成纤维细胞的培养
抗坏血酸_成纤维细胞培养_解释说明以及概述
抗坏血酸成纤维细胞培养解释说明以及概述1. 引言1.1 概述本文旨在探讨抗坏血酸在成纤维细胞培养中的作用机制，并解释其与成纤维细胞生物学过程的关联。
抗坏血酸，也被称为维生素C，是一种重要的水溶性维生素，在人体中扮演着多种重要的生理功能角色。
而成纤维细胞作为基质合成和调节过程中至关重要的一环，其培养方法及应用领域也备受研究者关注。
因此，深入了解抗坏血酸在成纤维细胞培养过程中的作用机制将对进一步揭示其生物学活性和应用前景具有重要意义。
1.2 文章结构本文将分为五个主要部分进行论述。
首先，引言部分将提供对文章主题的概述和定义以及文章整体结构。
其次，我们将介绍抗坏血酸（维生素C）的定义、特性、生理功能以及相关缺乏症状和食物来源。
第三部分则涵盖了成纤维细胞培养的概述、原理及其在科研和应用领域中的意义。
接下来，我们将详细解释抗坏血酸在成纤维细胞培养中的作用机制，包括抗氧化作用、与胶原合成的关联以及对细胞增殖和凋亡的调节效应。
最后，我们将总结并得出相关结论。
1.3 目的本文旨在全面阐述抗坏血酸在成纤维细胞培养中的作用机制。
通过深入了解抗坏血酸对成纤维细胞生物学过程的影响，希望能够揭示其在相关领域中的潜力和应用前景。
同时，本文也将为科学界提供更多关于抗坏血酸与成纤维细胞之间相互作用的理论依据，并为进一步研究该领域提供参考和指导。
2. 抗坏血酸2.1 定义和特性抗坏血酸，也称为维生素C，是一种水溶性维生素。
化学名为L-抗坏血酸，分子式为C6H8O6。
它是人体必需的营养物质之一，人体无法自主合成，因此需要通过食物摄入。
抗坏血酸具有许多特点和特性。
首先，它是一种强大的抗氧化剂，在体内可以中和自由基，并保护细胞免受氧化应激的伤害。
其次，抗坏血酸对于胶原蛋白的合成至关重要，它促进胶原蛋白的生成与修复，并维持皮肤、组织和器官的健康状态。
此外，抗坏血酸还能增强免疫系统功能、促进铁元素吸收以及参与多种生理过程。
2.2 生理功能抗坏血酸在人体中拥有多项重要的生理功能。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。
2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。
3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。
4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。
5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。
6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。
7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。
8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。
9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。
10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。
11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。
12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。
13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。
14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。
15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。
人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
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中国老年学杂志 2012 年 3 月第 32 卷
化学染色，细胞质中有棕色颗粒。成纤维细胞的标志物 Vimen- tin 为阳性，证明提取细胞为成纤维细胞。见 细胞培养第 2 天； c： 细胞培养第 12 天细胞生长呈鱼群状； d： 细胞培养第 14 天，细胞生长呈漩涡状
5 Keisuke T，Jin H，Taranova O，et al. Generation of insulin-secreting isletlike clusters from human skin fibroblasts〔J〕. Science，2008； 283 （ 46 ） ： 31601-7.
2结果 2. 1 成纤维细胞分离、纯化及培养 通过酶消化法及贴壁筛 选法，成功分离出人成纤维细胞。 2. 2 形态学观察 倒置显微镜观察细胞形态，接种第 2 天可 见细胞散在生长，分布不均的单个贴壁细胞呈梭形，成纤维细 胞样。待细胞培养 10 ～ 14 d 时，细胞生长已达 80% ～ 90% ，呈 鱼群样或漩涡状排列。见图 1。 2. 3 细胞 HE 染色 成纤维细胞的形态呈梭形，也可见大多 角形和扁平星形等。核仁明显，核呈椭圆形，可见 1 ～ 2 个核 仁，胞体较大，胞质弱嗜碱性，染色质疏松着色浅。当细胞汇流 时，呈鱼群样或漩涡状排列，细胞在 15 代内形态保持不变，经 HE 染色可以更清楚地观察到这些表现。见图 2。 2. 4 细胞免疫组化结果 对第 6 代成纤维细胞进行免疫细胞
人 成 纤 维 细 胞 的 体 外 分 离 、纯 化 培 养 及 细 胞 鉴 定
王玲玲1 马 峰2 张玉成 杜珍武 张桂珍 （ 吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 130033）
〔摘 要〕 目的 对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法 使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果 利 用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论 成 功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。
原代成纤维细胞培养基配方
原代成纤维细胞培养基配方1.引言1.1 概述成纤维细胞是一类常见的细胞，广泛存在于人体各个组织中，包括皮肤、血管、肌肉和内脏等。
在细胞培养技术的发展过程中，原代成纤维细胞培养基的配方变得越来越重要。
原代成纤维细胞培养基是一种提供养分和适宜环境的培养液，可以维持原代成纤维细胞的生长和增殖。
原代成纤维细胞培养基的配方包括多种关键成分，如培养基基础成分、生长因子、附加物等。
不同的组分可以提供细胞所需的营养和信号物质，使细胞能够在体外环境下继续生长和繁殖。
原代成纤维细胞培养基配方的研究对于细胞生物学、组织工程和再生医学等领域具有重要意义。
通过优化培养基的配方，可以提高原代成纤维细胞的增殖速度和存活率，同时改善其功能和特性，为细胞研究和临床应用提供更好的工具和基础。
然而，目前关于原代成纤维细胞培养基的配方研究还比较有限。
不同实验室和研究者之间存在着很大的差异，配方的选择和调整仍然依赖经验和试错。
因此，进一步的研究和探索仍然是十分必要和迫切的。
本文将深入探讨原代成纤维细胞培养基配方的概念和重要性。
我们将详细介绍培养基的组成、各种成分的作用机制，并总结现有研究的进展和局限性。
最后，我们将展望未来的研究方向，希望通过进一步的研究和探索，为原代成纤维细胞培养基的配方优化和应用提供更好的指导和支持。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括以下内容：文章结构部分的主要目的是为读者提供对整篇文章的摘要和框架。
通过描述文章的组织结构，读者可以更好地理解文章的内容和逻辑顺序。
首先，本文将介绍原代成纤维细胞培养基的概念和重要性。
这一部分将讨论成纤维细胞在生物医学和生命科学研究中的重要作用，以及为什么培养基对于细胞培养的成功和细胞功能的研究是至关重要的。
其次，本文将详细介绍原代成纤维细胞培养基的组成。
这一部分将讨论培养基中各种组分的作用和功能，如营养物质、生长因子、酶和血清的添加等。
读者将了解到培养基中各种组分的重要性和对细胞生长和功能的影响。
CEF、DEF培养
鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸭胚成纤维细胞(DEF)培养一、材料9¬10日龄鸡胚13¬14日龄鸭胚眼科剪、镊、外科镊、巴氏吸管、蛋架、灭菌平皿 25ml小三角瓶Hanks＇液 0.25%胰酶液 Versene液灭菌纱布、玻璃漏斗、0.1% 结晶柠檬酸（0.1M）或0.4%台盼兰,血球计数板、60ML培养瓶或60ML培养皿、灭菌盖玻片、营养液。
二方法（CEF为例）鸡胚理：取9¬10日龄鸡胚直于蛋架，在气室部用于5%碘酊棉消毒，再用洒精棉脱色，用外科镊击破蛋壳用眼科镊取出胚体放于平皿内，去喙瓜眼和内脏，用Hank＇s液洗两次，用弯头眼科剪剪胚剪成1-2mm的碎块，加Hank’s液20ml,略加摇振，静置使组织块下沉，将混有红血球及碎片的上悬液吸去，重复洗2—3次，直至上悬液不混浊为止。
2、消化：将0.25%胰蛋白酶溶液用5、6%NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加热至37度，按组织块量3—5倍加于装有鸡胚碎块的三角瓶中，每个鸡胚约需胰酶5ml，30分钟取出，静置1—2分钟，吸去胰液，再加HanK’s 液20ml，轻轻摇动后吸去，如此反复两三次，目的是洗去残余的胰酶。
第三次加入营养液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散。
静置1—2分钟，候组织下沉后，细心将细胞悬液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反复数次，使细胞尽量自组织块脱落，将多次取得的悬液合并一处，纱布过滤悬液。
必须注意每次吹吸一般6—7次为宜，太多则细胞受损，消化时间要灵活掌握，不足细胞不易掊落，太久则细胞破碎。
在消化过程中，摇动时组织不易下沉即立即停止，消化后如组织粘连如涕，证明消化过度。
二、细胞计数：取细胞悬液0.1（100ul）置盛有0.9ml10.4%台盼蓝的试管中混合,用血球计数板计数。
计算方法：4大方格细胞数每ml细胞数=——————————————X10（5）45中格细胞数或每ml细胞数=——————————X10（4）三：接种以营养液配成每ml10（6）细胞（最终稀释度）接种链霉素瓶（1ml）、60ml瓶（8—10ml），100mm dish（10ml），60mm dish（4ml），37度孵育48小进后形成单层，接种病毒或作次代培养。
牙周膜肌成纤维细胞的体外培养及其标志物的表达时效
牙周膜肌成纤维细胞的体外培养及其标志物的表达时效目的探讨人牙周膜肌成纤维细胞（MFB）体外培养及其标志物表达的时效性。
方法体外培养人牙周膜成纤维细胞（hPDLF），72 h内以5ug·L-1终质量浓度的转化生长因子（TGF）-B1诱导hPDLF向MFB转化，免疫细胞化学和免疫组织化学染色检测MFB标志物a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）表达情况。
分别进行12、24、48、72、96和120 h的MFB观察，采用流式细胞术观察MFB长时间培养的细胞活性，采用免疫细胞化学观察MFB长时间培养后的a-SMA表达情况。
结果经TGF-B1诱导后a-SMA呈阳性；诱导至120 h，a-SMA仍呈阳性，72 h内其表达稳定。
结论5 ug·L-1终质量浓度的TGF-B1成功诱导人牙周膜细胞向MFB转化。
MFB体外培养具有时效性，培养0-72 h，其状态稳定。
标签：人牙周膜成纤维细胞；肌成纤维细胞；a-平滑肌肌动蛋白本研究的前期体内试验证实，正畸牙牙周膜张力侧肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）可能参与了牙周膜改建和成骨细胞的成骨过程；但牙周膜内生物学环境复杂，在正畸生物力学的影响下，多种牙周膜细胞都可能出现类似于MFB标志物的表达情况；因此，要明确MFB在牙移动过程中可能发挥的作用，就需要进行体外试验，以明确MFB分泌细胞外基质及成骨的机制。
MFB 大多存在于组织处于外力环境时，而当外界张力因素去除掉后，MFB大多程序性死亡或退化消失。
研究MFB的功能，在成功诱导出MFB后还需明确MFB的活性，即MFB可以维持多久，这样才能确定MFB的体外观察时间。
本试验采用转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-B1诱导人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblast，hPDLF）向MFB转化，从12 h起，分6个时间点对hPDLF进行最长120 h的观察。
猪皮肤成纤维细胞的培养与鉴定
文章编号:100025404(2004)1321171204 论著猪皮肤成纤维细胞的培养与鉴定丁生财1,陈意生1,魏 泓2,刘 萍3 (第三军医大学:1西南医院病理科,2实验动物中心,重庆400038,3新桥医院妇产科,重庆400037) 提 要:目的 研究猪内源性逆转录病毒在体内和体外的感染性,建立理想的细胞模型,为猪一人间跨种移植的生物安全性评价奠定良好的基础。
方法 运用组织块培养法、冷胰蛋白酶方法及热胰蛋白酶方法培养猪皮肤成纤维细胞,比较3种方法的优点和缺点。
结果 建立了猪皮肤成纤维细胞系组织块培养法优于胰酶法。
结论 应用组织块培养法培养猪皮肤成纤维细胞优于胰酶法,经济实惠、操作简便、易于掌握;并为研究PERV在体内和体外的感染性提供了理想的细胞模型,为评估猪一人间跨种移植的生物安全性提供一种新的方法;对建立动物克隆生产的皮肤体外培养模式具有重要的参考价值。
关键词:成纤维细胞;猪内源性逆转录病毒;异种移植;生物安全性;感染;培养;皮肤;猪 中图法分类号:R322.99;R329.2 文献标识码:ACultivation and identification of porcine skin fibroblastsDI NG Sheng2cai1,CHE N2Y i2sheng1,WEI H ong2,LI U Ping3(1Research Institute of Pathology,S outhwest H ospital,2Department of Lab2 oratory Animal Science,3Department of Obstetrics and G ynecology,X inqiao H ospital,400037,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China) Abstract:Objective s T o establish an ideal cellular m odel for the study of in fection of porcine endogenous ret2 rovirus in intro and in vivo and to lay the foundation for evaluating the biological safety of xenotransplantation.Meth2 ods P orcine skin fibroblasts were cultured by tissue pieces,cold trypsin,and heat trypsin,respectively.The merit and defect of these methods were analyzed.Re sults P orcine skin fibroblast line was established and the tissue piece method was superior to trypsin methods.Conclusion Culture of porcine skin fibroblasts with tissue pieces is superi2 or to trypsin method,with the characteristics of low cost and easy operation.The established porcine skin fibroblast cell line supplies an ideal cell m odel for the study of in fection of porcine endogenous retrovirus in vitro and in vivo, provides a new method for the evaluation of biological safety of xenotransplantation,and plays an im portant role in the skin culture m odel of production of cloned animals. K ey w ords:fibroblast cell;porcine endogenous retrovirus;xenotransplantion;biological safety;in fection;cul2 ture;skin;pig 猪器官、组织和细胞作为猪一人间跨种移植的供体源具有广阔的前景,但其基因组载有猪内源性逆转录病毒前病毒序列,可能导致猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)种间传播发生的潜在危险。
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成纤维细胞的培养
1前言
成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。
根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞。
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。
在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。
不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。
通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位[1,2]。
成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。
由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。
成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍[3]。
2材料和方法
2.1材料
玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管
塑料器材：细胞培养板
橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管
滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜
2.2试剂的配制
水、0.4%酚红液、Hank’s液、MEM、无钙PBS液、双抗的配制、NaHCO3配制、新生犊牛血清（FCS)、原代和传代细胞分散液、3％谷氨酰胺、细胞生长液和细胞维持液、其他液体；洗液、无钙PBS胰酶液、Hank's液、
2.3方法
2.3.1试剂配制
（1）细胞分散液：无钙胰蛋白酶加4倍无菌蒸馏水
（2) 组织冲洗液：无血清MEM
（3）细胞生长液：含10％FCS MEM
2.3.2实验分配：每人1枚鸡胚，每人制备1瓶100mL培养瓶细胞。
2.3.3细胞制备过程
碘酊消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，用无血清MEM 冲洗3次，将鸡胚置于无菌平皿内，去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个平皿内，用无血清MEM冲洗3次，剪碎胚体，静止片刻，吸净上清，加入5－10倍无钙胰蛋白酶，并吸入于无菌青霉素小瓶内，用橡皮膏封严瓶口，37 ℃消化至细胞呈毛球样，吸净消化液，加入细胞生长液，将细胞置于细胞培养瓶中，并用大口吸管吹打细胞使之充分分散，分装2个细胞培养瓶内。
4、换液或接毒
细胞于37℃培养过夜，次日换细胞维持液，或单层接种病毒，每日观察CPE。
5、病毒的收获
CPE达到75％时，冻于冰柜内收获。
6、病毒鉴定
（1）免疫学鉴定：HA
3结论
免疫学鉴定的效价是28
4讨论
CEF细胞的制备一般选用9日龄~11日龄的SPF鸡胚,鸡胚日龄不宜过大,否则剪碎组织时候较为困难,而且杂细胞也会较多。
分离CEF的方法主要是以胰蛋白酶和胶原酶的酶消化法为主。
胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，其消化效果主要与pH、温度、胰蛋白酶的浓度、组织块的大小和硬度有关,钙、镁离子和血清均对该酶有抑制作用。
胶原酶适用于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等,在钙、镁离子和血清存在的情况下仍具有活性,因此使用该酶消化后需要清洗细胞。
相对于胰蛋白酶,胶原酶的价格昂贵,增加了试验成本,所以研究中胰蛋白酶应用最为广泛[4]。
参考文献
[1]徐荣辉，饶寒敏，朱雅萍，等.皮肤成纤维细胞在体外培养中的成骨作用.中华外科杂志[J],
1994，32(3)：190
[2]饶寒敏，徐荣辉，朱雅萍，等.家兔皮肤成纤维细胞在体外培养中的成骨作用(显微录象与
四环素标记观察)[J].中华骨科杂志，1995，15(5)：295
[3]百度百科.[2010-6-23]./view/88142.htm?fr=ala0_1.
[4]朱国坡，周晓丽，郭延峰，等.鸡成纤维细胞原代培养及应用[J].动物医学进展，
2010，31(3)：114-116.。