植物可溶性蛋白的测定
植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定Ⅰ．斐林-酚试剂法 [原理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。
在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。
由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。
该法适于微量蛋白的测定(范围为5～l00μg蛋白质)。
[材料、仪器设备及试剂](一)材料各种植物材料。
(二)仪器设备 722分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。
(三)试剂 (1)0．5mol／L Na0H。
(2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：A液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。
B液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积混合。
使用前将A与B按50:1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。
(3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04。
H20)100g，钼酸钠(Na2Mo04·2H20)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中。
之后加入85％的H3PO450mL，浓Hcl 100 mL，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10h。
冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水50ml，溴水2-3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min）。
待冷却后稀释至1000ml，过滤入棕色瓶中保存。
使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L酸度。
因此在使用前应进行标定。
植物生理学实验课件9植物组织中可溶性蛋白的测定
可溶性蛋白质含量的计算
可溶性蛋白含量 (μg/g.FW)=标准曲线上查得的 蛋白质量（ μg ） × 提取液体积5/0.1
示意如下：
0.35
Y=-0.00381+0.032029*X 0.30 r=0.9992
0.25
Absorbance
0.20
植物组织中可溶性蛋白的测定
植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶 色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）
课上笔记
三个指标
– 蛋白质含量
考马斯亮蓝
– 新叶2份 – 老叶2份，一次次加 – 转移到1.5毫升 – 显色反应做2次，合计4次（调零磷酸+考马斯亮蓝
– MDA含量
沉重，磨好， 反求诸己
实验原理
in darkness at 30
No 3: 10ppm ABA 20 ml 提取
称叶龄差异明显的叶片各1.00g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol， pH值为7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以10 000g 离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。
显色反应
可溶性蛋白测定：缓冲液提取后可溶性蛋白溶于 上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反 应呈蓝色。在595nm处有最大吸收峰。
实验步骤
制备匀浆
48小时前预处理:称取叶片三份,每份1g（最好打圆孔），30度恒 温箱放置。
No 1: water 20ml (control);
No 2: 10ppm BA 20 ml; ℃ 2d.
0.15
0.10
0.05
0.00 0
2 4 6 8 10
可溶性蛋白的测定——李合生
植物组织中可溶性蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G-250染色法一、原理考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。
在一定蛋白质浓度范围内(1-1000ug)，蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。
其结合物在室温下1h内保持稳定。
此法灵敏度高(比斐林-酚法还高4倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料小麦叶片及其他植物材料（二）仪器设备722分光光度计，研钵，烧杯，两瓶，移液管，具塞刻度试管等。
（三）试剂（1）标准蛋白质溶液：100ug/mL牛血清蛋白：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL即可。
（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90%乙醇中，加入100mL 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中。
常温下课保存一个月。
三、实验步骤（一）标准曲线的绘制取6支具塞试管，按表加入试剂（0—100ug/mL的标准蛋白）。
混合均匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，用1cm 光径比色皿在595nm下比色测定吸光度。
以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
绘制标准曲线的各试剂加入量（二）样品测定（1）样品提取：称取鲜样0.5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，10000r/min离心10min，取上清液1.0mL（视蛋白质含量适当稀释）于试管中。
可溶性蛋白质含量的测定
植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位／毫克蛋白质，unIT／Mg ProTeIn)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。
常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G－250染色法，本实验将分别介绍这两种方法。
方法一：LoWry法(劳里法)【原理】LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的结合与发展。
其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。
再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe ＆PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。
这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。
LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。
由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。
LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。
但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。
1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。
因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。
且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约05Mg以上。
实验二 可溶性蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝G-250法)
表-1 配制0～100µg/ml血清白蛋白液
管 号 100µg/ml牛血清蛋白量(ml) 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg) 1 0 1.0 0 2 0.2 0.8 0.02 3 0.4 0.6 0.04 4 0.6 0.4 0.06 5 0.8 0.2 0.08 6 1.0 0 0.10
实验步骤
实验步骤
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定
取植物叶片0.1-0.2剪碎，用磷酸缓冲液研磨，倒入 10ml 离心管中，定容到10 ml，10000 pm离心， 20min 得上清液作为待测样品。 取0.5 ml提取液于试管中，加入0.5ml蒸馏水后摇匀， 再加上3 ml考马斯亮兰试剂并充分摇匀，在30摄氏度 水浴 20min ，于595nm处测得OD值。
实验二 植物组织中可溶性蛋白的测定
实验目的
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类， 植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类， 测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。 测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每 一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／ 蛋白 蛋白） 一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表 示酶活力大小及酶制剂纯度。因此， 示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性 蛋白质是研究酶活的一个重要项目。 蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
实验原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的 一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与 蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在 465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内 （0～100µg/ml），蛋白质与色素结合物在595nm波 长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质 的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内 达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h 内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含 量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。
植物蛋白质含量测定（考马斯亮蓝法）
【仪器与用具】
分光光度计，10ml 量筒 1 支；研体；10ml 容量瓶 1 支；1ml 刻度吸管 3 支；10ml 具塞刻度试管 14 支。 【试剂】
（1）牛血清白蛋白 配成 1000μg/ml 和 100μg/ml；
（2）考马斯亮蓝 G-250：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶于 50ml 90%乙醇中，加入 85%（W/V）磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容至 1000ml。此溶液在常温下可放置一个月；
（3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。 【方法】
1.标准曲线的绘制
（1）0～100μg/ml 标准曲线的制作取 6 支试管，按表 28-1 数据配制 0～100μg/ml 血清白蛋白液各 1ml。 准确吸取所配各管溶液 0.1ml，分别放入 10ml 具塞试管中，加入 5ml 考马斯亮蓝 G-250 试剂，盖塞，反 转混合数次，放置 2min 后，在 595nm 下比色，绘制标准曲线。 表 28-1 配制 0～100μg/ml 血清白蛋白液
【原理】
考马斯亮蓝 G-250 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G-250 在游离态下呈红色，当它与 蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在 465nm，后者在 595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～ 100μg/ml），蛋白质－色素结合物在 595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定 量测定。蛋白质与考马斯亮蓝 G-250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物 在室温下 1h 内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。 在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg 蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定 植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有 Lowry 法和考马斯亮蓝 G-250 染料结 合法。本实验将分别介绍这两种方法。
植物衰老生理 植物组织中可溶性蛋白的测定 浙江大学植物生理学实验课件
实验步骤 l 制备蛋白提取液
称叶龄差异明显的叶片各0.50g ，加入5.00ml 磷 酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中 研磨提取，匀浆液以10000g 离心力作用下 （4C）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。 注意：
植物衰老生理1
植物组织中可溶性蛋白的测 定
实验原理
衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能衰退，最 终自然死亡的过程。
Developmental signals
Environmental signals
Decrease in photosynthesis,
activation of senescence program
可溶性蛋白质含量的计算
可溶性蛋白含量 (μg/g.FW)=标准曲线上查得的 蛋白质量（ μg ） × 提取液体积/（测定加样 量*鲜重）
植物衰老生理2
Hale Waihona Puke 植物组织中 丙二醛的测定MDA测定
MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA) 反应，形成三甲基复合物，该复合物 – 最大吸收峰在532nm处；最小吸收峰 600nm处 – 消光系数为155 (mM)-1 cm-1
l （但是,在水性条件下NBT还原法得到的甲腙是蓝色混悬 液,做长时程分析时沉淀表现尤为突出,属分光光度法检 测的极端条件,使得该法实验数据重现性差;同时,在 560nm波长对此法产生的甲腙进行检测,即使加入过量的 SOD,也无法获得100%的对O2.-抑制率.为此,人们在增加 甲腙水溶性方面做了许多改良,如添加Met、SDS、BSA 助溶以及采用水溶性更好的四唑类替代物等。）
大豆蛋白的可溶性检测
大豆蛋白的可溶性检测大豆蛋白的可溶性检测1. 引言大豆蛋白作为一种重要的植物蛋白质，具有丰富的营养价值和广泛的应用领域。
在食品加工、保健品、饲料等领域中，对大豆蛋白可溶性的准确检测显得尤为重要。
本文将介绍大豆蛋白的可溶性检测方法及其应用。
2. 大豆蛋白的可溶性检测方法2.1 传统方法传统方法中，常用的检测大豆蛋白可溶性的方法是重复冻融法。
该方法通过将大豆样品在低温下冷冻后解冻，将不溶性的蛋白质与溶解性的蛋白质分离出来，进而计算可溶性蛋白质的含量。
尽管该方法简单易行，但其操作过程中存在较大的误差，且耗费时间较长。
2.2 高通量方法随着科技的进步，现代生物技术为大豆蛋白可溶性的检测提供了更多便利的方法。
酶联免疫吸附测定法（ELISA）可通过与特定抗体的结合来检测大豆蛋白的可溶性。
这种方法操作简单、快速，并能提供准确的结果。
近年来，质谱法也逐渐应用于大豆蛋白的可溶性检测中。
质谱法通过测量样品中蛋白质的质量分布，来分析蛋白质的可溶性。
这种方法具有高灵敏度、高分辨率和高通量的特点。
3. 大豆蛋白可溶性检测的应用3.1 食品加工在食品加工中，大豆蛋白的可溶性直接关系到食品的品质和口感。
检测大豆蛋白可溶性的含量可以帮助生产商控制产品的蛋白质含量，从而保持食品的稳定性和一致性。
3.2 保健品大豆蛋白作为保健品的重要成分之一，其可溶性对保健功能起着关键作用。
通过检测大豆蛋白的可溶性含量，可以判断产品的营养价值和吸收效果，从而为消费者提供更好的健康保护。
3.3 饲料在饲料行业中，大豆蛋白的可溶性影响到动物的生长发育和饲料的营养价值。
检测大豆蛋白的可溶性含量，有助于饲料生产商调整饲料配方，以提供更加优质和均衡的饲料。
4. 我的观点和理解大豆蛋白的可溶性检测方法的不断发展为大豆蛋白的应用提供了更多可能性。
从传统的重复冻融法到现代的高通量方法，我们能够更准确、快速地检测大豆蛋白的可溶性含量。
在食品加工、保健品和饲料等领域中，这些检测方法对产品的品质、营养价值和吸收效果具有重要影响。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
植物组织可溶性蛋白质的测定-考马斯亮蓝G-250法
更新时间2015-5-19
1、目的：测定植物组织的可溶性蛋白含量，测定范围为100-1000ug/ml，高浓度需要稀释后测定。
小分子蛋白和肽的测定需要用福林酚试剂。
2、提取：用测定SOD （0.05M pH7.8磷酸缓冲液）或者POD （0.1 mol / L 磷酸缓冲液 （pH6.0）的提取液或者用水提取均可，但混匀后要放置0.5-1小时再离心，以充分提取。
单独测定时，取样品5g，加水50ml，破碎，冷藏存储，测前10000rpm离心10分钟备用，取样0.1-0.2ml测定（如果加水比较少，计算时应考虑材料水分）。
3、测定：以提取液为对照，以牛血清标准蛋白为标准，以考马斯亮蓝G-250为显色剂，显色2-30分钟内，在595nm 比色。
4、计算：
可溶性蛋白含量（ug/g鲜重）=测定含量（ug）*总提取体积ml/取样体积ml/鲜重g。
5、试剂配制：
5.1、牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取0.100g牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液，此液不用时应冷藏保存，可用15天。
将1000μg／mL牛血清白蛋白用提取液稀释10倍，作为工作液，浓度为100μg／mL。
5.2、考马斯亮蓝G-250蛋白显色剂：称取0.050g考马斯亮蓝G-250，溶于25mL95％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸50mL，最后用蒸馏水定容到500mL。
此溶液在常温下可放置1个月。
标准曲线及样品配制表 蛋白含量（μg） 100μg/ml标准蛋白（μl） 提取液 （μl） 考马斯亮蓝G-250显色剂 （ml）
0 0 1000
2.5 20 200 800
40 400 600 60 600 400 80 800 200
100 1000 0
样品* X（一般叶片为1000） 1000-x
*注1：样品量依据显色调整，生长旺盛期小麦叶片可溶性蛋白含量一般为1mg/g数量级。
注2：比色需用玻璃比色杯，不能用石英比色杯，因石英吸附颜色，影响测定。
注3：最好首先让比色杯吸附颜色，再测定标准样品和未知样品，可消除部分误差。
注4：因染料吸附特性决定，本曲线非直线，不要用直线模式（4次拟合较好） 注5：缓冲液对显色强度影响较大，需要使标准曲线和样品保持相同的缓冲液浓度。
注6：如果配制的考马斯亮蓝G250有沉淀，可过滤后使用，在排除其他试剂形成沉淀后，表明G250已经过期，下次不能再用。
注7：此方法消光值随时间变化巨大，最好随加染色液随测定。