细胞转染技术ppt课件
细胞转染技术 PPT
(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导入细
胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物， 但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法
最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo， 所以筛选的时候用G418 பைடு நூலகம்G418是目前获 得稳转最常用的试剂之一。
G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与 新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过 影响干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成， 对原核和真核细胞等产生毒素，包括细菌 ，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原 生动物和蠕虫。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的 地方后，则能启动neo基因编码的序列转录 为mRNA，使细胞获得抗性而能在含有 G418的选择性培养基中生长。目前G418 的这一特性已在基因转移，敲除，抗性筛 选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
筛选之前
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的 厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在 筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如 下：
加药时间
由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出 蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转 染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长 了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛 选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加 G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下 降，所以每2~3天都要更换一次含有G418的筛选液。
将细胞稀释到1000个细胞/mL ，每孔100μl加 入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0， 100， 200，300， 400，500， 600，700，800， 900， 1000，1100μg/ml等12个级别，选择出在 10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行 下一步的筛选试验。一般400-800 μg/ml左右。
细胞转染技术原理及应用
常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome ）存在。
尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。
外源DNA 整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH ；新霉素抗性基因），潮霉素B 磷酸转移酶（HPH ），胸苷激酶（TK ）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。
一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表： 转染方法 原理 应用特点磷酸钙法 磷酸钙DNA 复合物吸附细胞膜被细胞内吞 稳定转染 瞬时性转染 不适用于原代细胞 操作简便但重复性差 有些细胞不适用DEAE-右旋糖苷法 带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染 相对简便、结果可重复 但对细胞有一定的毒副作用 转染时需除血清 电穿孔法 高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA 通过膜上形成的小孔导入 稳定转染 瞬时性转染 所有细胞 适用性广但细胞致死率高，DNA 和细胞用量大， 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件病毒介导法 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 稳定转染 可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等逆转录病毒 特定宿主细胞 但携带基因不能太大细胞需处分裂期 需考虑安全因素腺病毒 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 瞬时转染 特定宿主细胞可用于难转染的细胞 需考虑安全因素 阳离子脂质体法 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞 稳定转染 瞬时性转染 所有细胞 适用性广，转染效率高，重复性好，但转染时需除血清。
细胞转染
1、转染前一天，3.0×105-8.0×105 个/ml细胞接种于 35mm底部含有盖玻片的培养皿培养，加入1mlRPMI 1640 含血清，使其在24小时内使细胞汇合达到40-70%(汇合过 分，转染后不利筛选细胞)； 2、转染液制备：在1.5mlEP管中制备以下两液:A液：用无 血清培养基稀释4μg DNA，终量250μL；B液：用250μL无 血清培养基稀释10μl脂质体试剂，轻轻混匀，室温放置5 分钟（注意：无血清中不含双抗，因为抗生素会在穿透的 细胞中积累毒素）； 3、混合A、B液，轻轻混匀，室温放置30分钟，以便形成 DNA / 脂质体复合物；
【实验用品】
1、仪器和用品：37℃、5%CO2的加湿培养箱、35mm的 细胞培养皿、 载玻片、盖玻片、弯头镊子。 2、材料：呈指数生长的真核细胞HO-8910PM(贴壁细胞)。 3、试剂 1）RPMI 1640含血清培养基 2）质粒载体DNA带GFP(绿色荧光蛋白)基因。 3）转染试剂：阳离子试剂脂质体2000。 4）RPMI 1640无血清培养基不含青霉素、链霉素。
4．转染准备：用2mL无血清培养液漂洗两次细胞，再加 入1mL无血清培养液（注意：转染时切勿加血清，血清对 转染效率有很大影响）； 5．将500μl DNA / 脂质体 复合物加到含有细胞和培养基的 培养皿中，来回轻柔摇晃细胞培养板，37℃温箱温育6～ 24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养； 6．转染24h后，取出盖玻片盖在载玻片上，使用荧光显微 镜观察计数表达绿色荧光蛋白的细胞，在明场中观察计数 同一视野中的总细胞数，计算转染效率。 转染细胞率=荧光蛋白表达细胞数/总细胞数×100%
实验八
脂质体介导转染实验
转染的原理
转染的原理转染是生物学实验中常用的一种技术，它是指将外源DNA或RNA引入到细胞内的过程。
转染技术在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。
本文将从转染的原理入手，介绍转染技术的基本概念、原理和常见方法。
转染的基本概念。
转染是指将外源核酸（DNA或RNA）引入到细胞内，并使其稳定地表达或转录的过程。
通过转染技术，可以实现对细胞内基因的敲除、过表达或靶向修饰，从而研究基因功能、调控细胞信号通路、开发新药物等。
转染的原理。
转染的原理主要包括细胞膜通透性增加、核酸与细胞膜的相互作用、内吞作用和核酸的释放等过程。
在转染过程中，外源核酸首先需要穿过细胞膜，进入到细胞内部。
然后，外源核酸需要与细胞内的生物分子发生相互作用，从而实现其稳定的表达或转录。
最后，外源核酸需要在细胞内定位到特定的细胞器或亚细胞结构，发挥其功能。
常见的转染方法。
目前，常见的转染方法包括化学法、生物物理法和病毒载体法等。
化学法是指利用化学试剂（如聚乙烯亚胺、脂质体等）改变细胞膜的通透性，使外源核酸能够进入到细胞内。
生物物理法是指利用物理手段（如电穿孔、微注射等）将外源核酸导入到细胞内。
病毒载体法是指利用病毒载体将外源核酸传递到细胞内，并实现其表达或转录。
转染技术的应用。
转染技术在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因工程领域，转染技术被用于敲除或过表达特定基因，从而研究基因功能和调控信号通路。
在细胞生物学领域，转染技术被用于标记细胞器、跟踪蛋白质定位和研究细胞信号转导等。
在药物研发领域，转染技术被用于筛选潜在的药物靶点、评估药物毒性和研究药物的作用机制等。
结语。
总之，转染技术是一种重要的生物学实验技术，它在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。
通过对转染的原理和常见方法的了解，可以更好地应用转染技术进行科研工作，推动生命科学领域的发展和进步。
《细胞转染技术》PPT课件
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6
磷酸钙共沉淀转染法
由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染 和稳定染的研究。方法是，先将DNA和氯化钙混合，然 后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，后把含有沉 淀的混悬液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作用 摄人DNA。
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7
脂质体介导法（目前应用最广泛）
原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的 脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中间，这种脂质双 层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细 胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞浆中。
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8
此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒 进入细胞的一般过程。
【主要应用】:瞬时转染 稳定转染.
【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于 各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞， 没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率， 但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发 强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应 用受限制。
该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细 胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。
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实验室用到的转染方法
脂质体介导法
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细胞转染Lipofectamine 2000转染试剂：以HEK193细胞 为例：
转染前一天，将细胞铺到培养皿中， 加入有血清无双抗的培养基（15ml）； 24小时候换上无血清无双抗的培养基12ml； 将所需的质粒用1.5ml无血清无双抗的培养基稀释；取
人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便 地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染 效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核 酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。
细胞转染Cell Transfection
细胞培养
• HeLa， HepG-2， NIH /3T3 细胞培养于含 10% 新生小牛血清的 DMEM 高糖培养液， 37 C ， 5% CO2， 90% 相对湿度培养箱中 . 在解冻小鼠 ES 细胞前， 先培养饲养层细胞 C57BL， 待长满后， 用 含 10 ug /mL 的mitomycin C处理 2 ~ 2. 51h， 用 37 C 预热的 PBS 漂洗两次， 加普通培养液过夜培养 . 第二天， 解冻小鼠 ES 细胞， 在含 10% 胎牛血清7 . 175 X 109 pmoI /L LIF饲养层上培养 .
•
转染试剂
细胞状态 转染方法
载体构建
•
细胞培养物 细胞密度 血清
抗生素
氮磷比 DNA质量
1． 转染试剂
• 不同细胞系转染效率通常不同， 但细胞系的选择通常是根据实验 的需要， 因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合 的转染试剂。 每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株 列表和文献， 通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。 当然， 最适合的是高效、 低毒、 方便、 廉价的转染试剂。
• 小鼠 ES 细胞， 用 冰预冷的 PBS 将处于对数生长期的细胞重悬为 1 X 107 个 /mL， 取 0. 8 mL 细胞悬液与 25 ug 线性化的 Target Vector 混合， 加到 4 mm 电击池， 冰上放置 5 min (对照组室温放置） • 用 电压 240 V,电阻 ,电容 500 uF 和 950 uF 分别进行电穿孔转染， 电击 后冰上放置 5 mi n (对照组室温放置） • 将细胞转移到装有预热培养液的 15 mL 离心管中 ， 轻轻吸打均匀后， 将 细胞悬液平均分到 6 个装有预热培养液（ 含 7 . 175 X109 pmoI /L LIF）铺 好饲养层的 10 cm 培养皿中 ， 摇匀， 常规条件培养 • 24 h后换新鲜培养液， 电击后 48 h,加250ug /mL G418 及 2 umoI /L gancycIovir 进行选择， 每天更换选择培养液
细胞生物学技术课件GFP细胞转染实验讲义
这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳 定表达
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载体名称：pEYFP-C1 载体类型：哺乳动物细胞表达载体
载体大小：4.7kb 载体宿主：大肠杆菌，哺乳动物细胞（E.coli, Mammalian cells） 细菌抗性：卡纳（kan） 真核筛选标记：新霉素（Neomycin） 5' 测序引物：EGFP-N Sequencing Primer (#6479-1) 3' 测序引物：EGFP-C Sequencing Primer (#6478-1) 载体描述：encodes an enhanced yellow-green variant of the Aequorea victorioiled plasmid DNA or siRNA constructs), or even proteins such as antibodies, may be transfected.
Transfection of animal cells typically involves opening transient pores or "holes" in the cell membrane, to allow the uptake of material.
细胞转染 Protocol
细胞转染是一种常用的生物技术，用于将外源基因或药物引入细胞中。
下面是细胞转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理细胞转染是利用细胞膜的通透性，将带有特定基因或药物的载体分子导入细胞内。
常用的载体分子包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等，能将外源基因高效地导入细胞中，但可能对细胞产生一定毒性。
非病毒载体如脂质体、阳离子聚合物等，相对安全，但导入效率较低。
通过细胞转染，可以实现对基因的表达调控，探索基因功能和药物筛选等研究。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
o转染试剂：如Lipofectamine、Effectene等，用于细胞转染。
o DNA或RNA：携带目的基因的质粒或寡核苷酸。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于细胞转染后洗涤和离心。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
四、准备工作1.仔细阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等，需在适当的压力和温度下进行灭菌处理，以消除所有潜在的污染源。
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3 载体DNA
对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正 常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定 细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的 载体做对照。
（1）载体完整性 （2）载体制备物
4 组织培养试剂
一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的 培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。
转染的影响因素
细胞
（1）分裂细胞相比较非分裂细胞 （2）贴壁细胞相比较悬浮细胞 （3）传代次数 （4）细胞数量（融合率）
2 交叉污染
如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有 可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程 这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被HeLa细胞 所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过 镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培 养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。
(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导人细
胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物， 但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法
该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细 胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。
实验室用到的转染方法
脂质体介导法
细胞转染Lipofectamine 2000转染试剂：以HEK193细胞 为例：
电穿孔法 基因枪法 逆转录病毒
腺病毒
DEAE-葡聚糖法
是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近 细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于 瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。
此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒 进入细胞的一般过程。
【主要应用】:瞬时转染 稳定转染.
【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于 各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞， 没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率， 但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发 强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应 用受限制。
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因 此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长 短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问 题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有 巨大的作用。
物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪)
（1）电穿孔法 利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进
人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便 地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染 效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核 酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。
未整合
稳定转染
为获得稳定表达 外源基因的单细 胞克隆
整合
随细胞分裂而稀 释至丢失48－72 小时
随宿主细胞本身 基因组一样复制， 转录，翻译，并 被稳定遗传
抗生素抗性
抗生素抗性
基因转染真核细胞的方法
转染方 法
化学 转染法
物理 转染法
病毒 感染法
DEAE一 葡聚糖法
磷酸钙法
人工 脂质体法
显微 注射法
细胞转染技术
一 ：转染的简介 二 ：转染的分类 三： 转染的方法
一 、 转染的简介
1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并 使核酸在细胞内维持其生物功能。
2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治 疗研究。
二 、转达持续时间
筛选办法
瞬时转染 快速分析
转染前一天，将细胞铺到培养皿中， 加入有血清无双抗的培养基（15ml）； 24小时候换上无血清无双抗的培养基12ml； 将所需的质粒用1.5ml无血清无双抗的培养基稀释；取
40ul的Lipofectamine 2000加入无血清无双抗的培养 基稀释，室温放置5min； 5min后将质粒和Lipofectamine 2000混合在一起，室 温放置20min后加入培养皿中，4h后换上完全培养基 48h培养； 注：24h看一次，如果培养基变颜色换培养基；
(1)基础培养基 (2)胎牛血清 (3)添加剂