酶联免疫法
酶联免疫分析的基本类型和原理
酶联免疫分析的基本类型和原理酶联免疫分析（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种灵敏的免疫学分析方法，广泛应用于生物医学领域，包括基础研究、临床诊断、药物筛选等。
该方法基于抗原-抗体的特异性结合反应，将酶与抗体或抗原的结合，通过酶促反应的放大效应，实现对蛋白质的灵敏检测。
一、酶联免疫分析的基本类型根据实验设计的不同，酶联免疫分析可以分为直接法和间接法两大类。
1.直接法：将酶标记的抗体直接与抗原反应，通过检测抗原-抗体-酶复合物的吸光度来定量抗原。
这种方法适用于检测抗原含量较高的样品，如病毒、细菌等。
2.间接法：将酶标记的抗抗体与特异性抗体反应，通过检测抗抗体-抗体-酶复合物的吸光度来定量特异性抗体。
这种方法适用于检测特异性抗体含量较高的样品，如血清、血浆等。
二、酶联免疫分析的原理酶联免疫分析的原理是利用抗原-抗体的特异性结合反应，将酶与抗体或抗原的结合，通过酶促反应的放大效应，实现对蛋白质的灵敏检测。
具体步骤如下：1.包被：将抗原或抗体包被在固相载体（如聚苯乙烯酶标板孔）上，使其与样品中的抗原或抗体结合。
2.温育：将包被后的样品放入温育箱中，保持一定温度和湿度，使抗原-抗体结合反应充分进行。
3.洗涤：洗涤未结合的游离抗原或抗体，去除未结合的物质，使后续步骤中的酶促反应更加特异。
4.加入酶标抗体或酶标抗原：将酶标记的抗体或抗原加入到洗涤后的样品中，使其与已结合的抗原或抗体特异性结合。
5.温育：将样品再次放入温育箱中，保持一定温度和湿度，使酶促反应充分进行。
6.洗涤：洗涤未结合的游离酶标抗体或酶标抗原，去除未结合的物质，使后续步骤中的显色反应更加特异。
7.显色：加入底物溶液，使其与已结合的酶标抗体或酶标抗原中的酶发生显色反应，生成有色产物。
8.终止反应：加入终止液，停止显色反应，使有色产物不再生成。
9.检测：用酶标仪测定各孔的光密度值，通过与标准曲线比较，计算出样品中待测抗原或抗体的浓度。
酶联免疫检测方法
酶联免疫检测方法
酶联免疫检测是一种常用的生物技术方法，它结合了酶标记和免疫反
应的原理，可用于检测生物样品中特定分子的含量，如蛋白质、抗体、激
素等。
具体步骤如下：
1.准备样品：从生物样品中提取目标分子，例如血液、尿液、细胞等。
2.免疫反应：将一定浓度的目标分子加入到反应孔中，并加入与目标
分子特异性的抗体，使两者发生免疫反应。
3.洗涤：对反应孔进行洗涤，以去除未与抗体结合的杂质以及剩余的
抗体。
4.添加荧光标记的二抗：向反应孔中加入荧光标记的二抗，使其与已
结合的抗体形成复合物。
5.洗涤：对反应孔进行再次洗涤，以去除未结合的荧光标记的二抗。
6.酶标记：向反应孔中加入用酶标记的物质（如酶标记的抗体），使
其与已结合的荧光标记的二抗形成复合物。
7.洗涤：对反应孔进行最后一次洗涤，以去除未结合的酶标记化合物。
8.反应染色：向反应孔中加入染色物质，使其与酶标记化合物发生颜
色反应，形成分析结果。
最终，检测结果可以通过测量反应孔中染色物质的光密度或荧光强度
来评估样品中目标分子的浓度。
酶联免疫检测方法具有高灵敏度、高特异
性和高通量等优点，广泛应用于医学、生物工程、食品安全等领域。
酶联免疫法
酶联免疫吸附试验（又称酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunoassay，简称ELISA）利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。
根据待测样品与键结机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以三明治法（sandwich）、间接法（indirect）、以及竞争法（Competitive）三种为主，以下为各种方法之介绍.三明治法常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为:1.将具有专一性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体2.加入待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结3.洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一之一次抗体，与待测抗原进行键结4.洗去多余未键结一次抗体，加入带有酵素之二次抗体，与一次抗体键结5.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认，因此专一性相当高，但此待测抗原必须是多价抗原，如此才可获得两种以上的专一性抗体，以分别进行夹心；而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心，所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。
间接法间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为：1.将已知之抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余之抗原2.加入待测检体，检体中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结3.洗去多余待测检体，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体键结4.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗原的含量。
竞争法竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为：1.将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体2.加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结3.加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酵素之抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。
酶联免疫分析法
酶联免疫分析法生工121 徐娜酶联免疫分析法是目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，特别是在食品和饲料中有毒有害物质的检测应用极为广泛。
酶联免疫分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。
该技术的原理主要有三点：第一、抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍具有其免役活性；第二、抗体或抗原与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量。
酶联免疫法在医药、食品加工业、农牧渔业等领域有着广泛的应用：如乙型肝炎、莱姆病，急性心肌梗死的早期诊断，定量检测内毒素，HIV抗体初筛，SARS 病毒的快速检测；检测食品中的病毒，残留农药，微生物及其其它成分；检测香蕉有关病毒，小麦黄花叶病毒，检测水产品中氯霉素的残留量，禽脑脊髓抗体等。
一、医学临床中的应用医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提供了特异性、敏感性强的试验基础。
1、乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的抗原或抗体，一直受到各级医疗卫生机构检验科室的高度重视。
尤其是对乙型肝炎，甲型肝炎，丙型肝炎的血清学检测，更因为试剂盒的推出而得到广泛开展。
上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检测方法，绝大部分都是酶联免疫分析法。
2、简化莱姆病的诊断：由于在作出博氏疏螺旋体感染诊断前要进行双重测试，因此莱姆病的测试可能花费很长时间。
采用由关键的疏螺旋体抗原决定簇构成的重组蛋白开发出一种新的酶联免疫测定方法。
该测试比最常用的商业全细胞酶联免疫测定法特异，而敏感性相同，并且在20分钟就会产生结果。
3、急性心肌梗死的早期诊断：急性心肌梗死为一多发病，病情严重。
目前对此病的策略是尽早的确诊并迅速积极的治疗。
约有四分之一或更多的患者，在初诊时心电图并不显示典型心肌梗死心电图异常，无Q波。
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）
是一种常用的免疫学实验技术，用于检测样本中特定蛋白质或其他
分子的存在。
酶联免疫法通过利用特异性抗体与特定抗原结合的原
理来进行检测。
这种方法的原理是将待检测的抗原或抗体与特定的
酶标记的抗体或抗原结合，然后通过酶的底物来检测酶的活性，从
而确定待检测物质的存在或浓度。
酶联免疫法主要分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间
接竞争ELISA等几种类型。
直接ELISA直接将被检测的抗原或抗体
吸附在固相载体上，然后加入与其特异性结合的酶标记的抗体或抗原，通过酶的底物来检测酶活性。
间接ELISA则是在固相载体上吸
附抗原后，再加入特异性抗体和酶标记的抗体，以增强检测的灵敏度。
竞争ELISA则是将待检测的抗原与酶标记的抗原竞争结合，通
过竞争程度来检测待检测物质的浓度。
间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的特点，可以用于检测抗体的浓度。
酶联免疫吸附试验法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感和特异性的实验技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究和生物制药工业等领域。
它的优点包括操作简便、成本
低廉、高通量性和可定量性等，因此被广泛用于检测疾病标志物、药物残留、植物病原体和基因工程产品等。
同时，酶联免疫法也有一些局限性，比如可能受到干扰物质的影响、需要一定的实验条件和设备等。
因此，在使用酶联免疫法时需要综合考虑其优缺点，并结合具体的实验要求来选择合适的方法和条件。
酶联免疫法国内外的技术发展
酶联免疫法国内外的技术发展酶联免疫法是一种常用的生物技术方法，被广泛应用于医学诊断、生物学研究和药物开发等领域。
本文将对酶联免疫法的国内外技术发展进行介绍和分析。
一、酶联免疫法的基本原理酶联免疫法是一种利用酶和抗体相互作用的免疫学方法。
其基本原理是将待测物与标记有酶的抗体或抗原结合，形成特异性的抗原-抗体复合物。
通过酶的催化作用，可以将待测物定量转化为颜色、荧光或发光等信号，从而实现对待测物的检测和定量。
二、国内酶联免疫法技术发展在国内，酶联免疫法的技术发展取得了长足进步。
首先是检测方法的改进。
近年来，随着技术的发展，新的检测方法不断涌现，如发展了高灵敏度的酶标仪和多光子显微镜等设备。
这些新方法的应用，提高了检测的灵敏度和准确性。
其次是标记物的改进。
传统的酶联免疫法常用酶标记物是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），而近年来，越来越多的新型标记物被引入，如金纳米颗粒、荧光染料和荧光蛋白等。
这些新型标记物不仅具有更好的稳定性和灵敏度，还可以实现多重检测。
此外，还有一些新颖的酶联免疫法技术被开发出来，如电化学酶联免疫法和微流控酶联免疫法等。
三、国外酶联免疫法技术发展国外对酶联免疫法的研究和应用也非常活跃。
一方面，国外在酶联免疫法的基础上进行了许多改进，提高了其灵敏度和准确性。
例如，引入了放射性同位素标记物，使得检测的灵敏度大幅提高。
另一方面，国外还开发了一些新的酶联免疫法技术，如酶放大技术和磁性颗粒酶联免疫法。
这些新技术不仅可以提高检测的灵敏度和速度，还可以实现高通量和自动化。
四、酶联免疫法的应用领域酶联免疫法在医学诊断、生物学研究和药物开发等领域有着广泛的应用。
在医学诊断中，酶联免疫法可以用于检测各种疾病标志物，如肿瘤标志物、感染性病原体和自身免疫性疾病相关的抗体等。
在生物学研究中，酶联免疫法可以用于研究蛋白质相互作用、细胞信号传导和基因表达调控等。
在药物开发中，酶联免疫法可以用于筛选药物靶点和评估药物的效力。
第四代酶联免疫法
第四代酶联免疫法（原创实用版）目录1.酶联免疫法的概述2.第四代酶联免疫法的特点3.第四代酶联免疫法的应用领域4.第四代酶联免疫法的优势与局限性正文酶联免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称 ELISA）是一种免疫学检测方法，广泛应用于生物学、医学研究以及临床诊断等领域。
自 20 世纪 70 年代以来，酶联免疫法已经经历了三代的发展，如今已经进入了第四代。
那么，第四代酶联免疫法有哪些特点和优势呢？它又在哪些领域发挥着重要作用呢？首先，我们简要了解一下酶联免疫法的基本原理。
酶联免疫法是一种基于抗原和抗体特异性结合反应的检测方法。
它通过将抗原或抗体固定在固相载体上，然后加入相应的抗体或抗原，形成免疫复合物。
接着，加入酶标抗体或抗原，使其与免疫复合物结合，最后通过检测酶催化的底物反应，判断样品中目标物质的含量。
第四代酶联免疫法在第三代的基础上，引入了多种创新技术，如新型酶标抗体、纳米材料、生物传感器等。
这些技术的应用，使得第四代酶联免疫法在灵敏度、特异性、检测速度等方面有了显著的提高。
在应用领域方面，第四代酶联免疫法依然保持着广泛的应用。
它主要应用于以下几个方面：1.传染病诊断：如病毒性肝炎、艾滋病、疟疾等；2.肿瘤标志物检测：如甲胎蛋白、癌胚抗原等；3.自身免疫性疾病诊断：如类风湿因子、抗核抗体等；4.药物浓度监测：如免疫抑制剂、激素等。
尽管第四代酶联免疫法具有诸多优势，但它仍然存在一些局限性。
例如，实验操作过程中可能出现的交叉污染、酶标抗体的质量不稳定等问题，这些都需要在实际应用中加以注意和改进。
总之，第四代酶联免疫法凭借其较高的灵敏度、特异性和检测速度，以及广泛的应用领域，成为了免疫学检测领域的重要手段。
酶联免疫检测法
酶联免疫检测法一、概述酶联免疫检测法是一种常见的生物分子检测方法，它利用酶作为标记物来检测目标分子，具有高灵敏度、高特异性、易操作等优点，广泛应用于医学、生物学、化学等领域。
二、原理酶联免疫检测法基于抗原-抗体反应原理，包括直接酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等多种类型。
其中，最常见的是直接和间接ELISA。
1. 直接ELISA直接ELISA是将已知抗体固定在微孔板上，并加入待检样本中含有目标抗原的溶液，经过一定条件下的反应后，再加入与目标抗原结合的酶标记二抗，在适当条件下进行染色反应并测定吸光度值。
其优点是操作简单快捷，但缺点是灵敏度略低。
2. 间接ELISA间接ELISA是将已知抗体固定在微孔板上，并加入待检样本中含有目标抗原的溶液，在适当条件下进行反应后加入与目标抗原结合的一抗，再加入与一抗结合的酶标记二抗，在适当条件下进行染色反应并测定吸光度值。
其优点是灵敏度高，但操作稍复杂。
三、步骤酶联免疫检测法的基本步骤如下：1. 预处理样本：根据不同的样本类型和检测要求，可以进行不同的处理方法，如离心、洗涤、稀释等。
2. 固定抗原或抗体：将已知抗体或抗原固定在微孔板上。
3. 加入待检样本：加入含有目标分子的待检样本。
4. 洗涤：将未结合的物质洗去。
5. 加入酶标记二抗或一抗：根据实验设计需要选择适当的酶标记二抗或一抗，并加入微孔板中与目标分子结合。
6. 洗涤：将未结合的物质洗去。
7. 加入底物：加入适当底物后，在适当条件下进行染色反应。
8. 停止反应并测定吸光度值：在反应停止后，使用光谱仪等设备测定吸光度值，并根据标准曲线计算待检样本中目标分子的浓度。
四、应用酶联免疫检测法在医学、生物学、化学等领域有广泛的应用，常见的应用包括：1. 临床诊断：如肝炎病毒、艾滋病毒等感染的诊断。
2. 药物检测：如抗生素、激素等药物残留的检测。
3. 食品安全：如农药残留、食品添加剂等的检测。
酶联免疫方法检测细胞因子步骤
酶联免疫方法检测细胞因子步骤酶联免疫方法是一种常用的实验技术，用于检测细胞因子的含量和活性。
这种方法结合了酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹（Western blot）的优点，可以准确、快速地检测细胞因子的表达和分泌水平。
下面我们将详细介绍酶联免疫方法检测细胞因子的步骤。
第一步：收集样本在进行酶联免疫方法检测细胞因子之前，首先需要收集样本。
样本可以是细胞培养上清液、血清、血浆、组织匀浆等。
在收集样本的过程中，需要注意避免污染和降解，以保证后续实验的准确性和可靠性。
第二步：制备样品收集到样本后，需要进行样品的制备工作。
对于细胞因子的检测，通常需要进行细胞裂解或离心等步骤，以获得纯净的样品。
此外，还需要对样品进行稀释或浓缩处理，以确保在检测过程中细胞因子的浓度在可检测范围内。
第三步：选择合适的试剂盒在进行酶联免疫方法检测细胞因子之前，需要选择合适的试剂盒。
试剂盒的选择要根据要检测的细胞因子种类和检测方法来确定。
一般来说，试剂盒中包含了抗体、标记物、基质和洗涤缓冲液等试剂，可以满足细胞因子的检测需求。
第四步：进行酶标记接下来需要进行酶标记的过程。
酶标记是酶联免疫方法的关键步骤，通过在抗体或抗原上标记酶，可以实现细胞因子的特异性检测。
常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
在酶标记过程中，需要严格控制反应条件和时间，以确保标记的稳定性和活性。
第五步：进行反应在准备好标记的抗体或抗原后，就可以进行酶联免疫反应了。
首先将标记的抗体或抗原加入到微孔板或膜上，然后加入待测样品，进行孵育反应。
在孵育反应过程中，细胞因子将与其特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
然后进行洗涤，以去除非特异性结合的物质。
第六步：显色反应经过洗涤后，就可以进行显色反应了。
显色反应是检测细胞因子含量的关键步骤，通过在酶作用下的底物转化，可以产生可检测的颜色或荧光信号。
根据试剂盒中所提供的底物种类和反应条件，可以确定最适合的显色方案。
酶联免疫法
酶联免疫法酶联免疫法是一种灵敏度非常高的检测技术，它可以用来检测微量物质，广泛应用于各种生物学研究中。
酶联免疫法的这种特殊特性，使它在医学检验、环境污染监测、食品安全检测以及其他科学研究中得到了广泛的应用。
一、酶联免疫法简介酶联免疫法，又称酶连接免疫吸附测定（ELISA），是一种常见的生物分子检测技术，可以检测出极低的抗原浓度。
它是一种免疫学技术，它通过特异性抗体和酶的特殊反应，以达到非常灵敏的检测效果。
酶联免疫法的基本原理是：首先，将要检测的样品（抗原或抗体）和特异性抗体在反应板上发生反应，然后，将一种酶修饰的抗原特异性抗体溶解液加入，反应结束后，再加入酶的底物溶液，底物溶液中的特异性酶会与反应板上的抗原特异性抗体结合，形成抗原-酶复合物，最后用测定仪测定抗原-酶复合物的光谱，从而得到检测结果。
二、酶联免疫法的应用1、医学检验酶联免疫法在医学检验方面，可以用于检测各种病毒、细菌及其抗原，如肝炎、梅毒、登革热等；也可以用于检测抗体，如抗体检测、免疫球蛋白检测等；还可以用于检测放射性标记的抗原或抗体，用于免疫学研究与临床诊断。
2、食品安全检测酶联免疫法可以用于检测各种污染物，如残留农药、重金属、疾病菌等，以确保食品安全。
3、环境污染监测酶联免疫法可以用于环境污染监测，可以检测出游离态的污染物，如氨、氯、硫酸盐等，以及致病菌、抗药性菌等，为控制环境污染提供重要的参考数据。
4、其他科学研究除了上述应用外，酶联免疫法还可以用于其他科学研究，如生物化学、分子生物学、遗传学、细胞生物学等，可以用来研究蛋白质、核酸、糖蛋白等生物物质。
三、酶联免疫法的优缺点1、优点a) 酶联免疫法的灵敏度很高，可以检测出极低的抗原浓度；b) 反应快速，结果准确；c) 操作简单，容易稳定；d) 可以同时检测多个抗原或抗体，效率高；e) 反应条件可以调整，可以根据不同的样品进行调整。
2、缺点a) 需要一定的抗体，而抗体的生产时间较长；b) 对抗原的特异性较弱；c) 稀释抗体可能会引起误差；d) 检测时，可能会受到干扰物的影响。
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酶联免疫吸附实验ELISA
一．实验目的
酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
二．实验原理
用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰
是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。
用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三条：
（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。
也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。
不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。
本法不仅
可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。
因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。
2、研究抗酶抗体的合成。
3、显现微量的免疫沉淀反应。
4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
基本方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
（简称洗涤，下同）。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O•D值：在ELISA检测仪上，
于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O•D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
基本方法二用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。
次日洗涤3次。
↓
加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。
（同时做空白、阴性及阳性孔对照）
↓
于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
↓
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
（二）酶与底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。
是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。
免疫技术常用的酶及其底物
酶底物显色反应测定波长
辣根过氧化物酶邻苯二胺橘红色492*
四甲替联苯胺黄色460**
氨基水杨酸棕色449
邻联苯甲胺兰色425
2,2＇-连胺基-2（3-乙基-并噻唑啉磺酸-6）铵盐蓝绿色642
碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐（PNP）黄色400
萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐红色500
葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖黄色405,420
葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰深蓝色
β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷（4MuG）荧光360,450
硝基酚半乳糖苷（ONPG）黄色420
* 终止剂为2mol/L H2SO4
** 终止剂为2 mol/L柠檬酸，不同的底物有不同的终止剂。
可催化下列反应：HRP+H2O2→复合物复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物, 供氢体；A——为有色产物。
（三）ELISA常用的四种方法
1．直接法测定抗原
将抗原吸附在载体表面；
加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；
加底物。
底物的降解量＝抗原量。
2．间接法测定抗体
将抗原吸附于固相载体表面；
加抗体, 形成抗原-抗体复合物；
加酶标抗体；
加底物。
测定底物的降解量＝抗体量。
3．双抗体夹心法测定抗原
将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;
加抗原，形成抗原-抗体复合物;
加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物; 加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）;
加底物。
底物的降解量＝抗原量。
4. 竞争法测定抗原
将抗体吸附在固相载体表面;
（1）加入酶标抗原；
（2）,（3）加入酶标抗原和待测抗原；
加底物。
对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
三．仪器和材料
1. 聚苯乙烯微量细胞培养板（平板, 40, 96孔）。
2. 酶联免疫检测仪
3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。
4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。
5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS－－Tween－－20, ４℃，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。
6. 洗涤液：同稀释液
7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。
8. 邻苯二胺溶液（底物）：临用前配制0.1M 柠檬酸（2.1g/100ml）, 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O（7.163g/100ml） 6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升。
9. 终止液：2mol/LH2SO4。
四. 操作步骤
1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。
2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。
同时作稀释液对照。
37℃放置2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10－－15分钟。
10. 加终止液：每孔50微升。
11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。