凝胶色谱基础知识
凝胶色谱
交换树脂表面
二、离子交换树脂的分类
1. 按树脂骨架的主要成分
(1) 聚苯乙烯型树脂 由苯乙烯(母体)和二乙烯 苯(交联剂)的共聚物作为骨架，再引入活性基团 (2)丙烯酸树脂 由丙烯酸酯类和甲基丙烯酸 酯类及其它烯属单体共聚制成的树脂。
(3) 多乙烯多胺-环氧氯苯烷树脂 与环氧氯苯烷的共聚物作为骨架。 由多乙烯胺
置换展开法（顶替法）：利用一种吸附力比各
被组分都强的溶剂作为洗脱剂，替代结合在固定 相上的各组分。处理量大，且各组分分层清楚。
三、吸附色谱法的应用
主要用于具有不同官能团或具有相同
官能团但数目不同的极性化合物及异
构体等生物小分子物质的分离分析。
4.4 离子交换色谱法
离子交换色谱法(ion exchange chromatography，IEC)是利用 离子交换树脂为固定相，以适宜的溶剂 作为移动相，使溶质按它们的离子交换 亲和力的不同而得到分离的方法。
相（一般是气体或液体）称为流动相 。
三、色谱分离技术的分类 根据分离时一次进样量的多少，色谱分离的 规模可分为色谱分析规模(小于10mg)、
半制Байду номын сангаас(10~50mg)、制备规模
(0.1~10g)和工业生产规模(>10g)。色
谱分离的规模小，但产值高。
三、色谱法的分类
根据流动相的相态不同:
气相色谱—以气体作流动相 液相色谱—以液体作流动相
(4) 酚-醛型树脂 主要由水杨酸、苯酚和甲醛 缩聚而成，水杨酸和甲醛形成线状结构，苯酚作 为交联剂。
2. 按树脂骨架的物理结构
(1) 凝胶型树脂 (2) 大网格树脂 (3) 均孔树脂
3. 按活性基团分类
1) 阳离子交换树脂 活性基团为酸性， 对阳离子具有交换能力。 (1) 强酸性阳离子交换树脂 (2) 弱酸性阳离子交换树脂
凝胶色谱的讲义第一章(1)
凝胶色谱的讲义第一章(1)第一章前言一、高聚物及多糖平均分子量及其分布1、高聚物的平均分子量除天然聚合物外，合成聚合物都是以单体为原料经过聚合反应而制得的。
每个聚合物分子都是由数目很大的单体分子加成或缩合而成，所以合成聚合物的分子量比单体要大千百倍甚至成万倍。
另一方面，根据绝大多数的聚合反应机理预示，生成的聚合物的分子量是不均一的，也就是说每个聚合物分子可以由不同数目的单体分子聚合而成，所以各聚合物的分子量是不相等的，这种现象叫做聚合物的分子量的不均一性或多分散性。
高聚物分子量的多分散性使分子量的表征比小分子要复杂一些，拿一个高聚物试样来说，由于试样内包含有许许多多个高分子，这些高分子的分子量可以分布在相当大的范围内。
例如，试样中可以包含尚未聚合的单体、含二个、三个、四个、…单体的低聚物以及聚合度不同的高分子，对这样一个多分散的体系来说，我们要表征它的分子量就需要用统计的方法，求出试样分子量的平均值和分子量分布、由于应用统计方法的不同，即使对同一个试样，也可以有许多不同种类的平均分子量；例如，某一个高聚物试样中含有N1个分子量为M；的分子，N2个分子量为M2的分子，N3个分子量为M3的分子，……Ni-1个分子量为Mi-1的分子以及Ni个分子量为MI 的分子，我们就可以根据定义算出它的各种平均分子量。
下面是四种最常用的平均分子量定义：这里：YMx分子量名称Mn数均分子量1Mw重均分子量2MzZ均分子量3MZ+1Z+1均分子量Mw/Mn分子量分布Mp峰位分子量另外，粘均分子量：很显然，同一个试样应用不同的统计方法所算出来的不同种类的平均分子量的数值是不同的。
一般情况下，多分散样品的平均分子量有以下次序：Mz＞Mw ＞M η＞Mn 2．高聚物的分子量分布高聚物的分子量分布是指试样中各种大小不等的分子量组分在总量中所占的各自的分量，它可以用一条分布曲线或一个分布函数来表示。
例如，当我们知道高聚物试样中分于量为M1、M2、M3、…、Mi各组分在总重量中所占的重量分数分别为W1 、W2、W3 、…、Wi 时，我们就可以用对应的W和M作图，得到分子量分布曲线。
凝胶色谱法要点
简介 凝胶色谱技术是上世纪六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，对高分子物质有很好的分离效果。
在生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域被广泛采用，工业生产上也有非常广泛的应用。
一、分离原理 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。
具有多孔的凝胶就是分子筛。
各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。
分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。
两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。
直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。
如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。
因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。
综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。
大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。
对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。
凝胶色谱技术
凝胶色谱技术凝胶色谱法凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
一、基本理论（一）分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。
具有多孔的凝胶就是分子筛。
各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。
分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。
两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。
直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。
如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。
因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。
综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。
大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。
对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。
凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱目录一、基本原理 (2)1.1 凝胶的特性 (2)1.2 色谱的分离原理 (3)1.3 凝胶渗透色谱在分离技术中的应用 (5)二、仪器设备 (6)2.1 凝胶渗透色谱仪的主要组成部分 (7)2.2 主要性能指标及选择 (9)2.3 仪器设备的清洁与维护 (9)三、样品前处理 (11)3.1 样品的选择与制备 (11)3.2 样品浓缩与净化 (12)3.3 样品检测方法的建立 (13)四、实验操作流程 (14)4.1 样品进样 (16)4.2 柱塞泵的设置与调节 (17)4.3 检测器的选择与校准 (18)4.4 数据处理与结果分析 (19)五、理论基础与数学模型 (20)5.1 凝胶渗透色谱的理论基础 (22)5.2 数学模型在凝胶渗透色谱中的应用 (23)5.3 实验数据的解释与处理 (24)六、应用领域 (26)6.1 在化学领域中的应用 (28)6.2 在生物医学领域中的应用 (29)6.3 在环境科学领域中的应用 (30)七、常见问题与解决方案 (31)7.1 常见问题及原因分析 (32)7.2 预防措施与解决策略 (33)八、实验安全与防护 (34)8.1 实验室安全规程 (36)8.2 个人防护装备的使用 (37)8.3 应急处理措施 (38)九、最新研究进展 (39)9.1 新型凝胶材料的研究与应用 (40)9.2 色谱技术的创新与发展 (41)9.3 聚合物凝胶渗透色谱法的探索 (43)一、基本原理它的基本原理是利用具有不同孔径大小的多孔凝胶颗粒作为固定相，将待分离的混合物通过凝胶柱进行分离。
在色谱过程中，待分离的混合物会与凝胶颗粒发生相互作用，从而导致不同成分在凝胶颗粒之间的分配系数和扩散速率的差异。
根据这些差异，混合物中的各个成分可以通过不同的时间顺序依次通过凝胶柱，从而实现对混合物中各组分的高效分离。
GPC的关键参数包括：凝胶颗粒的大小和形状；溶液流速；压力；洗脱剂的选择和浓度。
凝胶色谱基础知识
该 GPC 可选软件可在 LCsolution 上无缝地运 行。作为 LCsolution 的一部分，此软件扩展 了方法、数据和报告格式文件的功能，并可 使用 LCsolution 的所有功能特性。
分子质量。
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为什么要用GPC方法
❖ 相对分子量分布(多分散性指数)对聚合物的性 质有重要影响。
❖ 在相对分子质量分布（多分散性指数）成为 人们关注的热点后，经典方法却不能同时测 定聚合物的相对分子质量分布。凝胶渗透色 谱(GPC)的应用改善了测试条件，并提供了 可以同时测定聚合物的相对分子质量及其分 布的方法，使其成为测定高分子相对分子质 量及其分布最常用、快速和有效的技术。
❖ 渗透极限
能够完全进入凝胶颗粒孔穴内部的最大分子的分子量。
在选择固定相时，应使欲分离样品粒子的相对分子质量落在固
定相的渗透极限和排阻极限之间。
6
平均分子量计算公式
数均分子量
Mn =
S Hi S (Hi / Mi)
重均分子量 Mw = Z均分子量 Mz =
S Mi Hi S Hi ΣMi 2Hi S Mi Hi
4x105(GPC-804), 4x106(GPC-805), 4x107(GPC-
806)，4x107 (mixed gel，GPC-80M),
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8
GPC色谱柱类型
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GPC系统配置
进样器 泵
色谱柱 柱温箱
检测器
THF, 氯仿, DMF
第2节 凝胶色谱(GPC)
3.2.4 热力学理论
该理论认为，决定GPC分离的因素，不仅有胶体的孔径大 小，而且包括在一定溶剂中高聚物分子构像的尺寸分布。 Casassa研究了溶液中不同构像的分子链在同一胶体孔洞 大小上的分离他假设孔洞内外的溶质分子处于平衡，而且 两相是那样的稀,以致高聚物之间无作用。他用无规飞行 统计来描述分子的构像，即符合方程式： 2 式中，Pn（r）表示距坐标原点为矢量r的位置上，无规飞 行出现n次的几率密度；b2表示聚合物链段的平均平方长 度。上式在分散（dissipative）物理过程中是基本的，适 用于各种边界条件。
[ ]1[ M ]1 [ ]2[ M ]2
把Mark－Houwink方程：代入上式再经过 一些公式的化简可得：
lg M 2 1 1 1 lg( K 1 / K 2) lg M 2 1 2 1 2
因此只要知道两种聚合物样品在实验条件 下的参数K1，α1和K2，α2的值，就可由一种 高聚物的校正曲线以上式换算成第二高聚 物的校正曲线。 此方法的优点是主要一种高聚物（一般采 用窄分布聚苯乙烯）作校正曲线就可以测 定其他类型的聚合物，但先决条件式两种 聚合物的K和α必须是已知的，否则无法进 行定量计算。
对于线性校正曲线可用下列方程表示： lg M A BVe 式中，Ve为淋洗体积（也可用保留时间）； M代表分子量；A和B为常数，B>0。 如果校正曲线是非线性的，则可用曲线方 程或多段折线方程表示。 这种测定校正曲线的方法简便，准确性高， 但获得于被测样品相同类型的窄分布高分 子样品比较困难，限制了它在实际中的应 用。
KC 1 2 A2C R MW
4 2 2 dn 2 K n ( ) N4 dc
凝胶色谱层析
凝胶色谱层析
凝胶色谱层析（Gel Chromatography）是一种常用的分离和分析
生物大分子的技术。
它基于不同分子的大小和形状差异，通过凝胶的
分子筛效应来实现分离。
凝胶色谱层析通常包括以下步骤：
1. 凝胶的选择：选择适当的凝胶，如琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，根据待分离物质的大小和性质选择合适的凝胶孔径。
2. 柱子的制备：将凝胶填充到柱子中，确保凝胶均匀且无气泡。
3. 上样：将待分离的混合物加载到柱子的顶部。
4. 洗脱：使用适当的洗脱液，通常是缓冲液，将混合物通过柱子
进行洗脱。
大分子物质由于不能进入凝胶的孔径，会首先被洗脱出来，而小分子物质则会被凝胶保留较长时间。
5. 检测：在洗脱过程中，通过检测柱子出口处的洗脱液，可以监
测不同物质的洗脱时间和浓度。
6. 收集和分析：根据洗脱时间和检测结果，收集不同组分的洗脱液，并进行进一步的分析和鉴定。
凝胶色谱层析的优点包括分离效果好、操作简单、可重复性高，适用于分离和分析蛋白质、核酸、多糖等生物大分子。
它是生物化学、分子生物学和生物技术等领域中常用的分离和分析技术之一。
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GPC系统配置
进样器 泵
色谱柱 柱温箱
检测器
THF, 氯仿, DMF
示差检测器
需要GPC软件才可计算MW
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测定聚合物分子量的方法
直接方法
渗透压方法 (for Mn) 光散射方法 (for Mw) 粘度方法 (for Mv) 超速离心方法 (for Mz)
间接方法
GPC (for Mn, Mw and Mz) 用标准品进样得到分子量校正曲线，间接算出 聚合物样品的相对分子量。如和标准品结构不 同，还需进行相应的计算才能得到聚合物样品 自身的分子质量。
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228-45009-38
柱温箱
CTO-20A
1
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228-45095-38
示差折光检测器
RID-10A
1
9
228-20810-91
色谱柱
GPC-80M
1
10 228-20812-91 11 223-05671-92
保护柱 LC工作站
GPC-800P
1
LCsolution Single 1
12 223-05655-92
重均分子量 Mw = Z均分子量 Mz =
S Mi Hi S Hi ΣMi 2Hi S Mi Hi
Z+1均分子量 Mz+1 =
Hi： 峰高 Mi：分子量
ΣMi 3Hi S Mi 2Hi
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平均分子量含义
渗透极限
能够完全进入凝胶颗粒孔穴内部的最大分子的分子量。
在选择固定相时，应使欲分离样品粒子的相对分子质量落在 固定相的渗透极限和排阻极限之间。
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平均分子量计算公式
数均分子量
Mn =
S Hi S (Hi / Mi)
样品间分子量分布宽度的比较，最直接的方法是 将实验所得到的分子量分布曲线作对比。
分子量分布曲线有两种形式：
用重量分数W对分子量作图的曲线叫做微分分布曲线； 用累积重量分布对分子量作图的曲线叫做积分分布曲
线。
还有一种更一般化且最常用的方法就是重均数均 比，即：Mw/Mn。
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GPC用途
高聚物的分子量及其分布是高聚物最基本的参数 之一。高聚物的许多性质是与分子量有关的。例 如冲击强度、模量、拉伸强度、耐热、耐腐蚀性 都与高聚物的分子量和分子量分布有关。
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GPC分离原理
数均分子量 (Mn)
拉力、抗冲击性
重均分子量 (Mw)
脆度
Z 均分子量 (Mz)
弹性、硬度
分布宽度指数D(分散度)= Mw/Mn
对于多分散试样 Mn ＜ Mw ＜ Mz
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高聚物多分散性表征
SEC分类
凝胶渗透色谱 (GPC)
主要用于聚合物领域 以有机溶剂为流动相(氯仿，THF，DMF) 常用固定相填料：苯乙烯－二乙烯基苯共聚物
凝胶过滤色谱 (GFC)
主要用于生命科学领域 以水溶液为流动相 常用固定相填料：亲水性有机凝胶(葡聚糖，琼脂糖，
聚丙烯酰胺等)
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为什么要用GPC方法
相对分子量分布(多分散性指数)对聚合物的性质 有重要影响。
在相对分子质量分布（多分散性指数）成为人们 关注的热点后，经典方法却不能同时测定聚合物 的相对分子质量分布。凝胶渗透色谱(GPC)的应 用改善了测试条件，并提供了可以同时测定聚合 物的相对分子质量及其分布的方法，使其成为测 定高分子相对分子质量及其分布最常用、快速和 有效的技术。
SEC定义
SEC全称Size Exclusion Chromatography(体积 排阻色谱，或者尺寸排阻色谱）
SEC定义：是利用多孔凝胶固定相的独特特性， 而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来分 离的液相色谱方法。
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GPC软件
LCsolution GPC
配置实例
No.
产品编号
产品名称
型号
数量
1
228-45011-38
系统控制器
CBM-20Alite
1
2
228-45000-38
输液单元
LC-20AD
1
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228-45018-32
在线脱气机
DGU-20A3
1
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228-45041-91
容器盘
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228-45006-38
自动进样器
SIL-20A
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228-46606-96 自动进样器用GPC对应组件
GPC术语
排阻极限
排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的 分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒 内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗 脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子 量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得 到分离。随固定相不同，排阻极限范围约在 400至 60×106之间。
固定相是多孔填料，小分子样品可以进入孔径内部 样品与固定相之间无作用力 迁移时间不同
样品
填充物颗粒
大
中
孔穴
小
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MW与RT之间的关系
排阻极限 渗透极限
GPC柱
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