细菌转化
细菌转化的步骤
细菌转化的步骤细菌转化技术是一种在细菌体内将外源基因(新的基因)引入，从而使细菌表达新的生物酶或代谢产物的过程。
该技术不仅可以为合成生物学和微生物发酵技术提供新的功能，而且可以用于提高抗药性、去除污染物和制备新药物等方面的应用。
细菌转化过程大致可分为三个步骤：基因构建、转化及检测。
首先，基因构建是将外源基因插入到适当的载体中，以便将它们引入到细菌中。
在这一步骤中，必须提前准备好新基因，并将其与在载体中已有的基因结合起来，以便将其传递到细菌中。
这一步骤可以使用多种技术，如PCR 法、DNA合成法、DNA克隆法等。
其次，转化是将构建的基因插入到细菌体内的过程。
一般采用磁珠法将基因构建的载体与细菌混合，然后电离辐射或其他方法将基因转移到细菌体内。
最后，检测是检查转化成功的最后一步。
一般会采用PCR法、Southern Blotting法、Western Blotting法等技术，以检查细菌中是否有目标基因的表达。
如果检测结果显示目标基因的表达，则说明细菌转化成功，可以进一步研究新基因的功能和作用。
由此可见，细菌转化的整个过程包括基因构建、转化及检测三个步骤。
首先，要准备好新基因，并将其与在载体中已有的基因结合起来，以便将其传递到细菌中;其次，用磁珠法将基因构建的载体与细菌混合，然后电离辐射或其他方法将基因转移到细菌体内;最后，用PCR法、Southern Blotting法、Western Blotting法等技术检查细菌中是否有目标基因的表达。
如果检测结果显示目标基因的表达，则说明细菌转化成功，可以进一步研究新基因的功能和作用。
在实际中，细菌转化技术的应用非常广泛，如转化细菌可用于抗药性研究、环境污染物去除、生物燃料发酵、生物质转化、生物变态物质制备、药物分子设计和制备等。
因此，细菌转化技术应用在生命科学领域中有着重要的意义。
细菌转化技术的优点也十分明显，它可以更快地引入新基因，比传统的遗传转化技术更有效，并且具有较高的效率，可以大大提高细菌的生产能力和表达能力。
细菌转化实验注意事项
细菌转化实验注意事项细菌转化实验是生物学研究中常用的基本技术之一，它是将外源DNA转化到细菌细胞内，使其表达外源基因或获得新的性状。
在进行细菌转化实验时，需要注意以下几点。
一、实验器材的选择进行细菌转化实验时，需要选择适合的实验器材。
常用的器材有电转化仪、热激转化仪、化学转化等。
不同的实验器材适用于不同的实验类型，因此需要根据实验目的和要求选择合适的转化方法。
二、DNA的质量DNA的质量是影响转化效率的一个重要因素。
在进行细菌转化实验前，需要对DNA进行质量检测和纯化处理。
通常采用琼脂糖凝胶电泳和比色法检测DNA的浓度和纯度。
如果DNA质量不好，会影响细菌转化的效率和稳定性。
三、细胞的状态细菌转化实验中，细胞的状态也是至关重要的因素。
细胞的生长状态、活性和健康程度都会影响转化效率。
因此，在进行细菌转化实验前，需要对细胞进行预处理，如培养、复苏等。
同时，需要注意细胞的质量和数量，以保证实验的稳定性和可重复性。
四、转化条件的控制在进行细菌转化实验时，需要严格控制转化条件。
转化条件包括转化液的组成、温度、时间和pH等因素。
其中，转化液的组成和浓度是影响转化效率和稳定性的关键因素。
需要根据实验要求和细菌菌种的特性，选择合适的转化液组成和浓度。
五、实验记录和数据分析在进行细菌转化实验时，需要仔细记录实验过程和结果。
实验记录包括转化液的配制、细胞处理、转化条件和实验结果等。
同时，需要对实验数据进行分析和统计，以确定实验结果的可靠性和重复性。
细菌转化实验是生物学研究中常用的技术之一，它可以用于外源基因的表达、基因敲除、蛋白质表达等方面。
在进行细菌转化实验时，需要注意实验器材的选择、DNA的质量、细胞的状态、转化条件的控制和实验记录和数据分析等方面，以保证实验的稳定性和可重复性。
细菌转化的原理
细菌转化的原理
细菌转化是指将外来DNA导入细菌细胞中并使之表达的过程。
该过程主要依赖于两个主要的机制：自然转化和人工转化。
自然转化是指在自然环境下，细菌细胞利用其天然的DNA摄
入能力，直接吸收环境中的裸露DNA并将其整合到自身基因
组中。
这个过程是一种非常罕见的事件，只有一小部分细菌具备自然转化的能力。
人工转化是通过实验手段将外源的DNA分子引入细菌细胞中
的过程。
人工转化有多种方法，其中最常用的方法是通过瞬时提高细菌细胞周围环境的钙离子浓度和温度，使细胞膜通透性增加，使外源DNA能够穿过细胞膜。
一旦外源DNA进入细胞，它可以通过多种方式整合入细胞的染色体中，如重组、杂合等。
细菌转化的原理可以归纳为以下几个步骤：
1. 准备外源DNA：外源DNA可以是来自于同一物种不同菌
株的DNA，也可以是来自其他物种的DNA。
外源DNA需要
经过提取和纯化处理，以确保所使用的DNA片段是纯净的，
没有杂质。
2. 准备目标细胞：目标细胞通常是培养在富含营养物的培养基上的细菌。
在进行转化之前，细菌细胞通常会处于一种特殊状态，称为“转化态”，这种状态下细菌细胞对外源DNA更具接
受性。
3. 转化实验：将外源DNA与目标细胞混合，并通过特定的实验条件（如热。
细菌转化与转导
1. 转化（transformation）现象及实质
Griffith’s classic experiment in transformation
如何分析转化实验的结果？
R型链球菌转化为S型菌
转化的原因是什么?
R型菌得到了某种物质后转化为S型菌 已经被杀死的S型细菌中必然含有促成转化的“转 化因子” 探究“转化因子”至关重要
转化机制
人工诱导感受态（Competence）细胞
• 处于感受态时期的细胞容易接受外源DNA • 感受态受感受态蛋白的调控
• 感受态蛋白（competence-specific proteins）包括 膜相关的DNA结合蛋白、细胞壁自溶素 （autolysin） 及一些核酸酶 • 感受态细胞可以通过诱导获
Generalized transduction
“误包” 完全缺陷噬菌体
转导发生 不能复制 “断子绝孙”
Transduction, in which the donor DNA transfer is mediated by a virus
Process of transduction
特异性转导（Specialized Transduction）
2. 艾弗里确定“转化因子”
O. T. Avery
实验结论： “转化因子” 是DNA
首次证明DNA是生物的遗传物质
开辟了现代生物学的新时代
3. 转化的机制
处于感受态时期的受体细胞吸收了外源DNA片段 ，并发生了基因重组
Transformation with DNA fragments
Transformation with a plasmid
物学
5. 细菌转导（Transduction）
细菌转化的实验报告
一、实验目的1. 掌握细菌转化的基本原理和方法。
2. 熟悉电击法和热激法两种转化方法。
3. 学习如何筛选和鉴定转化子。
二、实验原理细菌转化是指将外源DNA分子导入细菌细胞内，使其获得新的遗传性状的过程。
转化过程包括：感受态细胞的制备、DNA分子的转化、转化子的筛选和鉴定。
三、实验材料1. 菌株：大肠杆菌DH5α感受态细胞。
2. 质粒载体：pUC19质粒。
3. 试剂：氯化钙（CaCl2）、无菌水、DNA分子量标准、琼脂糖、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA marker、LB培养基、抗生素（如氨苄青霉素）等。
4. 仪器：电击仪、电击杯、离心机、PCR仪、凝胶成像系统、培养箱等。
四、实验方法1. 感受态细胞的制备（1）将大肠杆菌DH5α感受态细胞接种于LB培养基，37℃培养过夜。
（2）取过夜培养的细菌，按1:100的比例加入无菌水，轻轻吹打混匀。
（3）将混匀的细菌溶液在冰浴中放置30分钟。
（4）4℃下以4000 r/min离心5分钟，弃上清。
（5）向沉淀中加入500 μL无菌水，轻轻吹打混匀。
（6）4℃下保存备用。
2. 电击转化（1）将pUC19质粒和感受态细胞按照1:1的比例混合，轻轻吹打混匀。
（2）将混合液转移到电击杯中。
（3）在电击仪上设置电压为2.5 kV，电容为25 μF，电阻为200 Ω。
（4）进行电击转化，时间约为5秒。
（5）将电击后的混合液立即加入到2 mL LB培养基中，混匀。
（6）37℃培养1小时。
3. 转化子筛选（1）将培养好的转化子涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上。
（2）37℃培养过夜。
（3）观察并记录菌落生长情况。
4. 转化子鉴定（1）取转化子菌落，提取质粒DNA。
（2）进行PCR扩增，检测质粒载体上的目的基因。
（3）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
五、实验结果与分析1. 转化子筛选经过培养，观察到平板上出现了白色菌落，表明转化成功。
2. 转化子鉴定通过PCR扩增，观察到目的基因条带，说明转化子中含有目的基因。
第四节细菌的转化
第四节细菌的转化第四节细菌的转化（⼀）基本原理指受体细菌通过直接吸收来⾃供体细菌或⼈⼯重组的含有特定基因的DNA⽚段，从⽽获得了相应遗传性状，这种现象称为细菌转化。
细菌转化的过程是⼀个DNA 导⼊和表达的过程。
受体菌的⽣理状态是影响转化率的⾸要因素。
实验室常⽤的转化细菌的⽅法分为化学性感受态菌转化（Transformation of Chemical Competent Cells）和电打孔转化（Eletroporation transformation，⼜叫电击转化）。
前者需要化学⽅法处理细菌制备感受态，最为常⽤；后者虽然受体菌容易制备，也容易获得⾼转化率，但需要电转化设备。
（⼆）化学感受态细菌转化的实验步骤：1）冰上解冻感受态菌，或快速⽤⼿掌的温度解冻，但尽可能不要使细菌的温度超过0度以上。
否则转化效率下降很快。
2）取感受态菌液50-100µL加⼊消毒预冷的1.5mL EP管，再加⼊DNA 1-100ng [质粒DNA 1-10ng,连接产物40-100ng;DNA溶液的体积不超过转化总体积（菌液+DNA）的20%]。
3）冰上站⽴20-30分钟 [冰浴到热激（Heat shock）期间不得振动EP管，因为此时DNA 仅仅疏松吸附在细菌表⾯]。
调节⽔浴锅到42°C。
4）轻轻移动转化EP管⾄42°C⽔浴中，停留30秒（>45秒会使转化率下降），⽴即移回冰浴，保持2-3分钟。
5）加⼊SOC培养基300-600µL（也可加⼊LB培养基600-800µL替代SOC，后者对提⾼转化效率有利）。
6）37°C，200-250RPM,恒温摇床旋转振荡45分钟-1⼩时（亦可在37度静置1⼩时，但37°C振荡的转化率要⾼于静置。
这对于质粒DNA的转化都⽆太⼤影响，⽂库或连接产物则希望获得尽可能⾼的转化效率）。
7）铺板接种转化过的菌液。
接种菌液注意以下常识：A．根据载体质粒，选择包含合适抗菌素的琼脂板；B．根据DNA的性质，选择合适的涂布的菌液量。
细菌的基因重组方式
细菌的基因重组方式
细菌的基因重组方式主要有四种，分别是：
1.转化：指细菌通过细胞膜摄取周围环境中的DNA体段，并通过重组将其整合到
自身染色体中的过程。
2.接合：指DNA从活的供体细胞转移至受体细胞的过程。
在这个过程中，供体自
身的DNA在相应位点单链断开，以断开处作为起点向受体细胞转移。
转移进去的单链DNA在受体中复制，当接合中断后，形成的供体DNA以双链形式与受体的染色体DNA 进行同源联会，最后供体DNA的一条单链组合到受体的染色体DNA，形成一段异源双链区。
3.转导：以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程。
4.原生质体融合：细菌基因重组的另一种方式。
这些过程都涉及到细菌从外源取得DNA，发生基因重组合，引起原有基因的改变而导致的变异，称为基因转移。
这些基因重组方式在细菌进化和适应环境过程中起着重要作用。
细菌转化实验步骤
1.将质粒和感受态细胞从冰箱中取出，放入冰上
2.在无菌操作台中，将质粒1微升加入到感受态菌20-30微升中（不要用手捂菌，手也不要碰到EP管盖）
3.冰上30min，每隔5min轻摇EP管
4.将混合液在42℃中热激90s，将质粒粘附在感受态细胞表面，立即冰上静置1min
5.加入200微升LB培养基，轻轻摇匀，37℃振荡1-2h(45min)，使菌恢复正常
扑灭酒精灯：盖的时候多盖几下
在倒扣平板前要先让培养基吸收菌，故先正放十几分钟，然后再倒扣起码14h让菌张起来。这个过程中不要开摇晃，直h
7.挑取单克隆，扩大培养（培养基中加入相应抗生素，每100ml培养基加100微升抗生素）
37℃摇菌（不超过16h）
8.提质粒
Attention：涂布平板时三角涂布棒刚烧完后记得冷却一下！！！！！
涂布平板的方法：用枪将液体滴加到中间，然后从内往外画圆稀释菌，以便最后在边缘处得到单克隆
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实验原理
本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18 pUC18质粒携 pUC18 带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质 粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符 号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适 应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养 ，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细 胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。
对照组
对照组1 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 无菌双蒸水代替 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,其它操作与上面相同。 溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况 下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 含抗生素的LB平板上应没有菌落出现 下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 无菌双蒸水代替 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗 溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗 生素的LB平板上 LB平板 生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大 量菌落。 量菌落。
实验步骤
转化
1. 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于 冰上放置30min 2. 于42℃水浴90S ℃ 3. 冰上放置 冰上放置2min 4. 加入800µlLB液体培养基于37培养1小时 5. 将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 6. 将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个 ℃ 小时，然后观察结果
大肠杆菌感受态细胞及转化
实验目的
1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中 的意ห้องสมุดไป่ตู้。 2.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛 选转化体的方法。
实验原理
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子 引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗 传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子 遗传、基因工程等研究的基本实验技术。
转化率
统计每个培养皿中的菌落数。 统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子， 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据 此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／ 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／ 涂板菌液体积 转化频率（转化子数／ mg质粒DNA）＝转化子总数／ 质粒DNA）＝转化子总数 转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质 DNA加入量 加入量(mg) 粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数× 感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体 积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／ 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
实验结果
实验报告
写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试 剂 详细列出实验步骤； 画出实验结果的示意图并做分析，计算转化 效率。
抗Amp
宿主细菌
含Amp培养基 Amp培养基
影响转化率的因素
细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
实验仪器
超净工作台
恒温空气摇床
水浴锅
恒 温 培 养箱 养皿 培
实验试剂
大肠杆菌DH5α LB培养基 氨苄青霉素 pUC18质粒
转化中的受体细胞
转化过程所用的受体细胞一般是限制性 修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。
实验原理
转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化 学试剂法 感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性 发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通 过时细胞的状态。 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子 的受体细胞( Transformant )。