两种传代方法影响人胚胎干细胞转染效率的比较
细胞转染技术原理及应用（瞬时转染和稳定转染）
细胞转染技术原理及应用（瞬时转染和稳定转染）常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。
后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。
外源DNA 整合到染色体中概率很小，大约1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。
一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：（各种转染方法的比较）除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。
其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。
聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。
这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。
胰酶和Ⅳ型胶原酶在人胚胎干细胞传代中的作用特点
ａ ｅ ａ ｓ ｇｎ ｎ ｒ ｏ ｒ ｓ ｒ ａｉｎ，ａ ｄ ｔ ｅ ｋ ｒ ｏｙ ｅ ｐ ｏ ｌ ａｔ ｒ ｍｏ ｅ ｔ ａ １ ａ ｓ ｇ ｓ Ｒｅ ｕ ｔ Ｗ ｅ ｆｕ ｄ ｔａ ， ｐ ｓａ ｅ ｙ ＇ｔｒｐ ｓ ａ ｉ ｇ ａ ｄ ｃ ｙ ｐ ｅ ｅ ｖ ｔｏ ｆ ｎ ｈ ａ ｙ ｔｐ ｒｆ ｅ ｆ ｒ ｈ ｎ ｐ ｓ ａ ｅ ． ｉ ｅ ０ ｓｌ ｓ ｏ ｎ ｈ ｔ ａｓｇ ｄ ｂ ｔ ｐ ｉ ，ｔ ｅ ｃ ｌ ｃ ｌ ｎ ａ ｎ ｆｒ ｙ ｒ ｓｎ ｈ ｅｌ ｏｏ ｙ ｗ ｓ ｕ ｉ ｍ，ｔ ｅｃ ｌｎ ， ｏ ｎ ｔ ｎ ｒ ｔ ｓｈ ｇ ｅ ｎ ｏ ａ ｃ ｌ ｎ ｍｂ ｒ ｉｃ ｅ ｓ ｄ ｆ ｓ ｒｔ ａ ｈ ｔｏ ｏｌ ｇ ｎ ｓ ｏ ｈ ｏ ｏ ） ｆｎ ａｉ ａｅ ｗａ ｉｈ ｒａ ｄ ｔｔｌ ｅｌ ｕ ｅ ｎ ｒ ａ ｅ ａ ｔ ｈ ｎ ｔａ ｆ ｌ ｅ ａ ｅ ｏ ｅ ｃ ａ
消化组少 ， 传代 时细胞存活率和复苏后细胞存 活率 和低浓度胰 酶组相似 。分别用两种 酶处 理传代十余代 ， 核型均无 异常。结论 两种酶消化均适用于 ｈ Ｓ Ｅ Ｃ培 养 ， 二者作用特点不完 全相 同 ， 分别适 用于不同的实验需要 。
【 关键词】 人胚 胎干细胞 ；细胞培养 ； 胰酶 ；Ｉ型胶原酶 Ｖ 【 中图分类号】 Ｒ３４ ２ ９ ．
Ｃｏ ｐ ｒ ｓ ｎ ｂｅ ｗｅ ｎ Ｔｒ ｐｓｎｉ ａ ｉ ｎ ａ ｄ Ｃｏ ｌ ｇ ｎ ｓ ｅ ｔ ｅ ｔ ｉ ｍ ａ ｉｏ ｔ ｅ ｙ ｉ ｚ ｔ０ ｎ ｌ ｅ ａ ｅ Ｔｒ ａ ｍ ｎ ｎ ａ
Ｐａ ｓ ｇｎｇ ｏ ｕ ａ ｓａ ｉ ｆＨ ｍ ｎ Ｅｍ ｂ ｙ ｎ ｃ Ｓ ｅ ｌｓ ｒ ｏ ｉ ｔ ｍ Ｃｅｌ
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２０ ８ 正 ０
两种转染试剂转染 C2C12 细胞效率比较分
两种转染试剂转染 C2C12 细胞效率比较分精品论文两种转染试剂转染 C2C12 细胞效率比较分析韦伟，赵元元，张维娅，赵书红，李新云5 ,农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室～华中农业大学～武汉 430070, 摘要:C2C12 细胞是鼠的骨骼肌成肌细胞～常用于体外研究肌细胞成肌分化～研究表明 C2C12 细胞的转染效率较低～为了提高 C2C12 细胞的转染效率～建立理想的转染条件～本研究对比分析了 FuGENE HD 和 Lipofectamine 2000 两种常用转染试剂的转染效率。
研究结果表明10 FuGENE HD 转染寡核苷酸的效率比 Lipofectamine 2000 高～而转染质粒的效率比Lipofectamine 2000 低。
另外我们还发现培养基中的血清会降低细胞的转染效率。
本研究结果为提高 C2C12 细胞的转染效率提供了新的信息。
关键词:转染效率,寡核苷酸,质粒,C2C12 细胞中图分类号:Q-3315Compare analysis of the transfection efficiency of twotransfection regents in C2C12 CellsWei Wei, Zhao Yuanyuan, Zhang Weiya, Zhao Shuhong, Li Xinyun(Key Lab of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Education,20 Huazhong Agricultural University, WuHan 430070)Abstract: C2C12 cells are the myoblast of mice, which are used asthe model for investigating the differentiation of myoblast in vitro. The transfection efficiency of the C2C12 cells was not good in many studies. In order to improve the transfection efficiency of C2C12 cells and contribute an ideal condition of transfection. The transfection efficiency of two transfection reagents, FuGENE25 HD and Lipofectamine 2000, was analyzed in this study. According the results, the transfection efficiency of FuGENE HD was higher than that of Lipofectamine 2000 when oligo nucleic acids was transfected, but it was lower than Lipofectamine 2000 when plasmid was transfected in the C2C12 cells. Also, we found that serum in cultured medium could inhibit the transfection efficiency. These results offered useful informationfor improving the transfection efficiency of30 C2C12 cells.Key words: transfection efficiency; oligo nucleic acids; plasmid;C2C12 cells0 引言简转染是指将外源遗传物质转入到真核细胞内的过程。
各种转染方法比较
各种转染方法比较不同的实验室转染方法选择会依赖于多个相关因素，如目标细胞类型、转染效率、细胞毒性、需求的表达时间、实验的规模和预算等。
以下是一些常见的转染方法的比较：1. 离子交换法（Calcium phosphate transfection）离子交换法是最早开发和使用的转染方法之一、它使用磷酸钙和DNA或RNA的复合物在细胞表面形成凝析沉淀物。
该方法简单、经济且较为普遍，适用于许多细胞类型。
然而，它的转染效率较低，存在较多的细胞毒性。
2. 迷走转染法（Lipofection）迷走转染法是当前最常用的转染技术之一，通过磷脂体（例如Lipofectamine）与质粒DNA形成复合物。
该方法转染效率高，而且适用于许多类型的细胞，包括哺乳动物和非哺乳动物。
然而，迷走转染法存在一些限制，如细胞毒性、稳定性较差，和细胞特异性。
3. 电穿孔法（Electroporation）电穿孔法是通过应用电场使细胞膜暂时性孔化来实现转染效果。
它可以用于转染各种类型的细胞，包括哺乳动物、鸟类和植物。
电穿孔法的转染效率高，但存在一定的细胞毒性和细胞损伤风险。
此外，电穿孔设备的成本较高，需要专门训练的技术人员来操作。
4. 病毒载体转染法（Viral vector transfection）病毒载体转染法使用经修饰的病毒作为转染载体，可实现高效的基因传递和表达。
常用的病毒载体包括腺病毒、衣壳病毒和逆转录病毒。
这些病毒对于不同类型的细胞具有不同的亲和力和转染效率。
然而，病毒载体转染法的主要限制是细胞对病毒的感染能力，以及在临床应用中可能引发的安全性问题。
5. 直接注射法（Direct microinjection）直接注射法是一种机械刺伤细胞膜直接将DNA注入细胞的方法。
这种方法对于特定的细胞类型具有高效转染的能力，如哺乳动物受精卵和干细胞。
它可以实现精确控制和单细胞水平的转染，但需要昂贵的设备和专业技能。
总结起来，转染方法的选择应根据实验的具体需求来进行。
细胞转染的各种方法比较
细胞转染的各种方法比较梭华-Sofast TM基因转染试剂（高效率和细胞毒性低的聚阳离子转染试剂）梭华-Sofast TM是新一代的阳离子聚合物基因转染试剂，梭华-Sofast TM具有高效率转染所必备特征，如浓缩DNA，将DNA运送到细胞内，并使其在细胞核内释放等；梭华-Sofast TM 的细胞毒性很低，这是它的另一个重要特点；而且与其它转染试剂相比，梭华-Sofast TM很稳定，不被血清清除。
以上优点使得基因转染的操作简便易行，重复性好。
梭华-Sofast TM 已被成功应用于很多原代培养细胞和转化细胞株的基因转染。
一. 特点★转染效率高且稳定，比目前常用产品高10%。
★细胞培养基中的血清存在与否，均能获得高效率转染。
★细胞毒性低。
★转染程序简单，转染前后无需更换培养基转染实验可以在半小时内完成。
★价格比进口产品便宜60%。
★完善的技术支持，保证质量，无效退货。
二. 效果比较将梭华转染试剂与其它公司的聚阳离子转染试剂和常用的脂质体转染试剂分别在常用的报告基因如GFP、荧光素酶基因和LacZ基因的转染效率方面作了对比。
实验表明:1. 梭华-Sofast TM具有很高和稳定的转染率，是一种很好的基因转染试剂。
对某些常用的细胞株梭华-Sofast TM 转染率高于某常用阳离子脂质体，对其他多数细胞株的转染效率相近。
2. 需特别指出梭华-Sofast TM在原代培养细胞HUV-EC中有较高的转染效率，而大多数阳离子脂质体对此细胞的转染效率很低。
3. 通过检测转染细胞荧光素酶基因的活性，测定其转染效率。
实验表明梭华转染试剂具有最高的转染率。
4. 通过检测转染GFP基因的细胞所发出的荧光强度来测试转染效率，实验发现梭华转染试剂的转染率比常用的脂质体转染试剂转染率高达5-10%。
三. 适用范围☉适应于众多原代培养细胞和转化细胞株的基因转染。
☉适用于瞬时转染和稳定转染。
☉适应于贴壁细胞和悬浮细胞转染。
四. 各种转染方法的比较（在目前使用的方法中, 阳离子聚合物转染法是最好的转染试剂。
各种细胞转染方法比较
各种细胞转染方法比较细胞转染方法包括DEAE－葡聚糖法，磷酸钙法，阳离子脂质体法，阳离子聚合物，病毒介导法，Biolistic 颗粒传递法（基因枪粒子轰击法），显微注射法，电穿孔法等，对各种方法的原理，应用，特点，厂家产品等信息的比较结果如下表：转染方法原理主要应用特点厂家及产品DEAE－葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时转染相对简便、重复比磷酸钙好，但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清且一般只用于BSC-1，CV-1，COS细胞系Sigma-Aldrich(DEAE-DextranTransfectionKit)磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染，染瞬转染不适用于原代细胞（所需的DNA浓度较高），操作简便但重复性差，有些细胞不适用细胞建议用CSCL梯度离心，转染是拷贝数较多GIBCO BRL ，Promega阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞。
(若DNA浓度过高，中和脂质体表面电核，而降低了与细胞的结合能力)稳定转染，瞬时转染，所有细胞使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。
虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了其应用Invitrogen（Lipofectamine 2000，Lipofectamine，Lipofectin，LipofectaminePlus，Cellfectin）Roche（Dosper，DOTAP，FuGENE6）CPG Biotech Co（GeneLimoPlus，GeneLimoSuper）Promega（Transfast，Tfx，Transfectam）阳离子聚合物带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多稳定转染，瞬时转染，所有细胞除了具有阳离子脂质体的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内，转染效率高，细胞毒性低等特点，是新一代的转染试剂。
各种转染方法比较
各种转染方法比较转染是将外源DNA或RNA导入体细胞的一种常用技术，用于研究基因功能、疾病机制、基因治疗等领域。
常用的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒载体介导转染和生物矢量直接注射法等。
下面将对这些转染方法进行详细比较。
1.化学法：化学法是最简单、最常用的转染方法之一，主要通过化学试剂与DNA或RNA形成复合物，进而被细胞摄取。
常用的化学试剂有钙磷酸盐、聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体、高分子聚合物等。
化学法的优势在于易操作、适用于不同细胞类型，且无需特殊设备。
但其转染效率相对较低，引起细胞毒性的风险较高。
2.电穿孔法：电穿孔法又称为电转染法，通过利用电场作用使细胞膜发生瞬时通透性，使外源DNA或RNA进入细胞。
这种方法可使用电脉冲仪或特殊转染设备进行操作，适用于多种细胞类型。
相比于化学法，电穿孔法的转染效率更高，但对细胞的毒性稍高。
3.病毒载体介导转染：病毒载体介导转染是一种高效的转染方法，常用的病毒载体有腺病毒（Adenovirus）、腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）、逆转录病毒（Retrovirus）和慢病毒（Lentivirus）等。
这些病毒载体不仅能将外源DNA或RNA导入细胞，还能使其在细胞内稳定表达。
病毒载体介导转染的优势在于高转染效率、稳定表达，适用于许多细胞类型。
然而，为了避免潜在的致病性和免疫反应，需要选择无毒性、无致病性的病毒载体。
4.生物矢量直接注射法：生物矢量直接注射法是将外源DNA或RNA直接注射到体内，让其进入目标细胞。
这种方法适用于许多动物模型研究，如小鼠、斑马鱼等。
生物矢量直接注射法的优势在于转染效率高、实验操作简单，但对于人体病理研究等实验要求较高的场景，其应用范围较窄。
根据以上比较，选择适合自己研究需求和细胞类型的转染方法非常重要。
需要考虑的因素包括转染效率、细胞毒性、操作难度、成本等。
在实际应用中，有时也可结合多种方法，例如将化学法与电穿孔法相结合，能够提高转染效率。
三种脂质体介导的花鲈胚胎干细胞转化效率的比较.pdf
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= = 胚胎干细胞具有发育上的多能性， 能够在体 外长期培养、 扩增、 转化和筛选， 具有正常的二倍 体核型， 通过细胞移植和核移植技术能使其与受 体胚胎嵌合， 生产包括生殖系在内的各种组织的 嵌合体个体。利用胚胎干细胞的多能性， 将细胞 水平上的突变转变为个体水平上的突变， 从而缩 短改良品种的周期和时间。 脂质体法目前广泛应用于真核细胞的转化， 其介导细胞转化方法简单、 转化效率高， 不需要昂
干货：细胞转染的常用方法
干货：细胞转染的常用方法作为一条标准的实验狗，细胞转染这条路可谓是荆棘丛生，很多实验狗们看见细胞转染率低就把细胞给扔掉了！中洪小编告诉你，千万别这样“作死”，因为实验材料也很贵的啊！！科研道路十分漫长，今天我们来看看细胞转染实验大比拼。
首先我们看看细胞转染有哪些常见方式：细胞转染途径化学介导——利用载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或正电荷DEAE磷酸钙法人工脂质体法物理介导——在细胞膜表面产生一个瞬时的孔从而导入DNA 显微注射法电穿孔法基因枪法病毒介导——利用基因工程病毒转染非病毒基因到细胞中逆转录病毒腺病毒（人脐带间充质干细胞转染图，图为本公司实验图，勿盗）小编总结了几种经典的传统方法，在此一一做一个介绍。
1磷酸钙共沉淀原理：该法可用于瞬时或稳定转染。
然而因其对pH、温度和缓冲液盐浓度的微小变化十分敏感，所得结果容易出现差异，且对许多类型的细胞培养物(尤其是原代细胞)具有细胞毒性，转染效率较差。
实验步骤：将核酸与氯化钙在磷酸盐缓冲液中混合，同时控制好pH、温度等条件→ 室温孵育，生成浓缩DNA的极小不溶性颗粒沉淀→ 将颗粒型沉淀分散到细胞中，促进DNA粘附在细胞表面→ 共沉淀通过内吞作用进入胞浆→ 分析细胞瞬时基因表达或者选择稳定性传染。
2人工脂质体法原理：带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，进而可被细胞内吞稳定转染/瞬时性转染。
这种方法几乎适用于所有细胞，转染效率高、重复型好，但转染时需要去除血清，转染效果随细胞类型变化大。
实验步骤：在单独试管中分别稀释核酸及转染试剂→ 脂质体与核酸的磷酸骨架结合，形成复合物→ 脂质体上的正电荷有助于复合物与细胞膜结合→ 复合物通过内吞作用进入胞浆→ 分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。
3病毒转染原理：对于用脂质体不能实现转染的细胞，可以采用病毒转染。
可用于蛋白质过表达或抑制，是临床研究中最常用的方法。
它通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中，可用于难转染细胞、原代细胞的稳定性转染。
细胞瞬时转染 稳定转染
细胞转染摘要：真核蛋白表达细胞转染方式有两种：瞬时转染和稳定转染，本文的主要介绍了两者的定义和适用性及细胞转染一般步骤，影响转染效率的因素，帮助我们提高实验的成功率。
在哺乳动物细胞蛋白表达实验，根据不同的实验目的，将质粒导入细胞有两种方法：瞬时转染和稳定转染。
细胞转染是将外源基因导入真核细胞的过程。
质粒、DNA、RNA将这些外源基因导入到真核细胞内并不容易，要跨越细胞膜的屏障进入细胞质。
瞬时转染瞬时转染是指外源基因导入到细胞后得以表达，但是基因不整合到细胞的基因组上，因此不会随着细胞的生长复制。
因此，瞬时转染的时间有限，通常只持续几天，直到外源基因在细胞生长分裂过程中因各种因素消失为止。
判断细胞是否转染成功，在构建质粒上含有报告基团，以指示目标基因是否存在，一般在转染两天后即能被检测到。
稳定转染稳定转染是在瞬时转染的基础上，瞬时转染时有一小部分的基因会整合到细胞基因组上，并随着细胞的生长分裂，质粒会随机分配到子细胞中从而稀释直至最终丢失，所以稳定转染要进行稳定细胞系的筛选，经过筛选出来的细胞株，此时的质粒已经完全整合到细胞基因组中，随着细胞的生长复制并稳定的遗传给后代。
瞬转稳转适用性瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
瞬时转染在转染后四天即能收获细胞，瞬时转染一般用于基因产物的短期表达、基因敲除、蛋白质的小规模合成。
相对于瞬时转染，稳定转染表达适用于长期的药理学研究遗传调控机制研究及大规模的蛋白质合成，需要大量的周期，因此更费力成本投入高。
目前，在进行哺乳动物细胞蛋白表达蛋白时，因为细胞培养技术的进步和人们对瞬时转染的不断探索，人们已经可以对一些常用细胞进行悬浮培养，实现了瞬时转染对重组蛋白的大规模合成，节省了时间和成本。
细胞转染一般步骤以24孔板进行细胞瞬时转染表达为例，全程操作均为无菌状态，以免造成细胞污染转染前准备，细胞株或者直接培养后的细胞用胰蛋白酶消化后计数，铺板，培养基为含有1ml血清，不含抗性的正常培养基。
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《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research72 ·研究原著·孙莉，女，1990年生，江苏省靖江市人，汉族，在读硕士，主要从事细胞生物学和分子生物学方面的研究。
通讯作者：魏建峰，博士，副教授，江苏省脑病生物信息重点实验室，江苏省徐州市 221004；徐州医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，江苏省徐州市 221004文献标识码:A来稿日期：2019-03-19 送审日期：2019-03-27 采用日期：2019-05-31 在线日期：2019-09-26Sun Li, Master candidate, Jiangsu Key Laboratory of Brain DiseaseBioinformation, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; School of Nursing, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, ChinaCorresponding author: Wei Jianfeng, MD, Associate professor, Jiangsu Key Laboratory of Brain Disease Bioinformation, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; Department of Histology and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China两种传代方法影响人胚胎干细胞转染效率的比较孙 莉1，2，纵艳艳1，魏建峰1，3 (1江苏省脑病生物信息重点实验室，江苏省徐州市 221004；徐州医科大学，2护理学院， 3基础医学院组织胚胎学教研室，江苏省徐州市 221004)DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1870 ORCID: 0000-0002-1800-8057(孙莉)文章快速阅读：文题释义：胚胎干细胞：是一类起源于胚胎发育早期囊胚内细胞群中未分化的细胞，具有自我更新、无限增殖和多向分化的潜能。
转染：是真核细胞主动或被动导入外源DNA 片段而获得新的表型的过程。
摘要背景：现有方法将外源分子如DNA 导入到人胚胎干细胞用于科学研究的效率普遍较低，如何优化现有条件，提高转染效率显得尤为重要。
目的：比较两种不同的传代方法对人胚胎干细胞系H9转染效率的影响，优化胚胎干细胞转染条件。
方法：人胚胎干细胞系H9分别采用小克隆传代法和单细胞传代法进行传代，传代后继续培养细胞48 h ，用Lipofectamine 3000转染pAdTrack-AKT1荧光质粒2 d 后，荧光显微镜下观察荧光质粒的表达，流式细胞仪检测人胚胎干细胞的转染效率；RT-qPCR 和Western blot 分别检测转染后AKT1在mRNA 和蛋白质水平的表达。
结果与结论：①荧光显微镜下观察发现单细胞传代组表达荧光质粒的细胞数量更多，流式细胞仪检测单细胞传代法的转染效率[(47.18±2.00)%]高于小克隆传代法的转染效率[(19.52±0.86)%]，差异有显著性意义 (P < 0.01)；②单细胞传代组转染后AKT1 mRNA 和蛋白的表达均高于小克隆传代组，差异有显著性意义 (P < 0.01)；③结果表明，采用单细胞传代法，增加细胞与转染试剂脂质体的接触面积可提高人胚胎干细胞的转染效率。
关键词：人胚胎干细胞；小克隆传代法；单细胞传代法；脂质体转染；转染效率 中图分类号：R459.9；R394.2；R318 基金资助：江苏省高校自然科学基金(14KJB310021)，项目负责人：魏建峰；江苏省脑病生物信息重点实验室开放课题(JSBl1403)，项目负责人：魏建峰Comparison of two passage methods affecting the transfection efficiency of human embryonic stem cellsSun Li 1, 2, Zong Yanyan 1, Wei Jianfeng 1, 3 (1Jiangsu Key Laboratory of Brain Disease Bioinformation, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; 2School of Nursing, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; 3Department of Histology and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China)AbstractBACKGROUND: In the research of human embryonic stem cells, introducing exogenous molecules such as DNA into cells is a common research method, but the transfection efficiency is relatively low. It is crucial to answer the question of how to optimize the existing conditions to improve the transfection efficiency.OBJECTIVE: To compare the effects of two different passaging methods on H9 transfection efficiency, in order to人胚胎干细胞 单细胞传代法SUN L, ZONG YY, WEI JF. Comparison of two passage methods affecting the transfection efficiency of human embryonic stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2020;24(1):72-76. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.187073optimize the conditions required for embryonic stem cell transfection.METHODS: Human embryonic stem cell lines H9 were cultured for 48 hours after small clone passaging or single-cell passaging.Lipofectamine 3000 was used to transfect pAdTrack-AKT1 fluorescent plasmid into human embryonic stem cells. After 2 days of transfection, the expression of fluorescent plasmids was observed by fluorescence microscope and the transfection efficiency was detected by flow cytometry. RT-qPCR and western blot were used to detect the mRNA and protein expression levels of AKT1 respectively.RESULTS AND CONCLUSION: Under the fluorescence microscopy, the number of cells expressing fluorescent plasmids in the single-cell passaging group was more than that in the small clone passaging group, and the flow cytometry analysis showed that the transfectionefficiency of cells in the single-cell passaging group was (47.18±2.00)%, which was significantly higher than (19.52±0.86)% in the small clone passaging group (P < 0.01). RT-qPCR and western blot analysis showed that the expression levels of AKT1 mRNA and protein in thesingle-cell passaging group were significantly higher than those in the small clone passaging group (P < 0.01). These findings indicate that single-cell passaging can increase the contact area between cells and transfection reagent liposomes, and improve the transfection efficiency of human embryonic stem cells.Key words: human embryonic stem cells; small clone passaging; single-cell passaging; liposome transfection; transfection efficiencyFunding: the Natural Science Foundation of Colleges in Jiangsu Province, No. 14KJB310021 (to WJF); the Foundation of Jiangsu Province Key Laboratory of Encephalopathy Bioinformatics, No. JSBl1403 (to WJF)0 引言 Introduction胚胎干细胞是一类起源于胚胎发育早期囊胚内细胞群中未分化的细胞，具有自我更新、无限增殖和多向分化的潜能[1]，故其在医学上具有非常重要的研究价值与应用前景[2-5]。