5种医用益生菌产品的微生物数量和种属分析
7种临床用口服益生菌制剂的活菌数量测定与分析
作者简介 :姚迪翡 ,女 ,药师 3 通讯作者 :徐翔 ,男 ,副主任药师 Tel: (0571) 87784540 E2mail: xytxu@126. com
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Chin JMAP, 2007 August, Vol. 24 No. 4 中国现代应用药学杂志 2007年 8月第 24卷第 4期
[ 4 ] MANEGOLD C, ZATLOUKAL P, KREJCY K, et a l. Gemcit2 abine in non2small2cell lung cancer [ J ]. Invest New D rugs, 2000, 18 ( 1) : 29.
[ 5 ] BRETTI S, MANZIN E, LODDO C, et al. Gemcitabine p lus cis2 p latin in the treatment of patients with advanced non2small2cell lung cancer: a phase Ⅱ study [ J ]. Anticancer Res, 2002, 22 ( 5) : 3039.
仪 (美国 BD 公司 ) , V ITEL - AM S全自动微生物鉴定仪和 (30～300个菌落 /皿为佳 ) 。
V ITEK2全自动微生物鉴定仪 (法国 B iomerieux公司 ) , AP I
根据 3个平皿菌落总数按下列公式计算活菌数 :活菌数
鉴定板条 (法国 B iomerieux公司 ) 。
羊血浆购自浙江大学医学院动物中心 。
统进行分析鉴定 。此方法可将细菌鉴定到种 。
1. 3 仪器
1. 4. 3 菌落计数 将平板置菌落计数器上或从平板的背面
生化培养箱 LRH - 250A 型 (广东省医疗器械厂 ) ,厌氧 直接以肉眼用标记笔点计 ,以透视光衬以暗色背景 ,仔细观
几种常用益生菌简介
几种常用益生菌简介1、两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）形态及培养特征：菌体外形呈高度变化的棒状，分叉、弯曲、不规则状。
在固体培养基上厌氧培养时菌落成圆形，微凸起，具有乳白色、不透明光滑粘液性表面。
革兰氏阳性，但随发酵时间变化可能出现异常；要求有机氮作氮源，最适生长温度36-38℃，≤20℃或≥45℃不生长；最适pH6-7，pH≤5.5生长缓慢或不生长。
培养基：TPY培养基或GAM 培养基或BS培养基应用范围：酸奶、乳酸菌饮料、奶酪、肉制品发酵、火腿香肠发酵、蔬菜发酵、大豆乳发酵、绿豆乳发酵、果汁发酵、谷物发酵、薯类发酵、酿酒；生产含益生菌奶粉、各类食品、各类饮品、各类乳制品、保健品、制成胶囊、压成片剂、粉状冲剂等。
动物、家畜、家禽、鱼饲料添加剂，用于猪、牛、鸡饮用水等，代替抗生素，减少药物在体内的残留量。
生物学功能：保持肠道微生态平衡，改善胃肠功能，润肠通便，使肠道处于健康状态。
2、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）形态及培养特征：呈短弯曲棒状，有时双歧棒状。
菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳白色、闪光并具有柔软的质地，厌氧，在有氧的的斜面上不生长，但对氧的敏感性因菌种不同而异。
最适生长温度35-37℃，≤20℃或≥46.5℃不生长；培养基：TPY培养基或GAM 培养基或BS培养基应用范围：酸奶、乳酸菌饮料、奶酪、大豆乳发酵、绿豆乳发酵、果汁发酵、；生产含益生菌奶粉、各类食品、各类饮品、各类乳制品、保健品、制成胶囊、压成片剂、粉状冲剂等。
动物、家畜、家禽、鱼饲料添加剂，用于猪、牛、鸡饮用水等，代替抗生素，减少药物在体内的残留量。
生物学功能：保持肠道微生态平衡，改善胃肠功能，润肠通便，使肠道处于健康状态。
3、长双歧杆菌（Bifidobacterium.longum）形态及培养特征：呈长、弯曲、棒状或球棒状，革兰氏染色性质可变，菌落隆起、光滑或起伏状，直径2-5mm,发光或粘液外表。
益生菌检验的检测方法
益生菌检验的检测方法益生菌的检验方法通常包括培养法、PCR法、酶联免疫吸附法（ELISA）、质谱法等。
以下是关于益生菌检验的50条方法及详细描述：1. 培养法：益生菌可以通过在富含营养物质的琼脂培养基中进行培养，观察生长情况和菌落形态来进行定性和定量分析。
2. PCR法：通过聚合酶链式反应（PCR）对DNA进行扩增，然后使用特定基因序列的引物进行检测，可以快速准确地检测益生菌。
3. 酶联免疫吸附法（ELISA）：利用益生菌表面的特定蛋白质进行ELISA检测，可以快速检测益生菌的存在和浓度。
4. 质谱法：利用质谱仪对益生菌进行分析，可以确定其分子量和结构，也可以用于鉴定益生菌的种属。
5. 荧光定量PCR法：利用特定的引物和荧光探针对益生菌的DNA进行扩增和检测，可以实现对益生菌的高灵敏度和定量测定。
6. 基因芯片技术：使用特定的基因芯片对益生菌进行检测，可以实现对多种益生菌的同时检测和鉴定。
7. 流式细胞术：利用流式细胞仪对益生菌进行流式细胞术分析，可以实现高通量的益生菌检测和鉴定。
8. 微生物电极法：利用微生物电极对益生菌进行电化学检测，可以实现对益生菌的迅速检测和定量分析。
9. 蛋白质质谱法：通过蛋白质质谱技术对益生菌进行蛋白质组学分析，可以揭示益生菌的代谢途径和功能。
10. 生物传感器技术：利用生物传感器对益生菌进行检测，可以实现对益生菌的实时监测和分析。
11. 纳米生物传感器技术：使用纳米技术和生物传感器对益生菌进行检测，可以实现对益生菌的高灵敏度和快速检测。
12. 毛细管电泳技术：利用毛细管电泳对益生菌进行检测，可以实现对益生菌的分离和鉴定。
13. 核磁共振技术：利用核磁共振技术对益生菌进行分析，可以揭示益生菌的结构和代谢情况。
14. 高效液相色谱技术：利用高效液相色谱技术对益生菌进行检测，可以实现对益生菌的成分和浓度的分析。
15. 荧光显微镜技术：利用荧光显微镜对益生菌进行观察和检测，可以实现对益生菌的生长和形态的分析。
益生菌等级划分-概述说明以及解释
益生菌等级划分-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述随着人们对健康意识的提高，益生菌作为一种有益于人体健康的微生物开始受到更多关注。
益生菌具有调节肠道菌群、增强免疫力、促进营养吸收等多种功能，因此被广泛应用于食品、保健品以及医学领域。
然而，市面上的益生菌产品琳琅满目，其品质和效果参差不齐，对于消费者来说，如何判断益生菌产品的质量和等级成为一个迫切的问题。
为了解决这一问题，益生菌等级划分应运而生。
益生菌等级划分是根据益生菌产品在质量和效果上的不同，将其分为不同等级，并制定相应的标准进行评定和认证。
这样一来，消费者就可以根据产品的等级进行选择，从而更加准确地得到适合自己需求的益生菌产品。
本文将从益生菌的定义和作用、益生菌的分类、益生菌等级划分的背景以及益生菌等级划分的标准等方面进行探讨。
通过对益生菌等级划分的深入了解，我们能够更好地了解益生菌产品的质量和效果，为消费者提供科学、合理的选择指南。
同时，本文也将对益生菌等级划分的意义、应用和展望进行探讨，以期为益生菌行业的发展和消费者的健康提供借鉴和启示。
在接下来的章节中，我们将从不同角度全面分析益生菌等级划分的相关问题，希望能够为读者提供一份全面、系统的信息，以促进益生菌行业的良性发展，并引领消费者正确选择和使用益生菌产品。
1.2文章结构文章结构本文主要分为引言、正文和结论三个部分。
下面将对每个部分的内容进行详细说明。
引言部分主要介绍了本文所讨论的主题，即益生菌等级划分的问题。
在引言的概述中，将简要介绍益生菌的定义和作用，为读者提供相关背景知识。
文章结构部分将在此处进行介绍，以帮助读者快速了解本文的构成。
正文部分是本文的重点，将详细探讨益生菌等级划分的相关内容。
首先，在益生菌的定义和作用一节中，将详细介绍益生菌的概念、特点以及其在人体健康中的作用。
接下来，在益生菌的分类一节中，将对益生菌进行分类，介绍不同种类和菌株的特点和功能。
在益生菌等级划分的背景一节中，将分析导致益生菌等级划分需求的原因和背景，为读者了解这一问题的发展提供相关背景资料。
可用于保健食品的益生菌菌种名单
附件：可用于保健食品的益生菌菌种名单（卫法监发〔2001〕84号）发布日期：2010-07-20 来源：卫生部浏览次数：505【发布单位】卫生部【发布文号】卫法监发〔2001〕84号【发布日期】 2001-03-23【生效日期】 2001-03-23【效力】【备注】两岐双岐杆菌 Bifidobacterium bifidum婴儿双岐杆菌 B. infantis长双岐杆菌 B. longum短双岐杆菌 B. breve青春双岐杆菌 B. adolescentis保加利亚乳杆菌 Lactobacillus. bulgaricus嗜酸乳杆菌 L. acidophilus干酪乳杆菌干酪亚种 L. Casei subsp. casei嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus卫生部关于印发真菌类和益生菌类保健食品评审规定的通知中华人民共和国卫生部2004-06-04 16:19:00卫法监发〔2001〕84号各省、自治区、直辖市卫生厅局，中国预防医学科学院：为规范保健食品审批，现印发《真菌类保健食品评审规定》、《益生菌类保健食品评审规定》。
请遵照执行。
附件：1、真菌类保健食品评审规定2、可用于保健食品的真菌菌种名单3、真菌菌种检定单位名单4、益生菌类保健食品评审规定5、可用于保健食品的益生菌菌种名单6、益生菌菌种检定单位名单二○○一年三月二十三日附件1：真菌类保健食品评审规定第一章总则第一条为规范真菌类保健食品评审工作，确保真菌类保健食品的食用安全，根据《中华人民共和国食品卫生法》、《保健食品管理办法》的有关规定，制定本规定。
第二条真菌类保健食品系指利用可食大型真菌和小型丝状真菌的子实体或菌丝体生产的具有特定功能的产品。
真菌类保健食品必须安全可靠,即食用安全，无毒无害，生产用菌种的生物学、遗传学、功效学特性明确和稳定。
第三条除长期袭用的可食真菌的子实体及其菌丝体外，可用于保健食品的真菌菌种名单由卫生部公布。
益生菌检验的检测方法
益生菌检验的检测方法益生菌的检验是非常重要的，可以通过多种方法进行检测。
以下是50种关于益生菌检验的检测方法，并对每种方法进行详细描述：1. 大肠杆菌计数法：采用琼脂平板法或膜过滤法，通过菌落计数的方法对益生菌进行检测。
该方法主要适用于大肠杆菌等益生菌的检测。
2. PCR法：通过聚合酶链式反应（PCR）检测益生菌的DNA序列，从而确认益生菌的存在和数量。
3. 荧光定量PCR法：利用荧光探针和PCR技术，对益生菌进行快速、准确的检测和定量。
4. 酶联免疫吸附法（ELISA）：利用特异性的抗体和酶标记技术，对益生菌进行免疫学检测。
5. 生物传感器法：利用生物传感器对益生菌的生理特性进行监测和检测。
6. 过氧化氢测定法：通过测定样品中过氧化氢的含量，间接检测益生菌的存在和活性。
7. 气相色谱法：通过气相色谱仪对益生菌代谢产物进行分析，以确定益生菌的种类和数量。
8. 超高效液相色谱法（UPLC）：利用超高效液相色谱技术对益生菌中的活性成分进行定量分析。
9. 电化学方法：利用电化学传感器对益生菌的代谢产物进行检测，实现对益生菌活性的快速监测。
10. 微流控技术：结合微流控芯片和检测设备，对益生菌进行高通量、高灵敏度的检测。
11. 潜热法：通过测定益生菌样品的潜热变化，间接确定其生长和代谢活性。
12. 毛细管电泳法：利用毛细管电泳技术对益生菌进行成分分析和检测。
13. 红外光谱法：通过红外光谱技术对益生菌样品进行特征光谱分析，从而确定其种类和数量。
14. 质谱法：利用质谱仪对益生菌样品进行分子质量分析，确定其成分和结构。
15. 拉曼光谱法：通过拉曼光谱技术对益生菌进行非破坏性的快速检测和鉴定。
16. 磁性生物纳米颗粒法：利用磁性生物纳米颗粒对益生菌进行富集和检测。
17. 液相色谱质谱联用法（LC-MS）：结合液相色谱和质谱技术对益生菌进行成分分析和定量检测。
18. 微波辐射法：利用微波辐射技术对益生菌样品进行快速灭菌和检测。
益生菌知识介绍-PPT
益生菌有许多令人惊奇的功效，但这些不同的功效高度依赖于“菌株的特定性”。也就是说，通过大量和长期的临床研究证实了某个特定的益生菌株具有某种明确的功能，但并不意味着其他同种益生菌的不同菌株也必定有同样或相似的功能。比如，丹尼斯克HOWARUä优质益生菌系列，经过多年科学研究和临床证实，证明其中某些特种菌株的特定配合，对于缓解某些健康问题，如肠道综合症、过敏、呼吸道感染等有着预防和缓解的功效，但并不能说明任何其他的同类菌株也有同样的功效
生活中的益生菌
益生菌从何获取？ 市面上的益生菌产品包括含益生菌的酸奶、酸奶酪、酸豆奶以及口服液、片剂、胶囊、粉末剂等。最方便的当算是饮品类。
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益生菌如何保存？ 益生菌产品必须低温冷藏保存。这样才能最大限度地保持其中活性益生菌的数量。一般保质期在1个月内，冷藏温度控制在2~10℃左右。建议放入冰箱保鲜层，避免在温度太高或者直射光下保存，这样会引起里面活菌过度发酵，口味变酸，效果受影响。
益生菌从何获取？ 市面上的益生菌产品包括含益生菌的酸奶、酸奶酪、酸豆奶以及口服液、片剂、胶囊、粉末剂等。最方便的当算是饮品类。
益生菌如何保存？ 益生菌产品必须低温冷藏保存。这样才能最大限度地保持其中活性益生菌的数量。一般保质期在1个月内，冷藏温度控制在2~10℃左右。建议放入冰箱保鲜层，避免在温度太高或者直射光下保存，这样会引起里面活菌过度发酵，口味变酸，效果受影响。
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嗜酸乳杆菌
保加利亚乳杆菌
干酪乳杆菌
发酵乳杆菌
胚芽乳杆菌
短乳杆菌
纤维二糖乳杆菌
乳酸乳杆菌
乳酸杆菌
链球菌有：
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粪链球菌
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益生菌中乳酸菌概况及检测技术的研究进展
益生菌中乳酸菌概况及检测技术的研究进展周莉; 平洋; 谭静; 张亚勋; 罗蓓蓓【期刊名称】《《中国调味品》》【年(卷),期】2019(044)010【总页数】5页(P190-194)【关键词】益生菌; 乳酸菌; 检测技术; 研究进展【作者】周莉; 平洋; 谭静; 张亚勋; 罗蓓蓓【作者单位】河南省商业科学研究所有限责任公司郑州 450002【正文语种】中文【中图分类】TS201.571 益生菌概述益生菌(probiotics)的概念最早源于希腊语，意为“对生命有益”。
2001年，联合国粮农组织和世界卫生组织将益生菌定义为“当活性微生物足量且给予宿主健康益处”。
但是由于“健康益处”这一概念太过于模糊，世界卫生组织将其进一步补充为“对主体的益处必须实现，并且被证明超过安慰补偿剂的范围”[1]。
益生菌是指通过改善人类肠道菌群进而改善人体健康状况的一类活菌，但不是所有的有益菌都称得上是益生菌，要想成为益生菌需符合以下条件：能够耐受胃液、胆汁的腐蚀；在肠内是存活状态且能增殖；能够改善肠内菌群；保证安全性；活菌状态且含一定菌数；经济实惠且容易处理[2]。
益生菌不仅具有改善食品风味，延长食品保质期，提高食品营养价值的功能，而且其还具有调节胃肠道菌群正常和维持人体肠道卫生平衡的功能[3]。
益生菌在益生菌饮品、益生菌制剂和膳食添加剂中应用广泛，如益生菌饮料乳制品和益生菌胶囊等。
1.1 益生菌中乳酸菌概述对于益生菌的研究，越来越多的学者将各种食品与益生菌结合起来，将益生菌添加到不同食物中进行研究[4，5]。
在所有益生菌中, 目前研究得最深入、最受重视的一类当属乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB), 乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。
它是一种有利于机体健康的微生物，革兰氏阳性杆菌或球菌,获得能量的方式是发酵碳水化合物,从而产生乳酸。
它不仅能够调节肠道菌群平衡,并产生抑菌代谢产物，抑制腐败菌的生长。
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5 种医用益生菌产品的微生物数量和种属分析
但国蓉 * ,袁 静 ,唐 欢 ,魏 泓 # (第三军医大学基础部动物学教研室 ,重庆市 400038)
中图分类号 R95
文献标识码 A
文章编号 1001- 0408 (2006) 07 - 0530 - 03
摘 要 目的 :比较市售 5 种医用益生菌产品的活菌数量 、种属与产品标签是否一致 。方法:采用选择平板菌落计数法检测产品的 活菌数量 ,利用 16S rDNA 序列分析 、鉴定分离菌株的种属 。结果 :5 种产品共 25 批的活菌数含量只有 1 批低于标签标注的数量 。 分离的 10 株菌中有 3 株种属与标签标注的不一致 。结论 :考察的 5 种产品中 ,菌株种属与标签标注存在差异 ,但产品的活菌数量与 标签标注基本一致 。 关键词 益生菌产品 ;标签 ;微生物 ;数量 ;种属
BL AS T 工具将测定的序列与 Gen Bank 中的序列进行同源性 分析 ,并从中选出相似性最高的 3 个序列 ,再在 Gen Bank 中找 到乳杆菌属的嗜酸乳杆菌 (L 1acidop hilus) 、干酪乳杆菌 (L 1 casei) 、德氏乳杆菌亚种保加利亚 (L 1delbrueckii subsp 1bulgaricus) 、詹氏乳杆菌 (L 1jensenii) 、植物乳杆菌 (L 1plantarum) 、 鼠李糖乳杆菌 (L 1rhamno sus) 6 个种和双歧杆菌属的青春双歧 杆菌 (B1adolescentis) 、动物双歧杆菌 (B1animalis) 、两歧双歧 杆菌 (B1bifidum) 、短双歧杆菌 (B1breve) 、婴儿双歧杆菌 (B1 infantis) 、长双歧杆菌 (B1lo ngum) 6 个种的 16S rDNA 序列 。 应用 Clustal X118 、P H YL IP 和 Tree View 等软件 ,根据邻位相 连法 (Neighbo r - joining met ho d , NJ ) 构建系统发生树 。先用 Clustal X118 软件将分离株的序列与 Gen Bank 中找到的 16S rDNA 序列进行排序 , 依次利用 P H YL IP 软件包中的 SEQ2 BOO T 、DNAD IS T 、N E I GHBO R 和 CON SEN SE 等软件分析 构建出一致的引导进化树 ( St rict co nsensus boot st rap t ree) 。
表 1 5 种医用益生菌产品标签上标注的菌的种属和数量
Ta b 1 Genera and numbers of stra ins of 5 probiot ic
products f or medic inal purposes spec if ied on ta gs
产品
益生菌种属
A
长双歧杆菌
嗜酸乳杆菌
P TC - 150 型 PCR 仪 (美国 MJ R ESEA RCH 公司提供) ; 水平电泳仪 (江苏海门市麒麟医用仪器厂提供) ; Bio - Rad Gel Docห้องสมุดไป่ตู้000 型凝胶成相系统 (美国 Bio - Rad 公司提供) ; YQ X 1 型厌氧培养手套箱 、SPX - 250B 型生化培养箱 (上海跃进医
ABSTRACT OBJ EC T IV E : To co mpare w het her t he numbers and species of st rains of 5 p ro biotic p ro duct s fo r medical p ur2 po ses sold in t he market are in line wit h t ho se stated o n t he labels 1M E T HODS : Viable co unt of p ro biotic p ro duct s was per2 fo rmed by selective plating co unt met ho d and species of t he isolated st rains were anal yzed and identified using 16S rDNA se2 quencing1R ESUL TS : Regarding viable co unt , o nly o ne of t he total 25 batches of samples in 5 p ro duct s was lower t han t hat stated o n t he label 1As fo r species ,of t he 10 isolated st rains ,3 failed to be in co nsistent wit h t hat stated o n t he label 1CON CL US ION S : Fo r t he 5 p ro duct s investigated ,inco nfo rmit y was noted bet ween st rain species and t hat stated o n t he labels ,however , t he same viable co unt s are noted bet ween t he p ro duct s and t hat stated o n t he labels1 KEY WO RDS Pro biotic p ro duct s ;L abel ;Microo rganism ;N umbers ;Species
11514 DNA 序列测定 : 用纯化 PCR 产物做模板和 PCR 引 物做测序引物 ,在 DNA 自动测序仪上测序 。测定的 DNA 序列 以双链碱基互补的结果为准 。
116 菌株 16S rD NA 序列同源性分析及进化树的构建 将测定序列上传至 Gen Bank 数据库获登陆序列号 , 用
1 材料与方法
111 供试药品 5 种医用益生菌产品 (A 、B 、C 、D 、E) 各 5 个批次购自重庆
各大医院及药店 。根据产品标签说明 , 产品 A 、B 、E 于 4 ℃保 存 ,C 、D 于阴凉干燥处保存 。产品在购买后 1mo 内完成计数检 测及菌株分离 。每种产品标签上标注的益生菌种属和数量详见 表 1。 112 培养基
Numbers and Spec ies of Microorgan isms of 5 Probiotic Products f or Medic inal Pur poses DAN Guo ro ng , YUAN J ing , TAN G Huan , W E I Ho n g (Dep t 1of Animal Science , Colle ge of Basic Medicine , The Third Militar y Medical U niversit y ,Cho ngqing 400038 ,China)
M RS 培养基和肠球菌选择培养基 (CM0377) , 均购自英 国 Oxoid 公司 ;营养琼脂培养基购自北京奥博星生物技术责任 有限公司 ; 酸性 M RS 培养基 : 将 M RS 培养基用稀盐酸 ( HCl)
* 硕士研究生 。研究方向 :应用微生物 。电话 : 023 - 68753882 # 通讯作者 : 教授 。研究方向 : 生物资源的开发与应用 。电话 : 023 - 68752051 。E - mail :weiho ng @mail 1t mmu1co m1cn
益生菌制剂是可以改善宿主肠道微生态平衡且含生理性 活菌的微生物制剂 [1 ] , 其在治疗乳糖不耐症 、菌群失调 、肠炎 、 腹泻等方面均有疗效 。但近年来的国外研究发现 , 市售的有些 益生菌制剂的微生物种类和数量与产品标签上标注的种类和 数量不符 [2 ～5 ]。临床试验证实 , 只有摄入足够数量的益生菌才 能发挥作用 ;同样 ,菌种是益生菌制剂质量的直接保证 ,对于上 述问题国内目前还未见相关报道 。在本文中 , 笔者利用 16S rDNA 序列分析来鉴定市售的 5 种医用益生菌产品分离菌株 , 并检测了每种产品多批次的活菌数含量 , 对其进行了统计学分 析 ,这在国内尚属首次报道 。
调 p H 值至 514 ±011 ; M 17 培养基 : 将 D IFCO 公司提供的 M 17 基础培养基添加 5 ‰的蔗糖 ; BSM 培养基 [6 ] : 于 M RS 培 养基中添加 0105 %的盐酸半胱氨酸 (北京化学试剂公司提供) 高压灭菌 , 待培养基冷至 48 ℃左右 (倾倒平板之前) 加入莫匹 罗星水溶液使其终浓度为 50μg/ ml 。其中 , 莫匹罗星水溶液是 由百多邦软膏内容物以无菌蒸馏水稀释至 1mg/ ml , 充分溶解 后 ,过滤灭菌而得 。 113 仪器
粪肠球菌
B
青春双歧杆菌
C
地衣芽胞杆菌
D
枯草芽胞杆菌
屎肠球菌
E
嗜热链球菌
保加利亚乳杆菌
长双歧杆菌
数量
≥1 ×107 CFU / 粒 ≥1 ×107 CFU / 粒 ≥1 ×107 CFU / 粒 5 ×107 CFU / 粒 215 ×108 CFU / 粒 115 ×107 CFU / 袋 1135 ×108 CFU / 袋 ≥5 ×105 CFU / 片 ≥5 ×105 CFU / 片 ≥5 ×105 CFU / 片
2 试验结果
211 益生菌产品的选择计数 在检测的 25 个批次中有 24 个批次 (96 %) 达到产品标签
标注的活菌数量 。各产品计数的具体结果详见表 2 。
·530 · China Phar macy 2006 Vol . 17 No . 7
中国药房 2006 年第 17 卷第 7 期
疗器械厂提供) ; T GL 16 台式高速冷冻离心机 (中国科学院武 汉科学仪器厂提供) 。 114 样品的稀释计数
每种产品在无菌条件下取约 1g , 加入稀释液 (生理盐水溶 液) 9ml 中 , 充分混匀 , 10 倍系列稀释 , 取最后 3 种稀释度溶液 各 100μl 滴入选择性培养基平皿上 , 重复 2 次 , 并用 L 形棒涂 布均匀 ,置于适宜条件下培养 ,数日后观察平皿菌落生长情况 , 取菌落数大于 15 小于 300 的平皿进行计数 。根据 3 个平皿菌 落总数按下列公式计算活菌数 : 活菌数 (CFU / 粒) = (3 个平 皿菌落数之和/ 3) ×(10/ 粒数) ×稀释度 115 菌株 16S rD NA 序列测定 11511 基因组 DNA 提取 :按文献 [7 ]提供的方法进行 。 11512 聚合酶链式反应 ( PCR) 扩增 : 以提取的细菌基因组 DNA 为模板 PCR 扩增 16S rDNA 。所用细菌通用引物 27f (5’A GA GT T T GA TCC T GG C TC A G - 3’) 和 1 492r (5’ GGT TAC C T T GT T AC G AC T T - 3’) [8 ] ,由上海英骏生物 公司合成 。PCR 反应体系 (50μl) :10 ×PCR 缓冲液 5μl ,脱氧核 苷三磷酸 (dN TP) (215μmol/ L ) 4μl , 27f 和 1 492r 引物 (20μmol/ L ) 各 1μl , Taq 酶 (215 IU /μl) 1μl ,模板 DNA 1μl ,去离 子水 27μl 。PCR 反应条件 :94 ℃变性 5min ;循环 30 次 :94 ℃变 性 30s , 55 ℃退火 30s , 72 ℃延伸 2min ; 再 72 ℃延伸 5min , 于 4 ℃保存 。 11513 PCR 扩增产物纯化 : 扩增产物在 1 %琼脂糖凝胶 (含 015μg/ ml 溴乙啶) 上电泳 , 按公司提供的操作手册用 DNA 回 收试剂盒从凝胶上回收纯化目的片段 。