疟原虫血涂片制作作业指导书
疟疾血片制作
薄 血 膜 制 作
▲将推玻片向1的方向稍抽回，当 血液充满推玻片适当宽度（约 2cm）后，以一定均匀的速度 向2的方向滑动（约2.5cm）。
制作薄血膜：
制作薄血膜：
◆血涂片质量评价： 血膜均匀、厚薄度合适、无空泡、无划痕
薄血膜头体尾位置和形状好、无停顿起伏、 两侧留出空间
注意： 血滴大，速度快、角度大 血滴小，速度慢、角度小
血片的制作续…
2、采血时间：症状发作后数 小时至10小时之内。
3、采血部位消毒：用沾有碘 酒的棉棒在患者手指末端、 耳垂、拇趾或足跟（婴幼 儿）从内向外画同心圆。
4、采血：将采血针迅速刺入 取血部位1~2mm深，用大 拇指、食指协同挤出血滴。 第一滴血因含有酒精，用 棉签擦去。再挤出第二滴 血用于制作血片。
二、血片染色
▲血片染色在血片的制作过程中是 一个重要的环节，染色质量的好坏， 直接影响到疟原虫的检出率，也是 直接影响疟疾病例确诊与否的关键。
▲ 疟疾血片的染色有瑞氏染液和吉 氏染液两种，我们现在重点介绍吉 姆萨染液染色法。
血片染色续…
▲ 染液为省寄生虫病防治所统一配制的吉
姆萨染液；为方便开展工作，经省寄生虫 病防治所反复试验，缓冲液选择市面上供 应的娃哈哈矿泉水为佳（在条件允许时配 制pH7.0~7.2的缓冲液为最佳选择）。 ■注：珠海贝索生物技术有限公司生产的 Baso姬姆萨染液：
疟疾血片制作
临沧市疾病预防控制中心
史爱军 2016年3月
主要内容
■血片的制作 ■血片的染色 ■影响血片制作质量的因素及
注意事项
◆重点应掌握的要点：
▲疟疾血片厚、薄血膜的制作要领。 ▲疟疾血片制作注意事项。
▲掌握血片制作技巧、反复练习。
疟原虫镜检技术操作规范
疟原虫镜检技术操作规范疟原虫镜检是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量，特制定本操作规范。
一、血片制作（一）所需器材载玻片玻片3张（1张作载玻片，1张作推片，1张作采血后滴于玻片备血用）采血针采用一次性采血针。
玻片盒存放50或100片玻片的木质或塑料盒。
皮肤消毒液、棉签或酒精棉球75%的酒精、安尔碘、碘伏等皮肤表面消毒剂。
记号笔用于玻片上书写血检病人基本信息。
（二）操作步骤1、载玻片基本信息登记取1张载玻片，首先用目测法将载玻片从右（磨砂处为右）到左等分成6格，接着用记号笔在第1、2格即（磨砂处）写下血检病人基本信息：编号、姓名、制片日期结果（镜检结束后补写）。
载玻片上信息应与血检登记表中的项目对应。
如图12、采血采血部位为手指末端或耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。
用消毒剂消毒取血部位皮肤后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm 深，约挤出1-2滴血，滴于玻片上（以备涂制厚薄血膜用）。
3、涂制血膜用推片的左下角刮取玻片上的血液4～5μl，涂于载玻片的第三格（靠近磨砂侧），由里向外一个方向旋转2～4圈，涂成直径为0.8～1.2cm的圆形厚血膜；再用该角沾取血液1～1.5μl血置于载玻片的中心点即（第四格前缘中点）；接着用干棉球或卫生纸擦净推片角上的血渍；最后用推片的下缘置载玻片的中心点（1～1.5μl血液处），当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速推成舌状薄血膜，即（薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部）。
如（图1）、（图2）疟原虫镜检涂制血膜方法示意图2薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳，（直观透过玻片能清晰看到报纸上的字）；厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。
二、固定（一）所需器材1、甲醇2、器具玻璃棒、吸管（二）操作步骤薄血膜固定薄血膜晾干后，用玻璃棒沾取或用吸管吸取少量甲醇平铺于薄血膜上，起固定薄血膜作用，（注意不能固定厚血膜）。
疟原虫血片制作及染色
血膜制作的注意事项
3. 血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干 透后才能用甲醇固定薄血膜，并对厚血膜溶血。 夏天标本尽可能24~48小时内固定、溶血和染色； 冬天也不能超过72小时。放置时间越久，厚血膜 越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色， 薄血膜宜先用甲醇固定，然后用蒸馏水（或过滤 的清水）对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖 严，待以后染色。
标本片
厚、薄血膜的优缺点及其适用范围
厚血膜
用血量约为4μl～5μl,涂制成直径0.8 ～ 1cm的厚血
膜,由于在制备过程中红细胞已溶解，疟原虫在形态 上仍可分辨，但胞浆和胞核不可避免地形成一定程度 的固缩。受影响较大的有大、裂殖体的形态。
由于厚血膜与薄血膜相比血量大，须查范围小，节省时间
，阳性检出率较高。厚血膜能查出疟原虫数是薄血膜的15 ～25倍。所以，我们推荐疟疾诊断（门诊检验及现场普
发热期外周血中以环状体（小滋养体）为主，也可见到裂殖 体；
出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性。 发作后数小时，间歇期外周血中以大滋养体为主，形态较易
辩认，为诊断的有 利时机；
发作36-48h，可检出裂殖体； 发作1-2次后，配子体出 现较多。
现在六页，总共四十九页。
血膜制作（取血时间）
恶性疟较理想的取血时间是在发作后至 20h内取血，发作 后2小时左右，此时环状体发育至最高峰，初发患者退 热后常查不到原虫。末梢血血检到恶性疟原虫配子体， 是在末梢血出现环状 体之后的7-10天。
各种细胞和疟原虫主要是由不同的蛋白质或类氨基酸 组成。不同的氨基酸均含有氨基（NH2）和羧基（COOH ）。在游离状态时，氨基（NH2）获得一个氢离子成为带阳 电的离子（NH3 + ）；而羧基失掉一个氢离子成为带阴电的
7疟原虫及虫卵显微镜检查
粪便水洗沉淀法
肝吸虫卵
大小：最小虫卵（30×20μm） 形状：芝麻、西瓜子 颜色：淡褐色
卵壳厚薄：较厚，疣状突起
卵盖：肩峰突起 卵内含物：梨形毛蚴
肺吸虫卵
大小：比受精蛔虫卵大 形状：椭圆、多态 颜色：金黄色 卵壳厚薄：厚薄不均 卵盖:大、倾斜 卵内含物：卵细胞、 卵黄细胞
文本内容
姜片虫卵
大小：最大的虫卵 形状：长椭圆形 颜色：淡黄色 卵壳厚薄：薄、均匀 卵盖：较小 内含物：卵细胞、 卵黄细胞
疟原虫显微镜检查
张永海 2014.6
病原学检查---厚薄血膜法
2
血涂片制作及染色 1．材料 ：载玻片，消毒棉球，酒精，剪刀，蜡笔，吸 管，蒸馏水，培养皿，姬氏或瑞氏染液，缓冲液等。 方法：薄血膜加厚血膜 厚血膜涂片： 优点：检出率高，用于定性。 缺点：不易鉴别虫种 薄血膜涂片： 优点：容易辨认虫种 缺点：易漏检。
虫卵显微镜检查
粪便检查法
生理盐水涂片法
基本原理：生理盐水作为粪便的稀释剂 ，使病原 体在等渗环境下保持原有形态和活力以利于观察。 适用：产卵量较多或较大的寄生虫。
实验材料：载玻片、盖玻片、竹签、滴管、大便 杯生理盐水、显微镜。
生理盐水涂片法--步骤
1）滴一滴生理盐水在载玻片中央。
2）用竹签取米粒大小的粪便，在生理盐水中混 匀，其厚度能透过粪膜隐约辨认玻片下的字迹为 宜，注意去除粪便渣滓。一般在低倍镜下检查， 镜检顺序，由上至下，由左至右，不要遗漏。如 发现可疑物再转高倍镜观察，加盖玻片 。
棉拭子法
试剂：生理盐水、饱和盐水 （2）仪器：棉棒、载玻片、试管、青霉素小瓶 （3）操作步骤 ①将棉签浸入试管中的生理盐水中，取出时拧去过 多的水滴。 ②清晨排便之前在肛门周围擦拭。
疟原虫血片制作
疟原虫血片的制作工需要材料1 .采血器材：75%酒精棉球、一次性采血针、玻片、推片、铅笔、干净的绸布或化纤布。
2 .染色材料：①姬氏原液②.蒸储水或纯净水：①稀释姬氏原液②染色时冲洗染液③固定剂：①用甲醇或无水乙醇（乙醇含量达99.9%）,固定薄血膜②用无水乙醇擦洗油镜头。
④脱油剂：无水乙醍或二甲苯：镜检后的血片脱镜油。
油镜头脱油可用无水乙醍：无水乙醇的7:3混合液擦拭。
⑤擦镜纸。
二、采血前准备：1.玻片准备⑴我们现在用的玻片都是除去油渍的脱脂玻片，使用前可用绸布擦去玻片上纤维和浮灰，即可使用。
⑵新的尚未脱油脂的玻片：用洗衣粉水洗净后，一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好。
⑶已用过的旧玻片：先消毒后用洗涤剂清洗，去除污渍，再一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好2.玻片编号：在玻片的磨砂端用铅笔进行编号。
玻片编号、检验报告单号和登记号应一致，并具有唯一性。
3.采血时间：⑴间日疟、三日疟原虫患者可在发作的任何时间进行采血，但由于患者刚发冷发热以后，大部分是在环状体期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。
所以在发作后的6〜8小时内采血为最佳，这时环状体以滋养发育成晚期滋养体，较易识别。
⑵。
恶性疟原虫；从理论上讲，因为恶性疟原虫的裂体生殖是在内脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者的末梢血液中不易查到，但实际情况不尽如此，一般在受感染者的末梢血液中，随时能见到少量的恶性疟原虫的环状滋养体；虽然如此,较理想的采血时间，是在发作后的20小时左右，因为这个时候，环状体虽已发育至最高峰，但尚未回到内脏毛细血管中去进行裂体生殖。
环状体的数量和构造。
有助于疟原虫种类的鉴别，恶性疟原虫的配子体很容易识别，但在初发时，一般需要在发作7〜10日后才能在末梢血液在由现，应当注意。
4.采血的部位和方法；部位：以耳垂采血为主。
疟疾血片制作
D. 冲洗染液时，水流轻缓，勿冲走厚血膜 。
精品课件
疟疾检测的注意事项
➢ 1.同一个病人的血涂片样本要大于等于5张。 ➢ 2.标本一定要做好标记，上报结果时，一定要
把观察到疟疾病原虫的血涂片标本一起交上来 。 ➢ 3.标本染色时，不要一次把所有标本全部染完 ，分批次染，找到最好的血涂相接触而不相互 重叠为佳。
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血片的制作（厚血膜涂片）
用推片的一角刮取4~5微升血量（相当 于火柴头大小），使血滴涂于载玻片的中央偏右 处，由里向外一个方向旋转2圈，涂成直径 0.8~1.0cm的圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易 于脱落，过薄达不到检出率的要求（厚度以1个油 镜视野内可见5~10个白细胞为宜）。
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血膜染色前的处理
➢ 固定薄血膜 血片干燥后，用吸有甲醇的吸 管在薄血膜表面轻轻涂抹，自然干燥。注意固 定时甲醇不要接触厚血膜，否则会影响厚血膜 的溶血。
➢ 溶解厚血膜 血片干燥后，用滴管滴水于厚 血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倒去，晾干 。（吉姆萨染色：直接）
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血膜制作注意事项
1. 清洗玻片，且勿碰撞、磨损 2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内 3. 血膜应自然干燥 ，要充分干燥。
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血片的制作（薄血膜涂片）
薄血膜 取洁净的载玻片1张，左手持
载玻片平置,右手持推片，推片一端边缘 的中点刮取血液1.0~1.5微升（相当于1/4 火柴头大小），使血滴与平置的载玻片中 线接触，待血液向两侧扩展约2cm宽时， 以25°～35°夹角均匀而迅速地向左推成 舌状薄血膜（约2.5cm长）。
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血片的制作（血膜位置）
通常将厚、薄血膜涂在一张载玻片 上。方法是将载片分为6等分，第1、2 格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3 格中央；薄血膜涂在第4格前缘至第6格 中部。
检查疟原虫的血涂片制作与染色
检查疟原虫的血涂片制作与染色基本原理：疟原虫寄生在红细胞内，经染色后可对疟原虫形态做出鉴定。
材料准备：75%酒精、采血针、推片、载玻片、吉氏染液、甲醇、滴管、刻度管.(1)清洁载玻片的方法：将载玻片用清水清洗干净后晾干，再在稀释清洁液中浸泡1~2天，取出后用水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗，烘干，经95%酒精浸泡后，擦干。
清洗过的玻片用干净无油的纸包好备用。
(2)吉氏染液配制：○1原液配制，吉氏染剂粉1g，甲醇50ml，中性甘油50ml。
将吉氏染粉置乳钵中，加少量甘油充分研磨（30min以上），继续边加甘油边研磨，至加完为止。
然后转入烧瓶内，置55~60恒温水浴中，充分震摇使溶解（约2h）,冷却后加入甲醇，储于棕色瓶中，塞紧瓶塞，充分摇匀，1~3周后过滤，即为原液，配制时要研磨充分，不可混入水，配好后要密封，放置越久染色性能越好；○2工作液临时配制：将吉氏原液用pH 6.8~7.2的PBS作1:15~1:20稀释混匀即可。
操作方法：采用疟原虫感染小鼠做血涂片并染色.(但以下采血以人为例)（1）采血:1时间据各种疟原虫在人外周血中出现的规律，间日虐和三日疟患者可在发作后任何时间取血，但以发作后10h 以内最佳，恶性疟原应在发作开始后不久做血检，患者刚开始发作时原虫密度较低可能检测不到，所以应在第二次发作时再做一次以免漏诊：2部位成人可在耳垂或指尖，婴儿宜在脚跟或者大拇指：3方法先用75%酒精给皮肤消毒，右手持一次性无菌采血针迅速刺入皮肤2mm，轻轻挤压周围皮肤，弃去第一滴血，再取1滴作薄血膜，2滴作厚血膜。
薄血膜取血量少，涂面大，原虫分散，但形态清晰，易作虫种鉴别：厚血膜血量多，RBC集中，在原虫数量较少时便于发现，但因制作时细胞相互挤压堆积，原虫形态难认。
（2）涂片：1薄血膜制作取1滴置于洁净载玻片上，用1张磨口边缘作推片。
推片时用力要均匀，一次推成，保证血膜应呈舌形，RBC分布均匀。
2厚血膜制作用推片一角取血2滴，治愈薄血膜片右方用推片角由里向外顺一个方向旋转，使血滴形成直径约1cm的圆形血膜。
疟原虫血片制作染色精讲
血片的染色 （一）染液的种类及染色原理
染液种类：目前所用的血片染色液，虽然名称 很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的染液 变化过来的。总的可分为水溶液和酒精溶液 两大类，前者包括罗氏、西氏（Simon)、 J.S.B氏染液等，后者包括利氏 (Leishman)、瑞氏和吉氏染液（被国家推 荐使用）等。这些染液中的主要染剂都包含 美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青，所以 称为多色性染剂。
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影响染色效果的因素
（4）染液的稀释浓度 染液的浓度高其着 色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛 氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度 过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不 明显或消失。
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影响染色效果的因素
（5）染色时间 染色时间长染色效果好， 反之较差。室温高则着色快，染色时间可 略缩短，气温低可适当延长。因此染色时 间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和 气温而适当增减。
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薄血膜血量及涂片法
薄血膜 取洁净的载玻片2张， 1 张平置在桌上，以左手拇 指，食指夹持载玻片两端 （手指切勿接触玻片表面）， 用另一张边缘平滑（最好为 磨口边缘）的载玻片做推片， 用推片一端边缘的中点从取 血部分刮取约1~1.5微升的 血量（相当于 1/4火柴头大 小），使血滴与平置的载玻 片接触，并形成 25~35 度 夹角，待血液向两侧扩展约 2 厘米宽度时，均匀而迅速 地轻轻向左推出（约 2.5 厘 米长）且边缘带有“舌状” 的薄血膜。
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涂制厚、薄血膜的位置
通常是将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法 是将载玻片分为 3 等分（留出标签或磨砂面位 置后的 3 等分）。厚血膜涂在载玻片靠近标签 或磨砂面方向的右1/3中央处，圆形、厚薄均 匀、边缘整齐。薄血膜涂在载玻片 1/2 至左 1/3的中部位置，舌状、厚薄均匀。
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疟原虫血涂片制作作业指导书
1.目得
指导实验室人员制作血涂片，完成疟原虫检测工作
2.适用范围
适用于实验室检测人员
3.职责
疟原虫血涂片制作人员负责涂片编号及保存,
4、作业指导
4、1样本采集及要求
4、1、１采用抗凝管采血：或在采血管里加入抗凝剂，将采集血样加入并摇匀，备用
4、１、2指尖血、静脉全血（抗凝血)样本均可适用
４、2血涂片得制作：
４、2、１血膜种类与位置
薄血膜：占玻片得近1/２.将血液涂呈薄膜状，血细胞平辅在玻片上面
厚血膜:占玻片得1／６。
血液涂成圆形，血量多
得载玻片接触,再由里向外旋转,转４~ 8圈直径0、8 ~ 1cm圆形厚血膜,血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率得要求.厚血膜厚度以油镜视野可见5 ～１0个白细胞为宜。
厚血膜血量：4～５ul微升，外形：圆形，直径0、８～１、0ｃm 4、2、3薄血膜制作
取洁净得载玻片2张,１张以左手拇指,食指夹持载玻片两端,用另一张边缘平滑得载玻片做推片，用推片一端边缘得中点取血约1～1、5uｌ得血量(小米粒大小），使血滴与平置得载玻片接触,并形成２5~30度夹角,待血液向两侧扩展宽约2cｍ时,均匀而迅速地轻轻向左推出(约2、５cm长)薄血膜血量：1～1、5ul位置：玻片1/2外形:薄度均匀、无痕、长度:２、0~2、5cｍ
4、２、４血膜编号:血膜编号：血膜制成后，以防差错,待薄血膜干后用B2铅笔，在薄血膜得右上角或血膜底部,写上受检者得个人编号。
4、3血涂片固定及染色
４、３、1甲醇固定薄血膜
载玻片略向下倾斜，从一侧挤出甲醇，试管平推下划即可.甲醇不能触碰到厚血膜
4、３、2单张染色法
在量筒内加2ml缓冲液或ph７、0～7、2净水, 滴加吉氏原液4滴(每ｍl２滴),混匀,然后滴在已充分干躁得厚薄血膜上，染色３０mｉn。
1张玻片需２ml水,2滴／ml染液，染色2５—30min
４、3、3染色效果
血膜蓝中带紫色,如果血膜颜色偏红色, 说明染色偏酸性;血膜偏蓝色, 则为偏碱性。
4、4注意事项与其它因素
４、4、１载玻片必须清洁无油污,拿玻片时拿侧楞,固定薄血膜时,甲醇不要触碰到厚血膜，放置３天以上得血片，在染色之前先用清水滴加在厚血膜上进行溶血，再进行染色，厚血膜干燥时不要高温加热，充分干燥后方可染色已稀释得吉氏染液，须在30分钟内用完,冲染液时,要漂洗以免冲掉厚血膜，将血膜标本（血膜面朝下）插于凉干板上晾干。
4、4、2薄血膜过厚原因：使用血滴过大、玻片与推片之间夹角过大、展开血膜得动作太快
４、4、３血膜脱落原因、载玻片不干净、血量多血膜厚、血膜没干透、冲洗方法不当
4、4、４、染料溶剂得质量
染液（母液)在使用时避免水对其污染，用专用无水得滴管取染液.染液得新旧：
新配制得染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。
染液存放时间越久，染色力越强.通常在染液配制１~2周后才使用,盛装染液得瓶子应加塞盖密,以防吸潮而影响染液质量。
染液稀释后使用时间：吉氏染液得主要成份就是美蓝、伊红与由美蓝氧化产生得天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝与天青即产生沉淀.因此，必须在稀释染液当时使用,一般在半小时内染色力最强.染液得稀释浓度染液得浓度高其着色快而深,染液得浓度低其着色慢而浅或发绿。
染色时间染色时间长染色效果好，反之较差。
室温高则着色快，染色时间可略缩短,气温低可适当延长.染色用水染液得稀释用水偏酸或偏碱,可用缓冲蒸馏水调整.染色后发现血膜颜色偏蓝(偏碱）或偏红(偏酸)时，可用与之相反得酸、碱度水冲洗血片予以纠正染色后不要直接将染液倒掉沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出,并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。
4、４、５刚涂制得血膜要平放在标本盒内,厚血膜未干前勿使标本盒倾斜,以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不
易溶血与着色而影响检查结果。