细菌转化实验步骤
格里菲斯体外转化实验过程
格里菲斯体外转化实验是一种常用的分子生物学技术，用于将外源DNA导入到细菌细胞中。
这种方法是由赫伯特·W·格里菲斯于1928年首次描述的，后来被称为“格里菲斯实验”。
以下是格里菲斯体外转化实验的基本步骤：1.准备接受细胞：首先，需要选择合适的宿主细胞，通常使用大肠杆菌（Escherichia coli）等细菌。
这些细菌通常是在培养基中生长并具有较高的转化效率。
2.制备DNA样品：接下来，需要准备含有外源DNA的样品。
这些DNA样品可以是纯化的质粒DNA、线性化的DNA片段或基因组DNA。
DNA样品通常在实验室中通过DNA提取、PCR扩增等方法获得。
3.制备质粒DNA：如果使用质粒DNA作为外源DNA，需要将质粒DNA经过适当的处理（如线性化）以提高转化效率。
4.转化实验：将目标细菌细胞与外源DNA混合，并将其暴露于特定的条件下，使DNA能够进入细胞内。
通常，这个过程需要通过热激冲（heat shock）、电穿孔（electroporation）或化学法（如钙离子诱导法）等方法来实现。
5.恢复生长：转化后的细菌需要在适当的培养条件下进行恢复生长，以使转化的DNA在细菌中复制和表达。
这通常涉及将细菌转移到富含培养基的琼脂平板上进行培养。
6.筛选与鉴定：为了确定转化是否成功，通常会使用选择性培养基或基因标记来筛选转化细胞。
成功的转化通常会导致表达外源基因或表型改变，可以通过PCR检测、酶切分析、蓝白斑筛选等方法来鉴定。
总的来说，格里菲斯体外转化实验是一种常用的方法，用于将外源DNA导入到细菌细胞中，并使其在细菌中复制和表达。
通过这种方法，研究人员可以研究基因功能、基因调控、蛋白表达等多个方面的生物学问题。
细菌转化实验原理和操作步骤
细菌转化实验原理和操作步骤转化（transformation ）是指一段同源或异源的DNA 转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。
关键词：细菌转化细菌转化一．实验目的1 ．以pGLO 质粒转化大肠杆菌为例，学习转化的基本原理及方法。
2 ．验证DNA 是遗传物质，加深对中心法则的理解。
二．实验原理转化（transformation ）是指一段同源或异源的DNA 转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。
目前常用的转化方法有CaCl 2 法( 化学转化法) 和电转化法。
本实验是用pGLO 细菌转化试剂盒中提供的pGLO 质粒来转化大肠杆菌，所用方法为CaCl 2 转化法。
pGLO 质粒：pGLO 质粒上主要含有两个基因，一个为编码绿色荧光蛋白(GFP) 的基因，一个为抗生素氨苄青霉素抗性基因。
此外，该质粒还整合有一个特殊的参与受体细胞中绿色荧光蛋白表达的基因调控体系，转化细胞中的绿色荧光蛋白基因只有在培养基中存在阿拉伯糖时才能启动表达。
转化子细胞将在不含阿拉伯糖的培养基上呈白色而在含阿拉伯糖的培养基上显绿色荧光，这种荧光在长波紫外灯下即可观察到。
三．实验材料受体菌：E.coli K12 HB101质粒：pGLO plasmid转化液（CaCl2 ）氨苄青霉素（amp ）阿拉伯糖（ara ）培养基：固体LB 、液体LB接种环、移液器等四．实验步骤1. 准备平板：每组：1 块LB 平板，2 块LB/amp 平板，1 块LB/amp/ara 平板2. 准备感受态细胞：用250 μ l 无菌水或转化液悬浮试剂盒中提供的大肠杆菌菌粉，此即感受态细胞。
3. 活化受体细胞：挑取1 环E.coli K12 HB101 菌液，于LB 培养基上37 ℃活化16-24h 。
1）在两只无菌离心管上分别标记+DNA, -DNA 。
农杆菌转化流程
农杆菌转化流程农杆菌转化流程一、农杆菌转化前准备1、必需用到的实验资料（1）转录质子DNA：需要准备好转录质子DNA，一般是由特定的宿主表达稳定贮存的转录质子DNA，或从基因构建中可以获得。
（2）农杆菌载体：以合成DNA或者从宿主菌株中获得的农杆菌载体，其中可以放置表达构建，并且有足够的特殊的鉴定序列（如PCR、Restriction digest），可以鉴定它在农杆菌中的位置。
（3）其它实验质子：比如抗性菌株、生物毒素、和其它的必需的分子质子，也可以从宿主中获得。
2、建立农杆菌转化流程（1）根据转录质子DNA、农杆菌载体和实验质子的特性，建立转化流程，确定各项步骤的操作条件。
（2）根据实验室的条件，准备好相应于上述农杆菌转化流程的实验室基础设施，如冰箱、催化器及其他必须用到的实验用品。
3、准备农杆菌显微镜试剂准备好能够激活农杆菌的显微镜试剂，比如，酶共沉淀染色液，用于检测农杆菌的运动能力； UV诱导染色液，用于分析表达的转录质子pDNA在农杆菌中的分布情况；以及抗性染色液，用于分析表达的转录质子pDNA是否具有抗性。
二、农杆菌转化操作1、消毒操作消毒操作是农杆菌转化最重要的一步，需要准备好消毒设备，以及配备灭菌盘、戴手套等安全措施，严格按照安全操作步骤，进行消毒操作。
2、培养基及农杆菌培养将农杆菌放入合适的培养基中，细菌以合适的温度培养，直到细菌数量达到目标为止。
3、农杆菌转化根据预先设计好的步骤，进行农杆菌转化操作，以及对转录质子DNA、农杆菌载体和实验质子的配比等操作，最终完成农杆菌转化操作。
4、农杆菌筛选将转化后的农杆菌通过显微镜试剂以及其他实验方法进行筛选，确定转化的成功率和转录质子DNA的表达水平。
5、农杆菌转化文库构建将转化成功的农杆菌进行分离，收集多个样本进行文库构建，用于后期实验，或者进行其它实验。
实验细菌转化
基因治疗载体
将治疗基因导入细菌中，作为基 因治疗载体，用于治疗遗传性疾
病和癌症。
实验的拓展与改进
提高转化效率
通过优化菌株、探索新的转化条件等方式，提高基因转化效率。
发展无标记基因技术
利用同源重组、转座子等手段，实现无标记基因的转化技术。
构建多功能表达载体
发展多功能、可调控的表达载体，实现多个基因的同时表达和调控。
实验安全须知
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实验操作应在生物安全柜中进 行，确保空气流通并减少微生
物气溶胶的产生。
实验人员应佩戴适当的个人防 护装备，如实验服、化学防护 眼镜、化学防护手套和实验鞋
等。
避免直接接触细菌和培养基， 使用移液器或吸管进行精确的
液体转移。
及时处理实验废弃物，按照生 物废弃物处理规定进行灭菌和
转化效率的测定方法
通过在选择性培养基上培养转化后的 细菌，计数菌落形成单位（CFU）， 并与总细胞数进行比较，计算转化效 率。
转化后细菌的表征
形态特征
通过显微观察，比较转化 前后的细菌形态是否发生 变化。
生化特性
检测转化后细菌的生化特 性，如酶活性、代谢产物 等，以评估转化是否影响 细菌的基本生物过程。
利用细菌转化技术，将生物可降解 材料基因导入细菌中，生产可降解 的生物材料。
生物燃料生产
通过基因工程手段将光合细菌转化 为生物燃料生产菌株，实现生物燃 料的低成本生产。
在医学领域的应用
疫苗生产
利用细菌转化技术，将病原微生 物的抗原基因导入细菌中，生产
疫苗。
抗生素生产
通过基因工程手段改良细菌，提 高抗生素的产量和效价。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
遗传学实验-细菌转化
五、实验步骤
（一）感受态的制备 1、E. Coli涂布于平板（Amp-），37℃，培养12h； 2、挑取单菌落，转移至盛有200mL LB的500mL三 角瓶中，37℃，振荡（200r/min）培养12h；
3、吸取1mL菌液，转移至盛有100mL LB的200mL三角瓶 中，37℃，振荡（200r/min）培养2~3h，每隔0.5h测OD600 值； 4、当OD600=0.3~0.4（对数生长期的OD600=0.6）取出； 冰上放置10~60min； 5、4℃，5000rpm，离心10min，弃上清； 6、冰预冷的0.1mol/L CaCl2 10mL悬浮细胞； 7、冰上放置15min； 8、4℃，5000rpm，离心10min，弃上清； 9、冰预冷的0.1mol/L CaCl2 2mL悬浮细胞； 10、用于转化实验；若需保存，加入终浓度15%的甘油， -70℃保存。
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 将上述沉淀重悬于100μL冰预冷的溶液Ⅰ 将上述沉淀重悬于100μL冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈 100μL冰预冷的溶液 震荡（须使沉淀完全分散）； 震荡（须使沉淀完全分散）； 加入200μL溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管 加入200μL溶液Ⅱ 盖紧管口， 200μL溶液 5~10次 5~10次； 加入150μL冰预冷的溶液Ⅲ 盖紧管口， 150μL冰预冷的溶液 加入150μL冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和地颠 倒离心管5~10次； 倒离心管5~10次 5~10 10000r/min离心5min； 离心5min 10000r/min离心5min； 上清转移到另一新1.5mL离心管中； 1.5mL离心管中 上清转移到另一新1.5mL离心管中； 加入2倍体积的乙醇，充分混匀，室温放置2min 2min（ 加入2倍体积的乙醇，充分混匀，室温放置2min（若 沉淀不充分，可加入1/10体积3mol/L的醋酸钠）； 1/10体积3mol/L的醋酸钠 沉淀不充分，可加入1/10体积3mol/L的醋酸钠）； 10000r/min离心5min； 离心5min 10000r/min离心5min； 弃上清，干燥沉淀； 弃上清，干燥沉淀； TE溶解沉淀 保存。 溶解沉淀， 加TE溶解沉淀，保存。
细菌转化与平板筛选
➢载体：载体性质、空间结构、插入片段大小等 ➢受体细胞：受体细胞与载体的匹配度 ➢转化方法：受体细胞的预处理、供受体的比例、转化过程等
转化率
（四）转化细胞的扩增
❖扩增操作
❖ 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短 时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作 偶联在一起，如：
❖ Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时 ❖ 原生质体转化后的再生过程 ❖ λ噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作
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2.各种基因工程受体的特性
酵母菌
具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养 简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定
内源性蛋白产物种类繁多且含量高
适用于外源DNA的扩增DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌
❖Ca 2+诱导的完整细菌细胞的转化
适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理 是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用， 使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态
50-100mmol/L CaCl2
受体细菌
感受态细菌
CaCl2处理
重组体转入 细菌
分子生物学实验
实验四
细菌的转化与平板筛选
2021
实验目的
❖ 通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转 化的方法和技术以及重组子鉴定的方法。
仪器、材料与试剂
❖ (一) 仪器和材料 ❖ 超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、恒温水浴、离心管、
试管、培养皿、锥形瓶、接种针、玻璃涂棒、酒精灯、镊子、牙签、
具有较高的转化效率，容易导入重组DNA分子 具有与载体选择标记互补的表型
细菌转化的原理
细菌转化的原理
细菌转化是指将外来DNA导入细菌细胞中并使之表达的过程。
该过程主要依赖于两个主要的机制：自然转化和人工转化。
自然转化是指在自然环境下，细菌细胞利用其天然的DNA摄
入能力，直接吸收环境中的裸露DNA并将其整合到自身基因
组中。
这个过程是一种非常罕见的事件，只有一小部分细菌具备自然转化的能力。
人工转化是通过实验手段将外源的DNA分子引入细菌细胞中
的过程。
人工转化有多种方法，其中最常用的方法是通过瞬时提高细菌细胞周围环境的钙离子浓度和温度，使细胞膜通透性增加，使外源DNA能够穿过细胞膜。
一旦外源DNA进入细胞，它可以通过多种方式整合入细胞的染色体中，如重组、杂合等。
细菌转化的原理可以归纳为以下几个步骤：
1. 准备外源DNA：外源DNA可以是来自于同一物种不同菌
株的DNA，也可以是来自其他物种的DNA。
外源DNA需要
经过提取和纯化处理，以确保所使用的DNA片段是纯净的，
没有杂质。
2. 准备目标细胞：目标细胞通常是培养在富含营养物的培养基上的细菌。
在进行转化之前，细菌细胞通常会处于一种特殊状态，称为“转化态”，这种状态下细菌细胞对外源DNA更具接
受性。
3. 转化实验：将外源DNA与目标细胞混合，并通过特定的实验条件（如热。
格里菲斯肺炎双球菌转化实验
★★首先 ,DNA 分子有变性和复性的特点 .变性通俗点说就是性质改变 ,跟蛋白质 的变性意思差不多 .但是 DNA 不同 ,它又可以复性 ,就是恢复原本性质 . 而变性复性主要通过加热 ,使双链解开 ,再温度恢复 ,使原本解开的双链又重新聚 合.所以,你看书上说 ," 加热杀死的 S 型细菌".当然细菌的其他成分比如蛋白质就不 可逆地变性了 .但是 DNA 也通过将双链解开变性 .再将其和R 型细菌混合，那么，在细菌进行裂殖时,R 型细菌的DNA 也会解开， 那么,再降温的时候 ,就有可能 R 型细菌和 S 型细菌的 DNA 聚合,这样的话,形成 的新的子代细菌就会表示出双链 DNA 就会有一条链是 S 型的,另一条链是 R 型 的. 因此新的子代细菌就会表达出致病基因 .是的，可以发生。
如 S 型菌是获得了 R 型菌的 D N A ，并且整合到了自己的 DNA 上，这就是一个重组的过程啊。
不要以为重组就只是减数分裂时发生的。
无荚膜的 R 型细菌有非常重要的 “感受态因子 ”位点，保证了 S 型细菌的DNA 可以进入。
S 型细菌有荚膜，无 “感受态因子 ”位点，不能作为受体菌直接培养而 发生转化。
那么 S 型细菌有可能变成 R 型细菌吗 ?当然有!转化之所以会发生：一、因为R 型与S 型的DNA 可以同源区段配对, 形成 R 型和 S 型两种后代，不象许多人认为的（ 二、无荚膜的 R 型有非常重要的感受态, 保证了 S 型的 DNA 可以进入。
反之则 不会发生：S 型有荚膜，无感受态，不能作为受体菌，若人为除去荚膜，培养出 无荚膜的后代,它就同时丧失了毒性,变成 R 型,当然就会有了感受态。
三、真核生物的细胞膜表面结构与原核生物的大不相同， 不会发生转化 （转化本 身只发生在同种菌株间或近缘菌株间） 。
我们可以放心去吃想吃的东西， 包括被 加热杀死的 S 型肺炎双球菌。
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2015.11.01细菌转化：
1.将质粒和感受态细胞从冰箱中取出，放入冰上
2.在无菌操作台中，将质粒1微升加入到感受态菌20-30微升中（不要用手捂菌，手也不要碰到EP管盖）
3.冰上30min，每隔5min轻摇EP管
4.将混合液在42℃中热激90s，将质粒粘附在感受态细胞表面，立即冰上静置1min
5.加入200微升LB培养基，轻轻摇匀，37℃振荡1-2h(45min)，使菌恢复正常
6.涂板，倒扣平板12-24h
7.挑取单克隆，扩大培养（培养基中加入相应抗生素，每100ml培养基加100微升抗生素）37℃摇菌（不超过16h）
8.提质粒
Attention：涂布平板时三角涂布棒刚烧完后记得冷却一下！！！！！
涂布平板的方法：用枪将液体滴加到中间，然后从内往外画圆稀释菌，以便最后在边缘处得到单克隆
扑灭酒精灯：盖的时候多盖几下
在倒扣平板前要先让培养基吸收菌，故先正放十几分钟，然后再倒扣起码14h 让菌张起来。
这个过程中不要开摇晃，直接37℃放置就好。