细菌药敏试验及其耐药表型检测
第章细菌药敏试验及其耐药表型检测
第章细菌药敏试验及其耐药表型检测细菌药敏试验是临床细菌感染治疗中非常重要的检测手段，通过该技术可以检测不同抗生素对细菌的敏感性，进而为合理使用抗生素提供科学的依据。
然而，在临床应用过程中，随着抗生素不合理使用的增加，细菌耐药性也随之快速发展。
因此，针对不同耐药表型的检测越来越受到关注。
一、细菌药敏试验细菌药敏试验是一种用于判断细菌对不同抗生素敏感性的方法。
常见的细菌药敏试验方法包括纸片扩散法、E测试、革兰氏染色法、微量稀释法等。
其中纸片扩散法是最常用的一种方法，其原理是将待检细菌涂在琼脂平板上，然后在板上放置一些含有不同抗菌药物的试纸，细菌耐药性差的部分会被试纸上的抗生素杀灭，出现纯净孔（抑菌圈），通过抑菌圈的直径可以初步判断细菌对抗生素的敏感性或耐药性。
细菌药敏试验有很多应用价值，如能够帮助医生选择合适的抗生素治疗细菌感染，避免了不必要的抗生素使用，同时也可作为科研人员研究细菌抗药机制的工具，为抗菌药物的开发提供依据。
二、耐药表型检测随着细菌抗药性问题的不断加重，对不同耐药表型检测的需求也越来越迫切。
耐药表型是指细菌对特定抗生素的耐药情况。
由于不同的细菌及其不同的菌株对抗生素的敏感程度有所不同，因此抗菌药物在应用过程中会出现不同菌株对不同药物的耐药表型。
目前，针对不同耐药表型检测的方法主要有两种：基于分子生物学技术的方法和基于药敏试验的方法。
1. 基于分子生物学技术的方法基于分子生物学技术的方法是检测细菌耐药性最常用的方法之一。
该方法通过检测细菌中特定的基因或者基因片段，以此确定细菌耐药性的表型。
常见的基于分子生物学技术的方法包括PCR检测、基因芯片技术、实时荧光定量PCR等。
2. 基于药敏试验的方法基于药敏试验的方法是已经成熟的检测方法之一，其通过将药敏试验的结果与临床药物疗效相结合，进而确定细菌耐药性表型。
通过检测不同抗生素对不同菌株的敏感性，可以初步反映出细菌的耐药性状态。
当然，这种方法不仅涉及到耗时、耗材、人力等成本的问题，而且还受到试验条件、条件操作等方面的影响。
细菌耐药性检测方法
细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。
也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。
(2)折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC)，而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验. （3）双纸片协同试验:双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。
若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β—内酰胺酶（4)药敏试验的仪器化和自动化:全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek—2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。
2．β—内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）.临床常用头孢硝噻吩纸片法，β—内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。
如β—内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素(包括氨基、羧基和脲基青霉素)耐药。
3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA 基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因.检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR—SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0。
抗菌药物敏感试验与细菌耐药性检课件
无关作用：两种抗生素联用的效果，仅相当于 其中一种具有较强作用的抗生素的效果；
拮抗作用：两种抗生素联用时的效果反而小于 它们分别使用时的效果之和。 10％～15％
32
抗菌药物协同作用发生原理
两种抗菌药物作用部位不同： β－内酰胺类抗生素（抑制细菌细胞壁合成）与氨
因此细菌培养及药敏试验报告只能作为临床用 药的参考，应根据患者用药后的治疗反应和临 床病情及时调整用药。
医学检验的灵魂是与临床沟通。
46
新的药敏试验方法探索
流式细胞术检测抗生素最低抑菌浓度 分枝杆菌药物最低抑菌浓度的快速测定
方法研究
47
细菌耐药性的发生过程：
细菌获得与耐药相关的基因 基因：537 编码与耐药有关的蛋白 表型：书533页
心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
20
7.经过35℃16～24h孵育。 8.取抑菌环直径， 根据CLSI标准，报告细菌对 该抗生素敏感、耐药、中介。
21
纸片扩散法质量控制
抑菌圈直径？
培养基：M-H平板厚度，4 mm
↗↘
细菌悬液：0.5麦氏标准的细菌浓度 ↗ ↘
药敏纸片的质量
治疗浓度
治疗浓度的下限 即表中的 S
耐药
中介耐药 敏感
MIC
6
第一节、抗菌药物敏感性试验方法
需氧和兼性厌氧菌
7
需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法
稀释法 • 肉汤稀释法（试管稀释法） • 琼脂稀释法（平板稀释法） 纸片扩散法（纸片法） E-试验 联合药物敏感试验
8
稀释法的特点
定量的药敏试验，测定MIC、MBC。 方法比较繁琐，手工操作一般不作为常规试验，
实验七++细菌的药敏试验与耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
实验七++细菌的药敏试验及耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
细菌药敏试验及其耐药表型检测
细菌
抗菌药物
嗜麦芽窄食单胞 甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、左氧氟沙星、米诺环素、氯霉素、头孢他啶、替卡西林/克拉维
菌
酸）
肠球菌属
氨苄西林、替考拉宁、环丙沙星或左氧氟沙星、万古霉素、红霉素、高浓度庆大霉素 （CN120）或高浓度链霉素（STH300）、青霉素、利奈唑胺、呋喃妥因（尿标本）
肺炎链球菌
苯唑西林、红霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、青霉素b(MIC)、头孢噻肟或头孢曲松b (MIC)、万古霉素、美罗培南（脑脊液标本）
• 抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与 该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系。 即抑菌圈愈大，MIC愈小。
纸片扩散法
试验方法 1 于纯培养平板上，挑取相同的菌落4~5个 2 用无菌生理盐水制成0.5麦氏单位（真菌为2.0麦氏单位）的
细菌悬液
纸片扩散法
3.用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液；
MIC与抑菌圈直径的线性关系
Log2. MIC
R v
I
S
耐药
中介 敏感
抑菌圈直径（mm)
现有主要标准
• 临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）
• 欧洲抗菌药物敏感性试验委员会 EUCAST • 参考标准 ISO 20776-1 （国际微量肉汤稀释法的参考方
氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛、头孢唑啉、头孢西丁、庆大霉素、妥布霉素、青霉素、利 福平、磷霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、环丙沙星或左氧氟沙星、克林霉素、红霉素、苯 唑西林、替考拉宁、万古霉素(MIC)、利奈唑胺、呋喃妥因（尿标本）
头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、氨曲南、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉 西林/他唑巴坦、左氧氟沙星或环丙沙星、阿米卡星、亚胺培南或美罗培南、妥布霉素、 庆大霉素、哌拉西林、多粘菌素
菌药物敏感性试验和细菌耐药性的检查
1.概述
1.3.2 药敏试验用药的分组： 临床实验室标准化研究所（Clinical Laboratory
Standards I，CLSI）将抗菌药物分成A、B、C、U四组
1.概述
1.3.2 药敏试验用药的分组 • A组：常规药敏试验的首选药物，应常规报告
1.概述
1.3.2 药敏试验用药的分组
• B组：包含针对医院感染的药物，亦可作为首选药物，选择 性报告临床。 （csf、多种细菌、多部位感染、A组药物过 敏或耐药，流行病学目的向感控部门报告）
细菌耐药性的检测31细菌的耐药机制311细菌产生灭活抗生素的各种酶内酰胺酶氨基糖苷修饰酶312细菌改变药物作用的靶位青霉素结合蛋白pbp肽聚糖交联靶位改变dna拓扑异构酶313细胞膜通透性改变及对药物主动外排314细菌生物膜的形成3
内容与要求
• 抗菌药物敏感性试验适应症(了解) • 药敏试验常用抗菌药物选择与分组(了解) •TH药A敏N试K 验YO结U果表示及其临床意义 (掌握) • 细菌耐药机制及常见耐药菌检测(了解)
4.1.2 MRSA的检测 • 厚度为4mm的M-H琼脂平板 • 30μ g/d的头孢西丁纸片 • 0．5麦氏浊度的待测菌液 • 35℃培养24小时 • 结果判定：
抑菌环直径≤21mm即为MRSA 抑菌环直径≥22mm即为MSSA
4.重要耐药菌的检测
4.2 万古霉素耐药和低敏感性的葡萄球菌
• 1997年日本发现1株VISA
1.2.1 药敏试验目的： 1）为临床选用抗菌药物提供信息 2）对常见病原菌耐药状况监测，经验用药 3）评价新药的抗菌药效 4）分析医院感染流行株药敏谱，为单株流行提供依据。
1.概述
1.2 抗菌药物敏感性试验目的与适应症
细菌药敏试验及其耐药表型检测课件
药敏试验的分类
纸片扩散法
将抗菌药物纸片贴在接种了待测 菌的琼脂平板上，通过测量抑菌 圈大小来确定细菌对药物的敏感
程度。
稀释法
通过不同浓度的抗菌药物与细菌在 琼脂平板上接触，观察细菌生长情 况，以判断药物的抑菌浓度。
E-test法
将抗菌药物浓度梯度试纸贴在接种 了待测菌的琼脂平板上，根据抑菌 圈边缘与试纸条的交汇点读出最低 抑菌浓度值。
点，是临床常用的药敏试验方法之一。
04
药敏试验的结果解读
结果判读标准
敏感（Susceptible）
01
表示细菌对药物敏感，通常为≤2μg/ml或≤10μg/ml，具体标
准根据药物种类和实验方法而异。
中介（Intermediate）
02
表示细菌对药物中度敏感，通常为2μg/ml＜MIC＜10μg/ml或
某些细菌可以产生酶类，将药物分解 或灭活，从而降低或消除药物的抗菌 作用。
抗菌药物作用靶点的修饰
细菌通过增加或改变靶点蛋白的数量 或修饰状态，降低药物与靶点的结合 能力。
03
药敏试验的方法
纸片扩散法
总结词
一种常用的药敏试验方法
详细描述
纸片扩散法是一种简便、快捷的药敏试验方法，通过将含有一定浓度的抗菌药 物的纸片贴在接种了待测菌的琼脂平板上，观察细菌周围的抑菌圈大小，判断 细菌对药物的敏感程度。
细菌药敏试验及其耐药表型检测课 件
目录
• 细菌药敏试验概述 • 细菌耐药性及耐药表型 • 药敏试验的方法 • 药敏试验的结果解读 • 耐药表型检测的应用 • 展望与未来发展方向
01
细菌药敏试验概述
药敏试验的定义
• 药敏试验：指通过实验室方法检测细菌对抗生素等抗菌药物的敏感程度，为临床医生提供抗菌药物选择依据的过程。
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12
小误差
敏感 5
1 0.5
1
25
9
0.25 2020/11/36
8 10 12 14 18 20 22 24 26 28 30 32 348
不同国家的判定折点 －可能不同
原因：
用药剂量不同，服药的间隔不同 评价敏感时较保守 更强调检测出耐药株（即特定的耐药群） 技术因素：接种、培养基
细菌药敏试验及其耐药表型检测
药敏试验的意义
预测抗菌治疗的效果；
指导抗菌药物的临床应用；
发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临 床医生选择合适的药物，避免产生或加重细 菌的耐药；
监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握 耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药 菌感染的发生和流行。
2020/11/3
在我国主要遵循临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的抗菌药
物选择原则。
2020/11/3
9
敏感性分类(CLSI的定义)
敏感（Susceptible）
用常规用量治疗有效 常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的
规定常规测试报告的抗生素； 不同的药判定标准不同； 不同的菌判定标准也不同。
2020/11/3
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常规测试并报告的药物分组(1)
肠杆菌科
绿脓和非肠杆菌科
一级
氨苄西林
头孢他啶，庆大霉素
头孢唑林，庆大霉素
替卡西林，哌拉西林
二级
阿米卡星
阿米卡星
氨苄西林/舒巴坦
头孢吡肟，头孢哌酮
阿莫西林/克拉维酸
氨曲南
缓冲区：防止操作的系统误差造成重 大结果的判定错误
2020/11/3
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药敏试验的方法学
半定量…纸片扩散法 (抑菌圈直径) MIC法：
稀释法(肉汤、琼脂) 自动化仪法 抗生素连续梯度法 (Etest ) 流式细胞仪
2020/11/3
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纸片扩散法（Kirby-Bauer法）
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼 脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后 不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周 围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无 菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度， 并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。
器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于24mm， 纸片距平板内缘大于15mm。
2020/11/3
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纸片扩散法
7. 35℃孵育16～24小时量取 抑菌圈直径；
8. 根据抑菌环的直径，按照 CLSI标准判读，报告敏感、 中介、耐药。
2020/11/3
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纸片扩散法－影响因素
MIC 接种菌量 细菌生长率 抗生素含量、扩散性 平皿厚度 温度，预孵育时间
MIC 5倍以上。
耐药（Resistance）
用常规用量治疗不能抑制细菌的生长 MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度
2020/11/3
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敏感性分类（2）
中介 (Intermediate)
MIC接近血、体液中药物的浓度，治 疗反应率低于敏感株
药物生理浓集部位有效 (尿-FQ) 加大用药剂量可能有效
头孢呋肟，头霉素
环丙沙星，亚胺培南
头孢噻肟，头孢曲松
替卡西林/克拉维酸
环丙沙星，亚胺培南
妥布霉素，复方磺胺
替卡西林，哌拉西林
三级
氨曲南，头孢他啶
头孢曲松
卡那霉素，奈替米星
氯霉素，奈替米星
妥布霉素
四环素，氯霉素
2020/11/3
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常规测试并报告的药物分组(2)
葡萄球菌
肠球菌
一级 苯唑西林，青霉素 青霉素，氨苄西林
2020/11/3
6
MIC与抑菌圈直径的线性关系
Log2. MIC R I
S
2020/11/3
耐药
中介 敏感
D 1 d2 抑菌圈直径（mm)
7
抑菌圈直径与MIC的关系
MIC (ug/ml)
>256
12
3
5
256 128
2 2 耐药
22
2
1
小误差
极重要误差
64
32
1
1
小误差
中介
小误差
16
8
4
2
重要误差
二级 红霉素类
万古霉素
克林霉素，万古霉素
三级 氯霉素
庆大霉素
2020/11/3
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常规测试并报告的药物分组(3)
一级 二级 三级
流感嗜血杆菌
氨苄西林，青霉素 复方磺胺 头孢呋肟，头孢噻肟 头孢他啶，氯霉素 阿奇霉素，头孢克罗 环丙沙星，亚胺培南
肺炎链球菌
青霉素，红霉素 复方磺胺 氧氟沙星，四环素 万古霉素 氯霉素，利福平 利福平，四环素
2020/11/3
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纸片扩散法－标准化
CLSI：美国实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute)
每年修订更改
包括质控 新药的判定标准 特殊耐药性的检测
2020/11/3
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CLSI的法规
规定纸片含量、接种浓度、培养基、平 皿厚度、判定标准、质控；
2
药敏试验
MIC：在与微生物生长速率有关的特定 时间间隔内，通常是18～24小时，能够 抑制被测菌生长的最低药物浓度。
对倍稀释的优点：
操作容易 敏感株的MIC呈正态分布 区分异常(R)与敏感(S)的菌群
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3
药敏试验折点的建立
1. MIC的分布 2. 药代动力学和药效学 定 MIC的折点 3. 临床疗效和细菌清除率 4. 抑菌圈直径的分布 ………定抑菌圈折点
2020/11/3
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纸片扩散法
1. 水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.2～7.4，做成琼脂厚度 4mm，直径90mm的平板；
2. 挑取孵育16 ～ 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中， 振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。
2020/11/3
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纸片扩散法
3. 用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液； 4. 然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度； 5. 最后沿平板内缘涂抹1周； 6. 平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化的纸片分配
统计学的线性回归 计算错误率：尽可能减少极重要误差 (假敏感率)
2020/11/3
4
2020/11/3
20 15 10 5 0
MIC的分布
0.008 0.032 0.125
0.5
2
8
32 128 512
5
药代动力学和药效学
药代动力学：药物吸收，分布，代谢，排泄 药效学：药物对机体的作用
时间依赖型（％T>MIC〕：β-内酰胺类，大环内酯类 浓度依赖型（AUC/MIC比率〕：AGS, FQ 这些参数可用于计算具有最佳药效的给药方案