愈伤灵胶囊微生物限度检查方法学验证
愈伤灵胶囊微生物限度检查方法学验证
发表时间：2013-01-16T13:21:31.187Z 来源：《医药前沿》2012年第26期供稿作者：蒋巍刘春亮2 [导读] 建立愈伤灵胶囊微生物限度检查方法。方法：人工加入5种标准菌株，测定其回收率。
蒋巍刘春亮2
(1 江苏省南京市浦口中心医院妇产科 211800)
(2 安徽省滁州市食品药品检验所 239000)
【摘要】目的：建立愈伤灵胶囊微生物限度检查方法。方法：人工加入5种标准菌株，测定其回收率。结果：细菌、霉菌及酵母菌计数采用薄膜过滤法，各试验菌回收率均大于70%。控制菌检查试验组采用直接接种法,检出了沙门菌，采用薄膜过滤法检出了大肠埃希菌和大肠菌群。结论：愈伤灵胶囊的细菌、霉菌及酵母菌计数可采用薄膜过滤法、沙门菌检查可采用直接法、大肠埃希菌和大肠菌群检查采用薄膜过滤法进行。
【关键词】愈伤灵胶囊微生物限度检查方法薄膜过滤法控制菌检查回收率【中图分类号】R318 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）26-0021-02 本品由天然地道药材精制而成，具有清热利湿、化瘀止痛、舒肝理气之功效，对各类原因引起的妇科疾病，如白带增多、阴道分泌物气味异常、阴道不规则流血、腰酸、小腹胀痛等均有较好疗效，对反复发作久治不愈者效果显著。根据药典要求,本品需接受微生物限度检查方法学验证。然而在常规检验中,许多中药及天然药物提取物本身具有抑菌活性,从而影响了其污染微生物的检出,导致药品的细菌、霉菌、酵母菌及控制菌的检出率降低，[1]会影响试验结果的可靠性,所以对有抑菌作用的中成药做微生物限度检查时,必须采用适当的方法,对含抑菌成分的供试品消除抑菌活性后,微生物限度检查结果才能反映出药品的真实污染情况，要判断检查方法的正确性和可行性,必须对所采用的检验方法进行方法验证。本论对愈伤灵胶囊的微生物限度检查法进行了两种方法验证，为该品种制定微生物限度标准提供了科学依据。
1 实验材料
1.1 样品
愈伤灵胶囊[批号：连续三批；安徽省天康药业有限公司] 1.2 培养基与缓冲液
营养肉汤、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、改良马丁琼脂培养基、改良马丁培养基、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(均由北京三药科技开发公司提供)。
1.3 验证菌种
大肠埃希菌[CMCC (B) 44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC (B) 26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC (B) 63501]、白色念珠菌[CMCC(B)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、沙门菌 [CMCC(B) 50094]均购自中国药品生物制品检定所，所有试验菌传代次数均不超过5代。
1.4 实验仪器
恒温恒湿培养箱、天平、高压蒸汽灭菌锅、霉菌培养箱、薄膜过滤器HTY-2000集菌仪 2 验证方法
2.1 菌液的制备
接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、沙门菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中,30～ 35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基斜面上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，用含0.05%（ml/ml）吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
2.2 供试液的制备[4]
取样品10g加入无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液备用。
2.3 验证菌实验组回收率方法
试验组回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落）/菌液组平均菌落数×100%；稀释剂对照组回收率=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组回收率×100%。
2.4 培养基稀释法
2.4.1试验组
取供试品的1：10供试液0.2ml和上述5种试验菌株各1ml，同时加入平皿中，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌加营养琼脂培养基20ml，白色念珠菌和黑曲霉菌加玫瑰红钠琼脂培养基20ml，待凝固后，置规定温度培养24～72小时观察结果。
2.4.2菌液组
取菌液1ml加入培养基,方法同上，测定每一菌株加的试验菌数。
2.4.3 供试液对照组
取供试液0.2ml，分别加入培养基,方法同试验组，测定供试品本底菌数。
2.4.4稀释剂对照组
取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液各0.2ml，分别加入上述制备的菌液1ml，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌加营养琼脂培养基20ml，白色念珠菌和黑曲霉菌加玫瑰红钠琼脂培养基20ml，待凝固后，置规定温度培养24～72小时观察结果。
2.5.5 实验结果
采用培养基稀释法测定该药品的回收率如下：表1—表4。