端氨基聚(醚-氨酯-酰胺)配体及磁共振成像造影剂研究

322收稿,22修稿;国家高技术研究发展计划(63计划,项目号3)和国家自然科学基金项目(基金号)资助项目;33通讯联系人,2@研究简报端氨基聚(醚2氨酯2酰胺)配体及磁共振成像造影剂研究3宋春梅133　薛海丽1　李建奇2　余亦华2　彭　敏2　钱 3　杜　冰3　谢美然1　陈　群2(华东师范大学　1化学系　2物理系　3生物系　上海　200062)摘　要　设计合成了一种端氨基聚(醚2氨酯)PE U 2((CH 2)6NH 2)2(Ⅱ),以Ⅱ为原料制备端氨基聚(醚2氨酯2酰胺)PE U ΠDT PA 共聚物造影剂配体(Ⅲ).Ⅲ的特点为(1)大分子配体的端基为—(CH 2)6—NH 2,柔性间隔基较长,可克服较大的空间位阻,与靶向性物质(如靶向多肽、蛋白质)反应;(2)原料Ⅱ为采用聚氨酯反应制备,亲水亲油链段长短、种类可控性好,实验条件简单;(3)端氨基可以在温和条件下与多肽等反应.大分子配体Ⅲ与G d3+络合制备了相应的G d 3+配合物(Ⅳ),研究了Ⅳ的弛豫性能,磁共振成像(MRI )结果表明,合成的造影剂Ⅳ纵向弛豫速率(R 1)与医用造影剂钆喷酸葡胺G d 2DTPA 相比提高了38140%,在裸鼠肝脏内信号增强率在011、6、12、24h 分别是G d 2DT PA 最大信号增强的115、3、118和113倍,在体内的半衰期明显延长.用IR 、N MR 、G PC 、官能团滴定、ICP 等方法表征产物.关键词　端氨基聚(醚2氨酯2酰胺),磁共振成像造影剂,载体,弛豫速率 分子成像是世界上最热的研究领域[1,2],美国5年前NIH (National I nstitutes of Health )设立了专门的生物医药成像研究所,用专项基金支持该领域研究.MRI 磁共振技术跟踪监控基因转导过程属于近年来新领域,评价新的癌症药物的靶向性及疗效.临床常用的造影剂G d 2DTPA 是与钆配位最稳定的小分子离子型造影剂,体内渗透压较高,在体内存留时间较短,易经肾脏代谢后迅速排除.近年来的研究主要是对二亚乙基三胺五乙酸(DTPA )和1,4,7,102四氮杂环十二烷21,4,7,102四乙酸(DOTA )类修饰,制备各种造影剂.研究方向为(1)非离子化;(2)靶向性;(3)大分子化.大分子化可制备血池造影剂、延长半衰期.Zhuo 等[3]最早作了大量卓有成效的工作,合成了一系列的聚酯、聚酰胺以及聚酯2聚酰胺共聚物G d 3+造影剂等;W ei ssleder 等[4]在聚赖氨酸(P LL )侧链氨基上连接D OTA 配体.S ander 等[5]将G d 2DTP A 共价偶联到聚丙烯亚胺树形高分子表面得到G d3+造影剂,每种方法各有优缺点.但是通过较短的实验路线,设计合成可以在水中室温条件下与靶向多肽、蛋白质偶联的胺基的大分子配体较少,端基为—(CH 2)6—NH 2的造影剂鲜见报道.本文的工作是要设计一种可以在温和条件下与多肽等反应的大分子造影剂,为满足要求,大分子造影剂要具有可反应官能团、半衰期长、造影效果增强,降低对动物及人体的毒害性.聚乙二醇(PEG )又称聚氧乙烯醚(PEO)是美国食品药品管理局(F D A)批准的载体,有良好的亲水性和生物、血液相容性,无免疫原性[6,7],常用来修饰蛋白质、多肽、酶等生化药物和生物医用材料[8,9];G d 3+自旋增强效果最好,DTPA 螯合效果最好;但商用PEG 价格昂贵,品种有限,氨基端为—OCH 2CH 2NH 2,柔性间隔基短,不利于与有较大空间位阻、官能团为侧基的其它功能基反应.多肽、蛋白质、酶等具有庞大空间位阻,蛋白质大分子为球状等立体结构,其可反应官能团往往蜷曲在球体内部或表面,且侧基较短,这时端基为—OCH 2CH 2NH 2的PEG 只能对部分蛋白质有修饰性,不能克服空间位阻深入到蛋白质内部反应.本文制备含氨端基的聚(醚2氨酯)Ⅱ,柔性间隔基CH 2多,能克服空间位阻,可偶联的生物活性物质种类更多.并且用本方法合成的PEG,具有亲水亲油链段长短、种类可控性好,能满足不同器官亲和性要求,实验条件简单,无易燃易爆性,有利于应用.进一步制备了端氨基聚(醚2氨酯2酰胺)Ⅲ和第3期2009年3月高　分　子　学　报ACTA P O LY MERIC A SI NI CAN o.3Mar.,2009200808112008092882004AA 0208020474017E m ail :cm s ong chem 278相应的G d3+配合物Ⅳ,研究了Ⅳ的性能.1　实验试剂二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、聚乙二醇(PEG2000,Mn=2000)、无水乙醇(CP)和无水乙醚均为CP级;1,62己二胺、三氧化二钆(G d2O3)、二月桂酸二丁基锡(D BT D L)、乙酸酐、甲苯、三乙胺、N, N2二甲基甲酰胺(D MF)和吡啶均为AR级,国药集团化学试剂有限公司,上述试剂均经干燥;异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI,Bayer公司);高纯氯化钆(99199%,Sigama),P BS缓冲液(pH=714);D MF色谱级;二亚乙基三胺五乙酸酐DTP A A(Ⅰ)实验室合成[10],产物熔点(m p)178～184℃(分解)与文献值一致[10],1H2N MR(D MS O2d6,δ):3171(s,8H),3131 (s,2H),2177～2173(t,4H),2163～2156(t,4H).2　端氨基聚(醚2氨酯)(Ⅱ)合成211　预聚体OC N2PEU2NC O合成 在三口瓶中加入I PDI(613m L,30m mol),D BTD L(01075w t%),通N2,搅拌,使油浴稳定在60℃后把30g PEG2000的甲苯溶液缓慢滴入三口瓶中,反应5h;冷却后,滴定预聚物NC O值为11081%.212　端氨基聚(醚2氨酯)合成 在上述预聚物加入17145g(150147mm ol)己二胺的甲苯溶液82 m L,通N2,搅拌,室温反应3h;减压蒸出甲苯,用无水乙醇重结晶4次,真空干燥得白色粉末状产物Ⅱ3515g,产率8714%,分子式简写为H2N2 (CH2)62PEU2(CH2)6NH2;产物Ⅱ滴定得NH2含量为012609mm olΠg样品.G PC方法测得数均分子量为8200,分子量分布指数d为112.见示意图1.S chem e1　S ynthesis of(Ⅱ)and(Ⅲ)3　端氨基聚(醚2氨酯2酰胺)配体(Ⅲ)的合成取Ⅱ(21137g,51580mmol NH2)于单口瓶中,搅拌使其溶于130mL无水DMF;再取Ⅰ(01500g,1139mm ol)加热使其溶于20m L无水D MF,冷却后转入恒压滴液漏斗,滴加入单口瓶中,磁力搅拌下室温反应,反应液黏度明显增大;减压蒸出D MF,用无水乙醇重结晶,真空干燥得白色粉末状产物Ⅲ1917g,产率9010%,见示意图1.4　端氨基聚(醚2氨酯2酰胺)的钆配合物(Ⅳ)的合成将含DT的配体Ⅲ溶于蒸馏水中,加入含G3+离子为1ΠL的氯化钆标准溶9723期宋春梅等:端氨基聚(醚2氨酯2酰胺)配体及磁共振成像造影剂研究24h1mm ol PAd09mm ol液,室温搅拌反应24h ,用透析袋透析72h ,每隔8h 换透析液一次,把透析内液蒸干后,再用无水乙醇重结晶,真空干燥后得白色粉末状产物Ⅳ,简写为PEU 2G d 2DTPA.5　测试仪器及方法使用Nic olet Nexus 670FT 2IR 红外仪进行红外光谱测定,均为K Br 压片;Bruker DRX 500MH z 核磁共振波谱仪进行核磁共振测定,四甲基硅烷(T MS)为内标,溶剂为氘代二甲亚砜D MS O 2d 6或氘代氯仿CDC l 3;由SG W X 24显微熔点仪测定熔点;胺基滴定法测定分子量;凝胶渗透色谱(G PC )采用W aters 1525型凝胶渗透色谱仪,流动相为D MF ;官能团滴定采用胺基测定[11];异氰酸酯测定参照HG ΠT 2409292,DTP A 含量测定[12].6　合成的大分子钆配合物造影剂(Ⅳ)的研究611　钆含量测定 用电感耦合等离子体I CP(radio frequency inductively coupled plasma)发射光谱分析方法测定.机器型号IRIS I ntrepid 11X SP Therm o E lemental.用浓硝酸硝化使样品分解,在容量瓶中稀释定容.612　弛豫时间测定 将合成的造影剂Ⅳ和商品造影剂(G d 2DTP A )配成钆含量在10～40mg ΠL 之间的一系列水溶液,环境温度为23℃,013T 永磁开放磁共振成像仪上,测得纯水质子和配合物溶液中水质子的弛豫时间.测量序列,I R 2FI D (TI:10、30、50、100、200、500、700、1000、1500、2000和3000ms ).613　器官增强效果比较 用合成造影剂Ⅳ和商品造影剂(G d 2DTPA )配成相同浓度的水溶液,且注射量相同,观察正常裸鼠体内器官造影增强效果.样品浓度5mm ol ΠL ,500μL ;G E T win S peed 115T MRI ;注射方法,团注;成像方法优化,716cm 表面线圈接收,线圈空间敏感性校正;取10只裸鼠,分成两组,每只裸鼠多时间段观察.7　共聚物的表征711　端氨基聚(醚2氨酯)表征 产物Ⅱ的I R谱图见图1中曲线c ,其中氨酯键(—NHC O O —)中的C O 伸缩振动特征峰为1716cm -1,脲键(—NH C ONH —)中的C O 伸缩振动特征峰为1650cm-1,N —H 弯曲振动特征峰为1559cm -1,而原料PEG (见图1中曲线b )则无上述特征峰.3304～3128cm -1为NH 2中—N —H ,—NH 2CO O —,—NHC O NH —及分子间氢键.产物Ⅱ的1H 2N MR (CD Cl 3)谱图及归属见图2.δ=4150～6100(a ,b ,c ),4116(d ,e ),3145～3175(f ,g ),3109(h ),2186(i),2159(j),1183(k ,l),1163(m ,n),1128～1150(o ,p ),1113(q ),0183～1100[13,14](r ,s ,t ).Fig.1　The IR s pectra of (Ⅰ),PEG,(Ⅱ)and (Ⅲ)Curve a (Ⅰ);C urve b PEG;Curve c (Ⅱ);C urve d (Ⅲ)F T 2NMR f (Ⅱ)82高 分 子 学 报2009年ig.2he 1H spectrum oFig.3　T he1H2NMR s pectrum of(Ⅲ)712　端氨基聚(醚2氨酯2酰胺)配体Ⅲ表征 产物Ⅲ的I R谱图(见图1中曲线d),与Ⅱ的IR谱图比较,发生了以下明显的变化.在Ⅲ的IR谱中,在1650cm-1处出现了酰胺键峰,以肩峰的形式存在于1653cm-1脲键峰位处.而且氨酯键和脲键的相对峰强发生了很大的变化,在Ⅱ的IR谱图中1716cm-1处的氨酯键特征峰强度远远大于1650 cm-1处脲键特征峰强度,而由于Ⅱ与DTPA A开环形成的酰胺键在1650cm-1处与脲键峰重叠,所以造成产物Ⅲ在1716cm-1处的氨酯键特征峰强度远远小于1653cm-1处脲键和酰胺键的特征峰强度,而且Ⅲ在3431～3131cm-1中由于C O OH中—O—H的伸缩振动,强度增加;1399cm-1和1385 cm-1处由于C OOH二聚体的OH的弯曲振动和C—O的伸缩振动的偶合,峰的相对强度也增强了很多,在2886、1463、1360、1343、1303、1280和1243 cm-1处峰强均减弱.与DTPA A的I R谱图(见图1中曲线a)比较,其中在1821和1775cm-1[3]处的酸酐特征峰消失.1H2N MR(C DCl3)谱图与聚合物中对应氢质子的归属见图3.δ=8100(a,a′), 4150～6100(b,c,d,e),4116(f,g,h,i,j),3147～3175(k,l),3114(m,n,o),2190～2192(p,q), 1183(r,s),1170(t,u),1133～1145(v,w),1117 (x),0186～1104(y,z,δ).对产物Ⅲ进行氨基官能团滴定,得到胺基(NH2)含量为010964mm olΠg样品,求出Ⅲ平均分子量为1×,滴定得DT含量为1Π样品G方法测得数均分子量为1×104,分子量分布指数d为115.8　造影剂Ⅳ与Gd2DTPA性能比较811　弛豫率比较 好的MRI造影剂,应当具有较高的弛豫速率(R1),可获得清晰的成像效果.顺磁性金属离子配合物能减小组织中水质子的弛豫时间,从而增加磁共振信号的对比度.它对水质子弛豫时间的减小程度可用弛豫速率来表示.体外测试弛豫速率,公式如下1ΠT1ob sd=1ΠT1d+R1[M][M]为配合物溶液中钆的浓度,测纯水质子的弛豫时间T1d和配合物溶液中水质子的弛豫时间T1ob sd,计算配合物的纵向弛豫速率R1.ICP测得造影剂钆配合物Ⅳ的钆含量为0188w t%,R1为8121(m molΠL)-1s-1,临床应用的G d2DTPA的R1为5193(mm olΠL)-1s-1,Ⅳ的R1提高了38140%,Ⅳ的造影效果好.812　器官造影增强效果比较 用合成的造影剂钆配合物Ⅳ和商品造影剂(G d2DTPA)配成相同浓度的水溶液,且注射量相同,取10只裸鼠,分成两组,多时间段(011、6、12和24h)观察每只裸鼠体内器官造影增强效果,取平均值(见图4).G d2 DTPA的最大信号增强在011h时刻.Ⅳ在011h、12h肝脏内信号增强率分别是G d2DTPA最大信号增强的115倍和118倍,在6h信号增强是G d2 DTPA最大信号增强的3倍.G d2DTP A在肝脏6h 后无增强,而Ⅳ在肝脏24h信号增强是G d2DTPA 最大信号增强的13倍,Ⅳ在肝脏的半衰期明显延长1823期宋春梅等:端氨基聚(醚2氨酯2酰胺)配体及磁共振成像造影剂研究21104P A00804 mm ol g.PC211 .Fig.4　The im agi ng effect of (Ⅳ)and G d 2DTP A in li ver9　结论(1)用简便的方法合成了新型的PEU 2((CH 2)6NH 2)2Ⅱ和端氨基聚(醚2氨酯2酰胺)共聚物配体Ⅲ.(2)合成了端氨基聚(醚2氨酯2酰胺)G d3+造影剂Ⅳ,Ⅳ的纵向弛豫速率R 1与G d 2DTPA 相比提高了38140%,且在011、6、12、24h 肝脏内信号增强率分别是G d 2DTPA 最大信号增强的115、3、118和113倍,半衰期明显延长.REFEREN CES1　Downi ng G .Science ,2005,310(18):1132～11342　S ervice R F.S cience ,2004,305(10):15593　Luo Y i (罗毅),Zhuo Renxi (卓仁禧),Fan Changlie(范昌烈).Chem ical Journal of Chinese Univers ity(高等学校化学学报),1995,16(9):1476～14794　W eiss leder R ,B ogdanov A ,Tung C H ,Weinm ann H J.Bi oconjug C hem ,2001,12(2):213～2195　Langereis S,Luss anet Q G,G enderen M H P V ,Mei j er E W,Beet s 2Tan R G H ,G rif fi oen A W,Engel s hoven J M A V ,B ackes W alter H.NMR B iomed ,2006,19(1):133～1416　R obert s M J ,Bentley M D ,Harris J M.Advanced Drug Delivery R evi e ws ,2002,54:459～4767　Bail on P ,P al l er oni A ,S cha ffer C A ,Spence C L ,Fung W J ,P orter J E ,Ehrlich G K ,Pan W,Xu Z X,Modi M W,Farid A ,B erthol d W ,G raves M.B ioconj ug Chem ,2001,12(2):195～2028　C aliceti P ,Veronese F M.Adv Drug Deliv Revi 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Department ,3Biology D epartment ,East China Normal Uni versi t y ,Shanghai 200062)Abstract T o develop and characterize a ne w class of potential blood pool magnetic res onance (MR )c ontrast agentsw hich could be used as cancer target gene delivery carrier ,novel gadoli nium am i n o group terminated poly (ether 2uret hane 2amide)Πdiethylenetr iam ine pentaacetic acid (PEU 2G d 2DTP A)polymeric chelate (Ⅳ)was synthesized.The amino group terminated poly (ether 2urethane 2amide )Πdiethylenetriamine pentaacetic acid (PEU ΠDTPA )copolymer ligand (Ⅲ)could be designed and obtained fr om the reaction of diethylenetriamine pentaacetic acid dianhydride (DTP AA ,Ⅰ)w ith amino gr oup terminated PEU (PEU 2((CH 2)6NH 2)2)(Ⅱ),which w as prepared in high yield by the reaction of polyethylene glyc ol (PEG)w ith isophor one dii s ocyanate (IP DI)and t hen wit h hexam ethylene diamine.Ligand Ⅲwas then coordinated w ith G d 3+ion to give the macr om olecular contrast agent Ⅳin w ater at room temperature.The structure analysis and characterization of DTPA A ,Ⅱ,Ⅲwere studied by IR ,NMR ,G PC ,and functional gr oup titration methods.G adolinium c ontent of the polymeric chelate Ⅳwas 0188w t %,which was determ ined by radio frequency inductively c oupled plasma (ICP)spectra.In vit r o relaxivity (R 1)studies of Ⅳshowed a 38140%increase in R 1relaxivity c om pared with gadolinium 2diethylenetriamine pentaacetic aciddimeglumine (G d 2DTP A )injection.The R 1values f or G d 2DTPA and Ⅳw ere 5193and 8121(mm ol ΠL )-1s -1,respectively.In vivo di stribution of G d 2DTP A and Ⅳwas studied at magnetic resonance imaging (MRI )be fore injection ,011,6,12and 24h after injection ,w ith assessment of liver signal i ntensity (SI )i n 10nude mice.The liver signal enhancement rates of Ⅳat 011,6,12and 24h are 115,3,118and 113times ,respectively ,com pared w ith the largest signal intensity 0133of G d 2DTPA observed at 011h.The half 2life of Ⅳin liver w as as longer as 24h ,while no signal enhancement w as observed after 6hours injection of G d 2DTP A.Ⅳhad als o a longer circulation life.K eyw or ds Amino gr oup terminated PE U ΠDTPA copolymer ,MRI contrast agents ,Carrier ,Relaxivity3823期宋春梅等:端氨基聚(醚2氨酯2酰胺)配体及磁共振成像造影剂研究。