western实验原理及步骤
western实验原理及步骤
western实验原理及步骤
western实验是一种分子生物学技术，它可以用来检测特定蛋白质的表达水平。它的原理是将细胞内的蛋白质从细胞内取出，然后通过电泳来分离，最后将蛋白质用特定的抗体标记，然后用荧光染料检测，最后用荧光显微镜检测，从而检测特定蛋白质的表达水平。Western实验的步骤包括：
1. 准备实验样本：首先准备实验样本，一般是细胞系或者组织样本，将其分离和提取蛋白质。
2. 电泳：将提取的蛋白质放入凝胶中，然后加入电流，使蛋白质受到电流的作用，从而分离不同的蛋白质。
3. 标记：将分离的蛋白质用特定的抗体标记，以便检测。
4. 检测：将标记的蛋白质用荧光染料检测，然后用荧光显微镜检测，从而检测特定蛋白质的表达水平。
western实验的原理是将细胞内的蛋白质从细胞内取出，然后通过电泳来分离，最后将蛋白质用特定的抗体标记，然后用荧光染料检测，最后用荧光显微镜检测，从而检测特定蛋白质的表达水平。步骤包括准备实验样本、电泳、标记和检测。
westernblot原理及步骤
一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 western显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 三、主要试剂
1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。 3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。 4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O 中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。 5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制. 6、SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
westernblot原理及步骤
免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 Western Blot技术： 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 western显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 三、主要试剂 1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH 不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。 3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和 48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。 4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于 40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。 5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑
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一、配胶 原理： 30% acrylamide mix：产生凝胶的基本物质 1.5M Tris(ph 8.8) ：使分离胶PH为8.8（与甘氨酸的pka接近，从而使不同分子量的蛋白产生不同的电泳速度，从而使不同分子量的蛋白分开）1.0MTris(ph 6.8)：使浓缩胶PH为6.8（可以通过甘氨酸和氯离子的作用产生压缩，从而使蛋白条带压细） 10% SDS阴离子去污剂：断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质二三级结构，消除蛋白质在迁移过程中结构的影响。与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物，由于SDS带有大量负电荷，蛋白质本身的电荷被掩盖，从而消除蛋白质迁移过程中自身电荷的差异造成的影响。同时能够助溶，蛋白质变为亲水，容易在水相中迁移。每克多肽可以与1.4g 去污剂结合，当分子量在15kd-200kd之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，logMW（分子量）=K-bx（迁移率）AP：提供acr丙烯酰胺和bis亚甲丙烯酰胺聚合的氧自由基，是acr 和bis聚合的引发剂 TEMED：催化AP释放氧自由基，是反应的催化剂 1、清洗干净1.5mm或1mm玻璃板，检漏（有豁口和字的朝上） 2、倒掉水，配10ml 10%的分离胶（1.5mm板需要7ml，1mm 板需要4.5ml） 10%方案如下： H2O 4.0ml
30% acrylamide mix 3.3ml 1.5M Tris(ph 8.8) 2.5ml 10% SDS 0.1ml 10% ammonium persulfate 0.1ml TEMED 0.004ml 3、混合后上下摇晃，注意不要放在手中配（否则温度太高凝固的快），静置15s后用1ml枪二档吸一档打（在一角加即可，不用来回加，否则容易出气泡。不过出气泡了也没事，加水压一下就浮上来了） 4、加进玻璃板中，随后均匀来回加水到满 5、等待20分钟 6、倒掉水，将架子倒置过来让水排干，用纸巾擦拭斜角（一定要擦干净所有的水！否则两层胶之间出现水层就废了），同时配浓缩胶4ml H2O 2.7ml 30% acrylamide mix 0.67ml 1.0M Tris(ph 6.8) 0.5ml 10% SDS 0.04ml 10% ammonium persulfate 0.04ml TEMED 0.004ml 7、加满分离胶后插入1.5mm或1mm的梳子，注意不要有气泡，
WB实验的基本原理及操作流程
WB实验的基本原理及操作流程 【实验原理】 一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western(西)印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合，然后用另一种蛋自质，如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG检测已结合上去的抗体。本法所需时间6小时或过夜。 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)设计的，样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含 Tris-Cl(pH8.8)的。系统中所有组分都含有0.1％的SDS(Laemmli, 1970)，样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 【常用试剂】 1)30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺
westernblot原理及步骤
Western Blot的原理及步骤 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。 1.收集蛋白样品（Protein sample preparation） 可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分）维持4℃。加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟。移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟。上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度。【具体方法】 2.电泳（Electrophoresis） （1）SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，【配制方法根据分离的目的蛋白的分子量大小选择凝胶浓度】 （2）样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。（3）上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。【预染marker？】 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V 左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。 3.转膜（Transfer）【转膜缓冲液】 我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜（NC膜）也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹
Western Blot 操作原理步骤
Western Blot 操作原理步骤Western Bl... 基本原理【动画】 免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。 典型的印迹实验包括三个步骤： ①蛋白质的电泳分离 ②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域 ③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。 免疫印迹法原理示意图 第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS 处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。 第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选
用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。 第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。 本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。 样本的制备 几乎任何蛋白质都可用于免疫印迹。免疫印迹的优势是能分析不能用其他的免疫化学技术进行研究的蛋白质样品。例如，不能标记的蛋白质或不溶于温和抽提缓冲液的蛋白质等。免疫印迹还可分析各种组织、器官或微生物等来源的粗制样品。 用于免疫印迹的样本种类繁多，处理的方法也有所不同，为了选择理想的处理方法，应当考虑细胞的类型和待测抗原的性质。 细菌表达蛋白质和样本制备 一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解，具体方法如下： [试剂与设备] （1）表达待检测蛋白质的细菌。 （2）50mmoL／LTris-HCl（pH7.4）。 （3）2xSDS凝胶加样缓冲液： 100mmol／L Tris—HCl（pH6.8） 200mmol／L 二硫苏糖醇（DTT） 4％ SDS（电泳级） 0.2％溴酚蓝 20％甘油 不含有二硫苏糖醇（DTT）的2XSDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前须从1mol／L二硫苏糖醇储存液现用现加于上述缓冲液中。 （4）台式离心机。 （5）超声破碎仪。 （6）水浴箱。 （7）涡漩振荡器。
westernblot原理及步骤
1.western blot 即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 2.原理简单 来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 3.分类 Western Blot显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方
法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL.只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带. 4.其他 值得一提的是,western blot 这个名称的由来很有意思.最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家,但印迹的对象是DNA 链,他把这种技术称为Southern blot,后来类似的出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对RNA,一个对蛋白质,人们分别把这两种技术的称为Northern和Western,与这两个技术的发明人没有关系了.
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤 蛋白免疫印迹即Werstern blot，是将印迹技术与抗原-抗体反应的特异性相结合的检测技术，用于分离和检测生物标本中的某一特定蛋白。其基本原理实混合蛋白质样本通过凝胶电泳分离后，通过特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（NC膜或PVDF 膜）上，将针对待测蛋白的特异性抗体作用于滤膜上，利用抗体上偶联的酶降解底物在滤膜上生成有色沉淀物或化学发光产物，从而显示出待测蛋白的存在及量。 Western blot原理 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 Western blot实验步骤 一、样本制备 1、样本的来源：细胞培养上清；细胞（胞浆蛋白、胞膜蛋白、胞核蛋白）；组织匀浆 2、不同样本有不同的提取方式：蛋白完全裂解液、RIPA、胞核/胞浆 3、蛋白的提取：裂解前加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂使其终浓度为1mM 4、蛋白定量：BCA检测法(灵敏度高，操作简单，常用)、Bradford 检测法、Lowry 检测法、UV测量、电泳检测 5、样本上样前的处理：蛋白提取液和SDS上样缓冲液（Loading buffer）以一定的比例上样
6、蛋白变性：95-100℃变性5分钟（为了能使抗体接触到抗原表位，必须将蛋白的三维结构打开，因此需要将蛋白变性，核蛋白要增加裂解液体积和超声破碎次数，煮样时间延长至10-15min） 二、上样与电泳 原理：裂解后的蛋白质样本经过高速离心去除不溶物后，再经SDS上样缓冲液95-100℃变性5分钟，使带有强负电荷的SDS与带有弱电荷的蛋白质结合，大量的SDS可掩盖蛋白质本身的电荷量，只显示SDS的负电荷，在pH8.6~pH8.8的Tris-甘氨酸不连续SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）系统中，蛋白质的电泳与自身电荷量无关，只和其分子大小有关，从而将蛋白质按分子量大小顺序分离。 在进行上样之前我们需要先配置适合浓度的凝胶。 制胶过程注意： 1、玻璃板对齐后放入架中，把两侧的夹子卡紧。要使短玻璃靠外，长玻璃靠内。 2 然后垂直卡在架子上准备灌胶。操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶,灌胶前加水检漏。 3 配胶时最后一步加入TEMED后立即摇匀马上灌胶，灌胶时枪头沿着角加入，以免产生气泡。灌胶距离短玻璃板1-2cm高度即可。加水/无水乙醇封胶速度要慢，否则胶会被冲变型。 4当水和胶之间有一条明显的分界线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 5 按照前面方法制备浓缩胶，插入梳子，待胶凝固即可。注意：使梳子处于
western blot 的原理与操作方法(详细)
Western Blot 原理和操作方法（详细） $5V 工作原理 Y|-_-2IU 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用. -O{`?'Q%9v SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. }~<+{sQ PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.TIZO4Jz 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. &\$?@> &A 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. T&ZpP_] 重要参数iLo=fd78 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: 2`l#6 T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% &]\*xjs{ 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) uU o!`l H L0#p36e ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: RKB6&r5 2OJxL"mEc 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) rQ9+x6 <104 20-30 "(-pga 1×104-4×104 15-20 tu@v7?0:{F 4×104-1×105 10-15 y WB实验的基本原理及操作流程 WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验 方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。它通过将复杂的蛋白质混合 物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。 一、基本原理 WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。具体步骤如下： 1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的 处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。 2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。 3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。 4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或 脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。 5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。 6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。 7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可 检测信号物质（如酶或荧光染料）。 8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或 荧光信号。 9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录 目标蛋白质的表达。 二、操作流程 下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实 验条件而有所变化。 1.样品制备： a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。 b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。 c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。 2.SDS-电泳： a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。 b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。 c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。 3.转膜： a.准备合适大小的PVDF或硝酸纤维素膜，并剪成和凝胶一样大小。 b.部分电泳缓冲液中加入甲醇，并在此溶液中反复浸泡膜约15分钟。 c.将湿润的膜堆叠在凝胶上，并用薄厚卷或压力将其紧密连接。 d.将凝胶与膜一起转移到转膜仪中，进行电转。 westernblot原理及步骤 Wester n blot 基本原理： 在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体， 然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Wester n blot 应用： 目的蛋白的表达特性分析； 目的蛋白与其他蛋白的互作； 目的蛋白的组织定位； 目的蛋白的表达量分析； 蛋白样品的制备： 1水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般； 2有机溶剂提取法； 3离心管柱提取法：超快速，易用，高产及重复性强； 4通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。 Wester n blot 注意事项和常见问题: 1我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？ 答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS浓度，同时将 样品煮沸时间延长；也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。 2我做的蛋白质分子量很小（10 KD ），请问怎么做WB ? 答：可以选择0.2 阿的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。 3 最后显色时用DAB好还是ECM好？ 答：DAB有毒，但是比较灵敏，是HRP最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg级蛋白，具体可以根据你实验的情况。 4要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot 试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？ 答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性， 不易与背景区分；Wester n blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。 westernblot实验报告 西方印迹（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物医学研究领域。本文将介绍Western Blot实验的原理、步骤以及其在科研中的应用。 一、实验原理 Western Blot是一种通过将蛋白质分离、转移、固定和检测的技术。首先，将 待检测的蛋白质样品经过电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。接下来，将膜固定并与特定抗体反应，以检测目标蛋白质的存在和表达水平。 二、实验步骤 1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品加入蛋白负荷缓冲液，经过煮沸和离心处理，使样品变性并去除杂质。 2. 凝胶电泳：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，通电使蛋白质在凝胶中按照大 小被分离。 3. 转印：将凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通过电流使蛋白质迁移。 4. 固定膜：用甲醛等化学物质固定膜上的蛋白质，以保持其位置和结构。 5. 抗体反应：将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合形成特异性免疫复 合物。 6. 信号检测：通过添加酶标记的二抗或荧光标记的二抗，使免疫复合物发出可 检测的信号。 7. 结果分析：使用成像设备或荧光显微镜观察和记录蛋白质的表达水平。 三、应用领域 Western Blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。首先，它可以用于检测 蛋白质的存在和表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能和调控机制。其次，Western Blot还可以用于检测特定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等， 以研究这些修饰对蛋白质功能的影响。此外，Western Blot还可以用于检测蛋 白质的亚细胞定位，研究蛋白质在细胞中的分布情况。 Western Blot技术的优点在于其高灵敏度和特异性。通过选择合适的抗体，可 以实现对特定蛋白质的检测和定量。此外，Western Blot还可以同时检测多个 蛋白质，从而提高实验效率。 然而，Western Blot也存在一些局限性。首先，由于其操作步骤较多，需要较 长的实验时间。其次，Western Blot对蛋白质的大小和疏水性有一定的限制， 较大和高疏水性的蛋白质可能不易转移和检测。此外，Western Blot在定量上 也存在一定的局限性，需要结合其他技术进行验证。 总结而言，Western Blot技术是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于生物 医学研究中。通过该技术，科研人员可以检测蛋白质的存在、表达水平、修饰 状态和亚细胞定位，帮助揭示蛋白质的功能和调控机制。虽然Western Blot存 在一些局限性，但随着技术的不断发展，相信其在科研中的应用会越来越广泛。 新手指南——荧光免疫印迹〔Western Blot〕实验效劳步骤原理 一，实验原理 WB〔Western blot〕，即免疫印迹〔immunoblotting〕，是一项在分子生物学、生物化学、免疫学等领域中应用非常广泛的技术。这一技术利用抗体与组织或细胞样品中特定蛋白的特异性结合作用，根据条带的位置和强弱实现蛋白鉴定和表达分析。常用的WB显色方法是ECL 化学发光法。 而随着荧光检测的普及，许多科研人员将western blot的检测方法从化学发光转到多重荧光。这是因为荧光检测能够实现多重western blot分析，并生成可定量的精准数据满足期刊杂志对于数据发表的要求。荧光检测解决了化学发光检测所面临的一些局限性，例如：数据的重现性，半定量，动态范围等问题。所以荧光Western blot变得越来越流行。对于需要更复杂的信号线性分析和蛋白丰度相关性的研究人员来说，荧光方法是一个很好的选择。 二、荧光WB的优势： 可以同时检测多个目的蛋白： 可以区分分子量相近的蛋白： 可准确定量： 低背景，高信噪比： 线性范围更广，适合检测低丰度蛋白： 三、荧光WB技术操作步骤 蛋白样本制备及含量检测； SDS-PAGE凝胶电泳； 转膜及抗体结合反响； LI-COR Odyssey红外激光扫描成像系扫描 四、客户提供及送样要求 需检测的样品； 一抗〔可自行提供，或在本公司购置相应指标〕； 内参抗体由安赛思提供。 送样要求： 离体后迅速超低温处理并-80 ℃冻存的组织样品，干冰运输；组织：动物组织应不少于100 mg，植物组织不少于500 mg；细胞：大于5×106个细胞； 煮沸变性后的蛋白样本，冰袋运输。 五、最终交付 WB检测结果图片和完整实验报告 七、安赛思案例展示 红色：GAPDH-Dylight 680; 绿色：AKT Dylight 800 Western Blot原理、显色分类及操作步骤 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。western显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 二、操作步骤： (一) 配胶 1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。 分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED 浓度到《分子克隆》建议浓度。 2、封胶： 灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。 待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。 3、灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。 (10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.) (二) 样品处理 1．培养的细胞（定性）： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。 ⑶ 100℃，1min。 Western印迹法的原理及应用 一、原理 免疫印迹法（Western印迹法）是将经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或放射性核素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。典型的印迹实验包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性、非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。免疫印迹法克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分 析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。 二、材料 Western印迹法所需材料包括SDS-PAGE试剂，硝酸纤维素薄膜，匀浆缓冲液，转膜缓冲液，膜染色液，显色液，酶标二抗及其底物等。 三、操作步骤 （一）样品制备 培养细胞及组织样品加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆 0.5～1分钟。细菌诱导表达的原核细胞，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞。然后4℃，13 000g离心15分钟，取上清液作为样品。 （二）SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前对蛋白质进行分离、纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷。SDS-PAGE 是最常用的凝胶电泳技术。它通常采用不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板。SDS-PAGE通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。 （三）蛋白质转膜 电泳后蛋白质样品转移的方法，包括半干式转移、湿式转移等。各种转移方法原理相似，都是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极。可用于免疫印迹的固相载体有多种，硝酸纤维素膜最为常用，具有结合能力强，膜不需要活化，背景浅，能进行多次免疫检测并可用常规染色方法，功能基团寿命长等优点。将凝胶中的蛋白质转印至膜上的方法很多，目前常用方法是电洗脱或电印迹。其主要优点是转印迅速、完全。电洗脱有两种方法：一种是 蛋白免疫印迹（Western blotting） 实验操作原理及方法 一、实验目的： 通过本实验，可以特异性的检测蛋白的表达水平。 二、实验原理： 1、蛋白浓度测定：考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）存在两种不同的颜色形式：红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，结合后燃料演的有红变蓝，最大光吸收由465 nm变成595 nm。通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。此反应大约2 min即可完成，并可稳定1小时。 2、SDS凝胶：丙烯酰胺（Acr）和甲叉丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate, (NH4)2S2O8, APS）或核黄素（ribofavin, VB2）和加速剂N, N, N’,N’-四甲基乙二胺（N, N, N’,N’-ytetramethyl ethylenediamine, TEMED）的作用下，聚合成三维网状结构。 * Acr和Bis之比可以决定胶的孔径等因素。浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶。 3、SDS-PAGE电泳：SDS是阴离子去垢剂，由于其带有大量负电荷，当与蛋白结合时，所带电荷大大超过了天然蛋白原有的负电荷，因而消除了蛋白之间原有的电荷差异，则电泳迁移率主要依赖于分子量，而与所带净电荷和形状无关。 三、实验方法及步骤： 样品预处理： 1、将细胞从平皿上刮下，离心后，用1 X PBS冲洗，12000rpm 1min离心，弃上清，细胞沉淀保存于-80℃。 2、把细胞沉淀取出，加M-PER或T-PER（Thermo，约为细胞体积的2~3倍），悬浮细胞。 10 mL M-PER或T-PER+50μL 200 mM Na3VO4+50μL 200 mM PMSF+1片IN（Roche，酶抑制剂复合物） 3、将装有细胞悬液的Doff管固定在4℃层析柜中的脱色摇床上，max speed，剧烈摇1小时。 4、冰上，超声破碎（注意先用纯水清洗探头），AmL=35% 超声10s，停顿5s，反复10次（探头不能碰到管壁，且始终保持在液面以下，尽量不要产生气泡） 5、重新固定在脱色摇床上，4℃，1 h，max speed。 6、离心，12000 rpm，4 ℃，20 min 7、吸上清于另一Doff管中，保存在-80℃。 测定蛋白浓度（Bradford法）： 1、测定标准曲线 牛血清白蛋白（BSA）标准液的配制：配制1mg/mL的BSA溶液，稀释成浓度梯度为100μg/mL, 200μg/mL, 400μg/mL, 600μg/mL, 800μg/mL的标准液。 标准曲线的测定：取2μL配好的标准液加入到2mL考马斯亮蓝试剂中，室温放置5 min 以上，595nm测光吸收值，制成标准曲线。 2、测定蛋白样品的浓度WB实验的基本原理及操作流程
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新手指南——荧光免疫印迹(Western-Blot)实验服务步骤原理
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