏ ａ ｈｎ ｓ ｄｃｎ ， ｉｎｉ ３ ０ ９ ｎ ｙ Ｔ ｉ ｎ
【 ｓ ａｔ ０ｂｅｔ ｅ ｏｅｐｏｅｔｅｍ ｔｏｓ ｆｈ ｒ ａｙｃｌ ｒ ｏ ａ ｉ ｙ ｓｆ ｅｓｃ ｉｇ Ａｂｔ ｃ】 ｒ ｊｃｉ Ｔ ｘｌｒ ｈ ｅ ｄ ｅｐ ｍ ｒ ｕｔ ｅ ｆ ｒ ｏ ｔ ０ ｔ ｕ ｋ ｖ ｈ ｏｔ ｉ ｕ ｃ ｄ ｃ ｅ ｒｈ ｎ
二、 实验 方法
１ 实 验动 物 ： ｄ内的 Ｗｉ ａ 新 生 大 鼠 ， 雄 不 ． ３ ｓｒ ｔ 雌
基 金 项 目 ： 家 自然 基 金 资助 项 目（ ｏ ８０ ２ ６ ） 国 Ｎ ． １７ ９ ５
作者单位 ：． １ 天津 中医药大学 ２０ ０ ９级硕士研究 生 ， 天津 ３０ ９ ； ． ０ １３ ２ 天 津 中医药大学 ， 天津 ３ ０ ９ ０ １３ 通讯作者 ： 张滕 ， ｍａ ：ａ．ｈｎｔｎ １３ ６ ．ｏ］ Ｅ ｉ ａａ ｚａｇ ｇ２ ＠１ ３ ｃｎ ｌ ｅ
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是生物医学研究中常见的实验步骤。
下面将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法步骤。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 准备工具和试剂- 离心管、培养皿、组织研磨器、离心机、反应管等；- 消化酶（如胰蛋白酶、胰酶、胶原酶）、细胞分离缓冲液（如Hank's液、DMEM/F12液）- 磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、PBS缓冲液等。
2. 动物安乐死和心脏取出- 通过适当的麻醉方法将大鼠处死；- 固定大鼠，将心脏迅速取出。
3. 大鼠心脏组织的处理- 将心脏放入含有预冷的磷酸盐缓冲液的离心管中；- 用螺旋式切割器将心脏切碎并加入含有消化酶的组织研磨器中；- 用搅拌器均匀搅拌、体外消化。
4. 细胞的分离和纯化- 将组织胶块转移到筛网上，用PBS缓冲液冲洗细胞；- 收集细胞上清液，离心沉淀；- 用细胞分离缓冲液重新悬浮沉淀细胞。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 大鼠心肌细胞鉴定试剂- 法斯琪染色试剂；- cTnI、cTnT等心肌特异标志物抗体；- 免疫荧光显微镜。
2. 法斯琪染色鉴定- 采用法斯琪染色方案对心肌细胞进行染色；- 使用显微镜观察是否出现蓝色染色反应，标志细胞为心肌细胞。
3. 免疫荧光鉴定- 使用抗体与心肌特异标志物结合；- 使用免疫荧光显微镜观察细胞是否出现荧光信号。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 大鼠心肌细胞的培养基- 常用的培养基有DMEM/F12液、Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）等。
2. 细胞培养条件- 培养基中添加适当的血清（如胎儿牛血清）和抗生素；- 培养箱中保持37℃、5% CO2含量。
3. 大鼠心肌细胞培养步骤- 将分离得到的心肌细胞加入培养基中；- 在培养箱中培养细胞，定期更换培养基；- 进行细胞观察和实验。
新生SD大鼠心肌细胞的原代培养及荧光鉴定
岩， 张建华 ， 赵
勇
采用单纯胰蛋 白酶消化法分离 ， 差速贴壁法 纯化新生
液 等 自行 配置 。
大 鼠心肌细胞 。光学显微镜观察心肌细胞基本形态特征 ， 台
１ ． １ ． ３ 实验仪器 Ｚ Ｈ Ｊ Ｈ ． Ｃ １ １ １ ２ Ｂ超净工作 台（ 上 海智城公 司） ； Ｓ Ｍ Ａ Ｒ Ｔ Ｃ ｅ ｌ ｌ Ｃ Ｏ 培养箱 （ Ｈ ｅ ａ ｌ Ｆ ｏ ｒ ｃ ｅ
色法检测细胞成活率 达 ９ ０ ％ 以上 ； 肌钙蛋 白 Ｉ及 一 横 纹肌
肌动蛋 白免疫荧光染色法鉴定心肌细胞纯度达 ９ ８ ％ 以上 。
离心管 、 吸管 、 眼科剪 、 眼科镊等由本实验室提供 。
１ ． ２ 实验方 法
关键词
心肌细胞 ； 原 代培养 ； 新生大 鼠； 免疫 荧光
Ｒ ５ ４ ０ ． ４ ９
中图分类号
１ ． ２ ． １ 组 织 消化 和 细胞 分 离 配制 ０ ． １ ％胰酶 Ｄ －
文献标志码 Ａ 文章编号 １ ０ ０ ０—１ ４ ９ ２ （ ２ ０ １ ４ ） ０ １— ０ １ ２ ０— ０ ３
Ｈ ａ ｎ ｋ 缓冲液 ， 过滤除菌备用 ； 恒温磁力搅拌器预热
至３ ５～３ ７℃ 、 转速 ８ ０—１ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ ； 取 出 生 １— ３日
・
１ ２ ０・
安徽 医科大学 学报
Ａ ｃ ｔ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｓ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｉ ｓ Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ ２ ０ １ ４ Ｊ ａ ｎ ； ４ ９ （ １ ）
新生 Ｓ Ｄ大 鼠心肌细胞 的原代培养及荧 光鉴定
姬婷婷 ， 徐
１ ． １ ． １ 实验动 物
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原代新生大鼠心肌细胞的分离与培养
1.动物与仪器
1.1实验动物：选择出生第2 d的SD乳鼠,雌雄不拘。
1.2主要仪器与试剂:二氧化碳培养箱，Olympus倒置显微镜，超净工作台，低速自动平衡离心机,恒温磁力搅拌器；DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、D-Hank′s 液、溴脱氧尿核苷、小鼠抗大鼠Sarcomerie actin 单抗；山羊抗小鼠IgG。
2.方法
2.1心肌细胞的分离：取第2 d的SD乳鼠，无菌条件下开胸取心尖部，用预冷的D-Hank′s 液洗涤3遍，将心脏剪成约1mm3大小；用0.0625％的胰酶在37℃恒温磁力搅拌器中消化心肌组织，消化过程中采用分次消化时间(5min×5次,6min×5次,7min×5次,8min×5次)，第一次消化后自然沉淀并弃上清，以后自然沉淀后取上清；每次分离的上清液加等量含10％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，重复3次。
2.2心肌细胞的培养:细胞悬液放CO2培养箱培养90min后，采用差速贴壁分离技术,吸收培养瓶中的细胞悬液，调整细胞浓度为5.0×105细胞/mL，将单细胞悬液接种于培养板中，前3 d滴入Brdu使其终浓度为0.1mmol/L，并继续培养；24h后换液,以后隔日换液。
2.3心肌细胞搏动率的观察:在倒置显微镜下观察第1 d至第7 d心肌细胞的生长状态、形态变化，并摄像记录自发搏动频率。
随机计数培养至第4 d的心肌细胞的搏动率。
细胞搏动率(％)=搏动细胞数／细胞总数×100％。
2.4心肌细胞存活率的测定:取相同量的0.4％台盼蓝液与细胞悬液混匀后再取适量混合液滴于细胞计数板上，随机取10个高倍（20×）视野计数4个大格中的细胞总数及未染成蓝色的活细胞数，计数10次，取平均值。
细胞存活率(％)=活细胞数／细胞总数×100％.
2.5心肌细胞纯度的鉴定:取培养72 h后心肌细胞进行纯度鉴定，用横纹肌肌动蛋白(a actin)单克隆抗体作为一抗，用SABC法进行免疫细胞化学染色，用磷酸盐缓冲液（PBS）作为一抗的阴性对照。
随机取10个高倍（20×）视野计数阳性细胞及细胞总数。
阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数×100％。
【参考文献】
[1]Harary L，Farly B.In vitro studies of single isolated beating heart cells ［J］.Science,1960，131:1674-1675.
[2]Simpson P，Savion S.Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells[J].Cirac Res，1982，50：101-106.
[3]Suzuki T，Ohta M，Hosh H.Serum free，chemically defined medium to evaluate the direct effects of growth factors and inhibitors on proliferation and function of neonatal rat cardiac muscle cells in culture[J].In Vitro，1989，25：601-606.
[4]杨志明.组织工程学[M].北京:化学工业出版社,2002:155-158.
[5] 米蔷,何志旭,王志华,等.人成纤维细胞饲养层的制备及其对胚胎干细胞生长支持作用[J].复旦大学学报,2008,35(5):654-660.。