乳鼠心肌细胞原代培养综述

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原代心肌细胞培养技巧【转】

原代心肌细胞培养技巧【转】

原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型,被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试,摸索出了一些行之有效的方法,并积累了一些经验,现总结如下:1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力,成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞,不再具有分裂增殖能力.因此,大鼠出生时间越短,其心肌细胞分离后成活率越高,越容易贴壁生长.大量观测表明,选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法,前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种:胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强,容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和,能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞,对细胞损伤小,且在新生大鼠心肌组织,以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g・L1,我们使用的为0.8 g・L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩,细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力;消化不足,细胞聚集成团,无法分清细胞边界,难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r・min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散,使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时,应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触,进而影响细胞对肥大刺激的反应,而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言,应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如,如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个;若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测,则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞,在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此,在进行差速贴壁前后,均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后,应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外,可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次,但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力,经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中,若处理不当,很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂,故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是,如果使用胎牛血清培养细胞,由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多,BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现,获得高达90%以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时,接种密度较低,贴壁的心肌细胞数量减少,为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃,应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加,而且BrdU作用时间较长,对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外,去血清后可用ITS和0.1 g ・L1BSA对心肌细胞进行营养支持,对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外,还应特别注意以下几点:(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪,这样做不涉及腹腔,也就减少了污染机会.(2)如条件允许,应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养,以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长,否则既会导致培养液pH改变,又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间,配制及使用培养液时应注意:(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低,降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出,使培养液pH 上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完,否则应部分置于-20℃保存,使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3,再次过滤后方可使用.。

乳鼠原代心肌细胞培养概要

乳鼠原代心肌细胞培养概要

乳鼠原代心肌细胞培养概要作者:何伟, 张明雪, 闫丽娟作者单位:何伟(辽宁中医药大学,辽宁省沈阳市,110032), 张明雪,闫丽娟(辽宁中医药大学附属医院)刊名:实用心脑肺血管病杂志英文刊名:PRACTICAL JOURNAL OF CARDIAC CEREBRAL PNEUMAL AND VASCULAR DISEASE年,卷(期):2009,17(4)引用次数:0次1.郭军.鲍翠玉.林国生.杨波新生大鼠心肌细胞培养方法的改进[期刊论文]-心血管康复医学杂志 2006(6)2.邵华.金秀东.梁军.张际绯.刘瑞峰不同差速贴壁时间对心肌细胞培养的影响实验性研究[期刊论文]-牡丹江医学院学报 2008(1)3.王涛.余志斌.谢满江.车红磊新生大鼠心肌细胞培养技巧[期刊论文]-第四军医大学学报 2003(2)1.期刊论文谭玉珍.王海杰.TAN Yu-zhen.WANG Hai-jie生后不同时间乳鼠心肌细胞的形态结构和功能特征-解剖学报2009,40(4)目的 观察生后不同时间乳鼠心肌细胞的形态结构和功能特征,建立理想的分离和纯化乳鼠心肌细胞技术. 方法 采用胰蛋白酶消化和机械分离,结合两次差速贴壁法以及使用溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),从生后1~7d乳鼠心脏分离和纯化心肌细胞.观察细胞的形态和自发性搏动,并用心肌特异性肌钙蛋白丁(cTnT)免疫细胞化学染色进行鉴定.利用原位透射电镜术观察细胞超微结构,并观察其对肾上腺素和异丙肾上腺素的反应. 结果 从乳鼠心脏分离的细胞95%以上为心肌细胞,存活率为95%以上.乳鼠心肌细胞包括短柱状或杆状细胞和不规则形细胞.生后1~3d鼠大部分杆状细胞呈现幼稚心肌细胞的超微结构特征.6~7d鼠的杆状细胞具有类似于成熟心肌细胞的超微结构特征,cTnT呈高表达,横纹明显.不规则形细胞含有少量肌丝束,排列不规则.少数体积较小的细胞呈现未分化细胞的超微结构特征.培养72h后80%以上的细胞出现自发性搏动.肾上腺素和异丙肾上腺素刺激后,搏动细胞数目增多,搏动增强.生后6~7d鼠杆状细胞的药物反应较强. 结论 两类心肌细胞的超微结构特征、自发性搏动和对肾上腺素和异丙肾上腺素的反应不同.生后6~7d鼠心肌细胞较适合于成熟心肌细胞的体外实验研究.本实验建立的方法 是一种较理想的乳鼠心肌细胞培养方法 .2.学位论文张昱第一部分:硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用;第二部分:硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用2009研究一硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用 背景: 新型气体信号分子一硫化氢(H2S)在心血管系统主要具有舒张血管,开放心肌细胞ATP敏感钾通道、抑制L型钙通道而产生的负性心肌收缩力的效应。

小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养

小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养

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细胞生物学:小鼠心肌细胞原代培养

细胞生物学:小鼠心肌细胞原代培养

细胞生物学:小鼠心肌细胞原代培养㈠、概述整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期,小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。

小鼠心肌细胞的原代培养,一般选用生后1-10d的乳鼠心脏,尤以出生1-4d的较好,此时心肌细胞已分化充分,适于作各种研究,而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。

㈡、[试剂]1、培养液:1:1混合的DMEM/F12培养液,添加终浓度为10%小牛血清(FCS)、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。

2、消化液:胰酶(效价为1:250)0.08%、胶原酶II(活力为150U/mg)0.05%,用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制,-20℃保存。

3、D-Hanks溶液(pH7.2-7.8):KCl0.4g,KH2PO40.06g,NaCl8.00g,NaHCO30.35g,Na2HPO4?7H2O0.09g,酚红0.01g1L㈢、[实验步骤]1、取生后1-4d的乳鼠,用75%乙醇消毒皮肤,再用大头针固定乳鼠的头及四肢,剪开胸部皮肤,用75%乙醇消毒皮下组织,更换镊子及剪刀,开胸取出心脏,将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿(或青霉素瓶)中,剪去心房,剪开心室,用D-Hanks溶液冲洗三次,去除残留积血后,将心脏剪成1mm3大小的碎片,再将心脏碎片转移至离心管中,加5ml左右消化液,37℃消化5min,自然沉淀,弃上清,再加5ml左右消化液,37℃消化20min(每隔2min 振摇几下),用吸管吹打1min后,将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中,加入2ml冷的培养液终止消化,1000rpm5min,弃上清,沉淀中加入D-Hanks溶液2ml,1500rpm10min,弃上清,沉淀中加入培养液2ml,用吸管吹打制成细胞悬液。

(为节约时间,以下步骤省略)上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化,同样操作,合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中(37℃5%CO2)培养。

原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定

原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定

原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定*程阔菊,黄河,杜智勇,李洪,杨天德△【摘要】目的建立原代乳小鼠心肌细胞的培养方法,评价心肌细胞的存活状况并鉴定心肌细胞纯度。

方法应用胰酶联合胶原酶共同消化3d内C57乳小鼠心脏,台盼蓝染色判断心肌细胞存活率,α-actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度。

结果利用3d内乳鼠心脏可成功培养原代小鼠心肌细胞,台盼蓝染色显示细胞存活率大于95%,α-actin免疫荧光染色显示心肌细胞纯度达95%以上。

结论严格控制实验条件,可成功培养高存活率和高纯度的小鼠心肌细胞。

【期刊名称】重庆医学【年(卷),期】2013(000)022【总页数】3【关键词】乳小鼠;心肌细胞;分离;纯化;培养;鉴定各种基因敲除及转基因小鼠已广泛应用于心血管疾病动物模型的建立,已为心血管疾病机制的研究作出了巨大贡献。

体外心肌细胞培养作为一种体外实验研究模型,可以排除神经、体液的干扰而独立地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发生、发展机制,但由于小鼠心肌细胞的分离和培养比较困难,所以一直限制了医学科研工作者在细胞生物学水平上对心血管疾病方面的深入研究。

本实验室在以往的经验基础上,摸索出了一套成熟可行、简单可靠的小鼠心肌细胞培养方法,获得的心肌细胞存活率高且纯度高。

本文对此培养方法做一简单介绍,并对其中的关键影响因素做详细的探讨。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物1~3d龄野生型C57新生乳鼠,SPF级,由第三军医大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(渝)2007-0003。

1.1.2 主要仪器与试剂显微眼用镊、眼科剪、显微镊、显微剪(上海医疗器械有限公司),器械使用前清洗干净并经高压灭菌(121℃,20min)。

二氧化碳培养箱、倒置显微镜(OLYMPUS)、超净工作台(苏净安泰)、低温台式离心机(Sigma)。

小牛血清、DMEM/F12、胰酶、胶原酶Ⅱ(GIBCO),BrdU-溴脱氧尿苷(Sigma),青霉素、链霉素(华美生物工程公司),anti-α-actinin(Millipore),组织固定液(Alphelys),Triton X-100(Amresco),SlowFade Gold antifade reagent with DAPI(Invitrogen),Alexa goat anti-mouse IgG(H+L)(Invitrogen)。

细胞生物学:小鼠心肌细胞原代培养

细胞生物学:小鼠心肌细胞原代培养

㈠、概述 整体动物⼼肌细胞的增殖能⼒在出⽣后仅能维持⼀个短时期,⼩⿏在出⽣3周后DNA合成所需的酶的活性及⼼肌细胞的增殖能⼒就明显降低⾄成年⿏⽔平。

⼩⿏⼼肌细胞的原代培养,⼀般选⽤⽣后1-10d的乳⿏⼼脏,尤以出⽣1-4d的较好,此时⼼肌细胞已分化充分,适于作各种研究,⽽出⽣4d以后的乳⿏⼼脏中分离出来的⼼肌细胞较慢发育成为有⾃律性搏动的⼼肌细胞。

㈡、[试剂] 1、培养液:1:1 混合的DMEM / F12 培养液,添加终浓度为10%⼩⽜⾎清(FCS)、100IU/ml 青霉素、100µg/ml 链霉素。

2、消化液:胰酶(效价为1:250) 0.08%、胶原酶II(活⼒为150U/mg) 0.05% ,⽤pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制,-20 ℃保存。

3、 D-Hanks溶液(pH 7.2-7.8):KCl 0.4 g , KH2PO4 0.06 g , NaCl 8.00g , NaHCO3 0.35 g , Na 2HPO4?7H2O 0.09 g ,酚红 0.01 g 1L ㈢、[实验步骤] 1、取⽣后1-4d的乳⿏,⽤75%⼄醇消毒⽪肤,再⽤⼤头针固定乳⿏的头及四肢,剪开胸部⽪肤,⽤75%⼄醇消毒⽪下组织,更换镊⼦及剪⼑,开胸取出⼼脏,将⼼脏放⼊盛有D-Hanks溶液的平⽫(或青霉素瓶)中,剪去⼼房,剪开⼼室,⽤D-Hanks溶液冲洗三次,去除残留积⾎后,将⼼脏剪成1mm3 ⼤⼩的碎⽚,再将⼼脏碎⽚转移⾄离⼼管中,加5ml左右消化液,37℃消化5 min,⾃然沉淀,弃上清,再加5ml左右消化液,37℃消化20min(每隔2min振摇⼏下),⽤吸管吹打1min 后,将未消化完全的⼼脏碎⽚吸出⾄另⼀离⼼管中,加⼊2ml冷的培养液终⽌消化,1000 rpm 5min ,弃上清,沉淀中加⼊D-Hanks溶液2ml, 1500 rpm 10min ,弃上清,沉淀中加⼊培养液2ml,⽤吸管吹打制成细胞悬液。

乳鼠原代心肌细胞培养方法

乳鼠原代心肌细胞培养方法

乳鼠原代心肌细胞培养方法
实验动物
出生1~3天的健康乳鼠(Wistar),雌雄不分。

药品与试剂
DMEM/F12基础培基,Brdu ,胰蛋白酶(1:250),Ⅱ型胶原酶(sigma),胎牛血清(hyclone),双抗(青霉素-链霉素)
原代心肌细胞培养
1.出生后1~3天的乳鼠,雌雄不分。

将乳鼠在75%乙醇中浸泡5秒左右,于无菌条件下取出心脏,置于平皿中,用PBS溶液反复洗涤3次,并除去大血管及脂肪组织,眼科剪剪碎至约1mm3。

2.用0.1%的Ⅱ型胶原酶和0.06%的胰蛋白酶在37℃恒温摇床中震荡消化5~7次,每次5min。

收集除第一次之外各次所得的消化液,并及时加入到含10%胎牛血清的DMEM培养液中终止消化。

(第一次的消化液中含较多血细胞,故弃去,也可视清洗的情况而定)
3.终止后的消化液用200目筛过滤去除未消化组织块,1000rpm离心10min 收集细胞。

4.离心后弃上清,用全培基将细胞沉淀充分而轻柔地吹打成单细胞悬液,接种于培养瓶中,CO2培养箱差速贴壁1.5小时。

5.收集未贴壁的细胞悬液,重新接种于培养瓶中,前3天加用0.1 mmol/L Brdu抑制非心肌细胞的生长。

6.培养2~3天,待贴壁心肌细胞连成片状同步搏动后,消化接种于不同的培养板中,供进一步实验用。

细胞工程实验三:乳鼠心肌细胞的原代培养-治

细胞工程实验三:乳鼠心肌细胞的原代培养-治

将细胞混悬液1 000 r/min离心10 min
去上层,收获细胞
实战程序 第四大步骤:清洗细胞,培养细胞
细胞沉淀用PBS溶液和DMEM清洗3次 弃上清液 加4ml含20%小牛血清的DMEM培养液制 成细胞悬液,置于培养瓶中 培养24 h后即可见细胞贴壁和细胞收缩
【注意事项】
组织块必须漂洗 2~3 次以除去组织的钙离 子、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑 制作用。 胰蛋白酶浓度不宜过高,作用时间不能太长, 以避免毒性作用。 消化后组织不仅要尽量弃去消化液,以避免 毒性产生,而且动作要轻,以避免蓬松的细 胞随漂洗而失去。
【实验结果与分析】
记录心肌细胞的培养及动态观察。
实验三 动物细胞的原代培养
【实验目的】
掌握实体组织材料的原代细胞培养的 基本思路。 掌握动物组织中细胞的分离和原代培 养的方法。
【实验原理】(参考教材P128)
原代细胞培养是从供体取得组织细胞在体外
进行的首次培养
是一项基本技术
是建立细胞系的第一步
【实验原理】
原代细胞的分离和制作常采用的方法
用镊子小心剥离心包膜
剪去心房(心脏上半部分)及主动脉
PBS溶液清洗心室组织3次(至没有血时)
将心室组织剪成1~3 mm3碎块后,转移至
离心管
用PBS清洗3遍
实战程序 第三大步骤:消化组织,获得细胞
加0.125%胰蛋白酶(2ml)
37℃水浴中旋摇消化10 min 吸上层(细胞在悬液中,未消化好的组织块在底层) 细胞悬液转至小烧杯 加等体积无血清培养基终止反应,反复3-5次
【实验材料与器材】
本实验用品
每组1个:乳鼠、解剖器械、小烧杯、细胞 培养瓶、移液枪(1ml)及枪头 每组2个:离心管、培养皿
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乳鼠心肌细胞原代培养综述
【摘要】:目的乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛,但是心肌细胞成活率、搏动率,纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。

本文探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。

【关键词】乳鼠心肌细胞原代培养
1.新生大鼠鼠龄的选择
乳鼠心肌细胞随年龄的增长,其增殖分化能力亦有变化,如在新生3d内,具有部分增殖能力,而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞,不具备增殖能力,因此,我们在选择鼠龄时,尽量选择出生时间短的乳鼠,这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高,所以选择新生1~3d均可,最好为半日龄的大鼠更为理想。

2.消化酶的选择使用
分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸,如依地酸二钠(EDTA),其作用是利于组织块分散为单个细胞,利于细胞的贴壁生长。

消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大,甚至会损伤细胞,导致培养细胞状态不佳,失去贴壁生长能力,增加心肌细胞死亡率。

其中胰蛋白酶的消化力较强,常用浓度为0·05~0·50%,在37℃、PH8·0条件下作用最强,易造成心肌细胞损坏,因此,有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1],而TDTA作为一种化学螯合剂,价格低、毒性小,对细胞有一定的离散作用。

所以,选用胰蛋白酶与EDTA联合应用,可降低细胞损害,具有更好的消化分离效果。

另外,胶原酶作用较温和,通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的,对细胞的损伤较小,也是理想的细胞分离液,针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型,可联合使用Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。

且要知道的是在新生大鼠心肌组织,以胶原I为主,故我们选用胶原酶I,文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。

61 g·L-1,我们使用的为0。

8 g·L-1。

胶原酶最好现用现配。

3.污染防治
虽然污染本身是不可能完全避免的,但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。

因此,我们在细胞培养过程中,要坚持无菌操作的原则,如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作,个人要身着消毒衣帽,佩戴口罩及无菌手套,操作时,酒精灯火焰烧灼消毒器械,避免培养用液长时间暴露在空气环境,禁止吸管接触培养液瓶口等。

防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素,由于抗生素的种类不同,其抗生范围也不尽相同,但多数针对细菌感染为主,常用青霉素和链霉素联合应用。

需要指出的是,抗生素的抗生范围有限,且污染发生具有隐匿性,出现后往往后果严重,所以抗生素仍不能替代无菌操作,而且过度的强调抗生素的作用,会使实验者淡化甚至忽视无菌操作,滥用也会导致产生耐药菌,因此,只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段。

除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点:(1)获取心脏时避免剪破消化道,比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪,这样做不涉及腹腔,也就减少了污染机会。

(2)如条件允许,应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养,以防止发生交叉污染。

(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长,否则
既会导致培养液pH改变,又能增加污染机率。

4.心肌细胞纯化
在心肌细胞培养中,成纤维细胞具有分裂增殖能力,且生长迅速,比心肌细胞更早贴壁,如不加以控制,常可生长为优势细胞。

细胞纯化方法有很多因此,目前,常用化学试剂抑制法和差速贴壁分离法来抑制其生长,而化学试剂势必对培养细胞生长环境有一定影响,因此,依据心肌细胞与成纤维细胞贴壁时间不同的原理做差速分离,成了广泛采用的纯化方法,其优点是对目的细胞影响小,经比较,结果显示差速贴壁在60min、90min时最为理想[2]方法简便,纯化率较高,可达到95%以上。

经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中,若处理不当,很容易生长成优势细胞。

因此再加上化学试剂抑制,加入分裂抑制剂(如丝裂霉素c),有时在培养早期如入溴脱氧脲苷,或加入不利非心肌细胞生长的成分(如谷氨酰胺)。

如溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,BrdU)可干扰细胞的有丝分裂,故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长,但是,如果使用胎牛血清培养细胞,由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多,BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长。

改用小牛血清则可克服这种现象的出现,获得高达90%以上的心肌细胞[3]。

离心淘洗:通过各种转子速度和淘洗介质流速的选择对心肌细胞进行纯化,如转速度3 200 r/min,泵速设定20-80 mL/min,在80 mL/min时回收心肌细胞。

结果表明:差速贴壁易于实施,对细胞损伤小,但非心肌细胞不能彻底除去,离心淘洗能够得到较为理想的纯化目的,但代价高,梯度离心既便于实施也能较为彻底地除去非心肌细胞[4]。

5.细胞接种密度
分离得到的心肌细胞在接种前,应精细计算细胞数量。

若接种数过大,可致过量心肌细胞无法贴壁生长而漂浮,过快耗尽培养液营养成分,影响正常贴壁细胞的生长及观察;若接种数过少,细胞间隙过大,难以进行细胞间信号通讯,不利于心肌细胞生长、产生一致性搏动。

同时,不同实验目的对接种细胞数有不同的要求,如用于基因及蛋白表达检测时,细胞接种数可在5~6 105/m,l用于心肌细胞形态观察时,细胞接种数可在1~2 105/ml[3]。

6.换液时间
进行心肌细胞形态学观测时。

接种密度较低,贴壁的心肌细胞数量减少。

为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃,应在接种48 h后换液。

这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加。

而且BrdU作用时间较长。

对成纤维细胞的抑制作用更确实。

此外,去血清后可用ITS和0。

1 g·L-1BSA对心肌细胞进行营养支持,对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响。

之后换不加BRDU的培养液,每两天换一次。

7.培养液PH值控制注意
适宜的pH范围在7。

2—7。

4之间,配制及使养液时应注意:(1) pH值会在过滤后上升0。

10。

3。

(2)培养液中加入血清后pH值会有降低,降低程度与血清品质和含量有关。

(3)应及时换液。

(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃。

这是因为培养液中的CO2会溢出,使培养液pH上升。

每次配好的培养液尽量
在2 wk内用完,否则应部分置于-20℃保存,使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3,再次过滤后方可使用。

8.培养心肌细胞存活的形态标志
倒置显微镜下观察刚分离的心肌细胞呈球形; 4h后开始贴壁生长; 19~24h时完全贴壁,细胞呈球形和梭形,以梭形为主,偶见单个细胞搏动。

心脏中有多种细胞,但能够产生自发搏动的只有心肌细胞。

48h后心肌细胞伸出伪足,且部分细胞间形成交联,这是心肌细胞存活的形态标志。

细胞核大且胞浆丰富,立体感明显,折光性强。

单个的细胞搏动频率较低,细胞交联后搏动的频率明显增加。

9.应用与讨论
心肌细胞培养已成为心血管研究的基本方法和手段之一,在医学领域有着广阔的应用前景体外培养心肌细胞,可建立多种心肌细胞病理模型,优点是: 1.可观测药物对心肌组织中细胞的直接作用。

2.通过染色等方法可直接观察到各种药物对活细胞影响的动态过程。

3.方法简便,可提高效率。

缺点是: 1.失去了整体调节、内环境及正常细胞比例和相互影响。

2.影响因素多,实验操作要求严格。

参考文献
1.郭军,鲍翠玉,林国生等·新生大鼠心肌细胞培养方法的改进[J]·心血管康复医学杂志,2006,15: 539。

2.邵华,金秀东,梁军等·不同差速贴壁时间对心肌细胞培养的影响实验性研究[J]·牡丹江医学院学报,2008,29: 3-4。

3.王涛,余志斌,谢满江,车红磊·新生大鼠心肌细胞培养技巧[J]·第四军医大学学报,2003,24(2)
4.宋新爱,林元喜,樊小力·心肌细胞的纯化[J]·中国病理生理杂志,2010,26(10)。

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