实验五 油菜自交不亲和性鉴定
自交不亲和性测定和自交不亲和系筛选
一目的和意义学习自交不亲和和性测定和蕾期授粉方法，掌握自交不亲和和性选择和淘汰的标准，掌握自交不亲和系选育和繁殖的技术，为选育自交不亲和系奠定基础二仪器和材料镊子，不同颜色的标签，防水羊皮纸袋，大头针或回形针，铅笔，纯合的小白菜种株，竹竿和绳子等三内容步骤（一）自交亲和性测定1 选株：在优良品种或优良组合中选择具有本品种特征特性，生长健壮，无病虫害的优良单株，每人选三棵2 选株：每株选健壮枝条四枝（尽可能选主枝和第一，二侧枝）3 整理枝条：枝条选好后，用镊子把本枝上已开过的花去掉。
每株上有两个枝条摘去顶心留花蕾20个用作自交不亲和指数；另两枝也摘顶心，最少留15个花蕾作蕾期授粉保存该株种子，然后将所选用枝条都套起袋子，挂好牌子，牌子上写明品种名称，花旗授粉（符号fg）还是蕾期授粉（bp），日期，姓名，牌子反面注明所授粉蕾数4 花期授粉：第二天开始袋内的花蕾陆续开花，每天或隔一天在作测亲和指数的枝条上用同枝或同株异枝袋内花粉进行花期授粉（注意同一袋内有几朵花蕾同时开放，不要将花摘下，用授粉匙蘸袋内的花粉来授粉即可，或在整理枝条时另留几枝，将已开的花除掉，袋内专供采粉用）。
待袋内所有花开完并作了人工授粉以后的一星期将袋去掉，检查自交结实情况计算亲和指数亲和指数=（结籽数/花期授粉花数）*100%5 蕾期授粉：选择开花前2~3天的花蕾，用左手稳住它，再用镊子轻轻拔花苞（注意不要伤柱头）并夹去花苞上部使柱头露出。
取同株袋内的干净花粉进行授粉后，套上袋子，在纸牌上注明授粉日期，每株最少作15个花蕾，一星期后去袋，种子成熟时采种，测定蕾期亲和指数，将花期亲和指数<=1的单株分株收种（二）自交不亲和系选育和繁殖花期亲和指数<=1,蕾期亲和指数>=3的单株分株收种，即为自交不亲和系种子。
下一代播种后混合采种，进行自交不亲和系的繁殖1 种株培育和管理：种株于冬前定植于大棚内，注意保温，控湿防病2 花期喷施盐水繁殖：上午9~10时喷0.2%~0.3%的食盐水，半小时到一小时后辅助授粉1次，第二天再授粉1次；隔48小时再处理1次，整个花期不低于10次。
人工合成的甘蓝型油菜自交亲和性分析
青海大黄油菜 Ｘ中迟芥 蓝组合选择 Ｆ １ ９～ ２和 Ｆ １ ９—８ 两个株 系， 这两个株系来源于 同一个 Ｓ 。 植株 。
１ ． ２ 方 法
。
甘蓝型油菜是异源 四倍体 ， 是 由白菜（ Ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ａ ｃ ａ ｍ ｐ ｅ ｓ ｔ ｒ ｉ ｓ ，
２ ｎ＝ ２ ０， Ａ Ａ） 或 白菜型油菜 （ 置 ｒ ａ ｐ ａ ， ２ ｎ＝ ２ ０， Ａ Ａ） 与甘蓝 （ Ｂ ． ｏ ｌ ｅ ｒ ａ ｃ ｅ ａ ， ２ ｎ＝１ ８ ， Ｃ Ｃ）自然 杂 交 再 加 倍 后 进 化 形 成 的 复 合
１ ． ２ ． １ 减数分裂观察
选 取花期植株幼嫩 的花药 ， 置入卡诺
固定液（ 乙醇 ： 冰醋酸 ＝３： １ ） 中固定（ ２ ４ ｈ以上 ） 待用 。将 固定好的花药放入 １ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ盐酸 中 ， 于６ ０℃水浴 ３～ ５ ｍ ｉ ｎ ，
种… 。白菜型油菜 和甘蓝 这两 个基本 种都 拥有 自交 不 亲和
酸６ ｍＬ ， 甘油 ５ ％） 固定 、 保存 。雌蕊用 ６ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ Ｎ ａ Ｏ Ｈ进行透 明处理 １ ２ ｈ ， 水洗后用含 ０ ．１ ４ ｍ ｏ Ｌ ／ Ｌ Ｋ Ｈ Ｐ Ｏ （ ｐ Ｈ值 ８ ． ２ ） 的 ０ ． １ ％水溶性脱色苯胺蓝溶液浸泡 ２ ４ ｈ ， 经压片荧 光显微镜 下（ ｕ激发 ） 观察 、 摄影 。
２ 结 果 与分 析 ２ ． １ 减数 分 裂
２ ０ １ ０年 ８月分别 以门源小 油菜 和青海 大 黄油 菜两 种不 同白菜型油菜 为母本 ， 以 中迟芥 蓝为父 本人工合 成甘蓝 型油 菜， 当年 １ １ 月将加倍 的 ｓ ０ 植株栽入温室 ， ２ ０ １ １年 ５月份将温 室收获的 自交种子播种 于试 验 田获 得 ｓ 群体 ， ２ ０ １ １年 ｌ １ 月 将Ｓ ，自交种子播种 于温室 ， 获得 ｓ 群体 。本研究 是 以人工 合成 甘蓝 型油菜 ｓ ： 植株为材料 ， 其 中门源小油菜 ×中迟芥蓝
高中生物高考 2021届小题必练14 生物的变异及育种 生物的进化 学生版
（新高考）小题必练14：生物的变异及育种生物的进化本专题是根据近三年（2018～2020）的高考真题情况，去组织和命制题目。
专题中有近三年的高考真题，根据真题加以模仿的题和百强名校对应考点的题。
该专题主要考查生物的变异及育种等。
重点考查生物变异的类型（基因突变、基因重组及染色体变异）、生物变异在育种中的应用及生物的进化等。
1．（2020年全国卷Ⅱ·4）关于高等植物细胞中染色体组的叙述，错误的是（）A．二倍体植物的配子只含有一个染色体组B．每个染色体组中的染色体均为非同源染色体C．每个染色体组中都含有常染色体和性染色体D．每个染色体组中各染色体DNA的碱基序列不同2．（2019江苏卷·4）下列关于生物变异与育种的叙述，正确的是（）A．基因重组只是基因间的重新组合，不会导致生物性状变异B．基因突变使DNA序列发生的变化，都能引起生物性状变异C．弱小且高度不育的单倍体植株，进行加倍处理后可用于育种D．多倍体植株染色体组数加倍，产生的配子数加倍，有利于育种3．（2018·全国卷Ⅰ，6）某大肠杆菌能在基本培养基上生长，其突变体M和N均不能在基本培养基上生长，但M可在添加了氨基酸甲的基本培养基上生长，N可在添加了氨基酸乙的基本培养基上生长，将M和N在同时添加氨基酸甲和乙的基本培养基中混合培养一段时间后，再将菌体接种在基本培养基平板上，发现长出了大肠杆菌（X）的菌落。
据此判断，下列说法不合理的是（）A．突变体M催化合成氨基酸甲所需酶的活性丧失B．突变体M和N都是由于基因发生突变而得来的C．突变体M的RNA与突变体N混合培养能得到XD．突变体M和N在混合培养期间发生了DNA转移1．下列关于生物的变异叙述正确的是（）A．某DNA分子中丢失1个基因，则该变异属于基因突变B．基因型为Aa的个体自交，因基因重组而导致子代性状分离，所以出现了aa的个体C．二倍体水稻花粉经离体培养，可得到单倍体水稻，其稻穗、米粒较小D．无籽西瓜及无子番茄的培育过程中都有生长素参与2．同一番茄地里有两株异常番茄，甲株所结果实均为果形异常，乙株只结了一个果形异常的果实，其余的正常。
实验五 油菜自交不亲和性鉴定
实验五油菜自交不亲和性鉴定一、目的了解植物自交不亲和性的表现特征，掌握植物自交不亲和性的鉴定方法。
二、内容说明植物的自交不亲和性是指能产生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌雄同体植物，在自花授粉或相同基因型异花授粉时不能完成受精的现象，是花粉与雌蕊相互作用的综合结果。
受单一位点或多位点的自交不亲和基因控制。
自交不亲和性广泛存在于十字花科、禾本科、豆科、茄科等许多植物中，十字花科中自交不亲和性尤为普遍。
自交不亲和株正开放花的柱头上，如果授于同株或同系统的花粉时，柱头就被激发产生胼胝质等物质，阻碍花粉发芽和花粉管发育，故不能正常受精结实，不结子或结少量种子；而授于别的品种或系统的花粉时，则柱头不会被激发产生这类物质，故能正常受精结实。
但在花蕾柱头上，即使授于同株或同系统的花粉也不会被激发这种反应，因此可通过蕾期人工控制自交获得自交不亲和系的种子。
可根据自交结实情况对自交不亲和性进行判断，以自交亲和指数来表示。
自交亲和指数＝自交结实种子总数／套袋自交总花蕾数；自交亲和指数＜1者为自交不亲和；自交亲和指数≥1者为自交亲和。
胼胝质是β－1、3葡聚糖，通常分布于高等植物的筛管、新形成的细胞壁、花粉粒以及花粉管中，将其用苯胺蓝染色后，在紫外光激发下，可发出黄至黄绿色的荧光。
把授粉后经用苯胺染色的子房放到荧光显微镜下观察，可看到花粉在柱头上萌发、花粉管发育的状态，以及胼胝质在柱头表面的沉积状况等，进行判断花粉与柱头是否亲和。
三、材料与用具1、实验材料：自交不亲和材料：白菜型油菜；自交亲和材料：甘蓝型油菜。
2、仪器用具：荧光显微镜、广口瓶（20～50ml）、载玻片、盖玻片、镊子、铅笔、纸牌、纸袋、甲醛、冰醋酸、无水乙醇、普通酒精、磷酸钾、苯胺蓝、氢氧化钠、甘油、蒸馏水等。
四、试验方法步骤（一）自交亲和指数测定法1、套袋自交：选3～5株已开花且发育健壮的植株，每株上选3～4个花序，摘除已经开放的花朵和角果，然后套上纸袋，并在相应的花序上挂牌标记。
PCR步行法克隆油菜自交不亲和基因
2004年12月December2004中国油料作物学报Chinese journal of oil crop sciences第26卷第4期Vol.26No.4 PCR步行法克隆油菜自交不亲和基因何余堂1,马朝芝2,马 勇1,孟良玉1,涂金星2,傅廷栋2(1.渤海大学生物与食品科学学院,辽宁省食品质量安全与功能食品重点实验室,辽宁锦州121000;2.华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,国家油菜改良中心武汉分中心,湖北武汉430070)摘要:同源序列法与PCR步行法相结合,在油菜中克隆自交不亲和基因SL G和eS R K(extra-cellular S R K)。
所克隆的SL G序列长为882bp,克隆的eS R K序列长度分别为1495bp(青海大黄)、1494bp(黄籽沙逊)、1727bp (关中油白菜);其G eneBank登陆号分别为A Y448025、A Y448026、A Y448027、A Y448028、A Y448029、A Y448030。
缺失突变可能是导致青海大黄和黄籽沙逊自交亲和的原因。
克隆的SL G基因与甘蓝和白菜型油菜的SL G基因有很高的同源性,而eS R K基因与甘蓝和白菜型油菜的S R K基因的同源性较高。
同源序列法与PCR walking法相结合,可以有效地克隆基因;但在克隆SL G基因的两翼序列时遇到了困难,说明PCR步行法仍有待改进。
关键词:基因克隆;自交不亲和性;SL G;eS R K中图分类号:S565.403.2 文献标识码:A 文章编号:1007—9084(2004)04—0001—05 同源序列法是通过比较不同物种目的基因的同源序列,根据保守区段设计特异性引物,进行PCR 扩增、克隆、测序的一种克隆目的基因的方法。
为获得基因组中目的片段的两侧序列,十多年来已经发展出多种方法[1],如Inverse PCR(IPCR)、Thermal Asymmetry Interlaced PCR(TA IL PCR)、Capture PCR(CPCR)、Panhandle PCR、Vectorette-PCR、Targeted gene-walking PCR等,这些方法各有优缺点。
一种繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系的方法[发明专利]
![一种繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/243b6962f11dc281e53a580216fc700aba685244.png)
[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101422115A [43]公开日2009年5月6日[21]申请号200810236719.X [22]申请日2008.12.09[21]申请号200810236719.X[71]申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号[72]发明人马朝芝 高长斌 傅廷栋 涂金星 沈金雄[74]专利代理机构武汉宇晨专利事务所代理人王敏锋[51]Int.CI.A01G 1/00 (2006.01)A01H 1/04 (2006.01)A01H 1/02 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 4 页[54]发明名称一种繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系的方法[57]摘要本发明属于油菜育种领域，具体涉及一种繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系的方法。
本发明针对甘蓝型油菜自交不亲和系因大量繁殖困难而限制自交不亲和杂种大面积推广的问题，利用NaCl溶液+蜜蜂辅助授粉和系统选择方法克服甘蓝型油菜自交不亲和系的繁殖障碍，采用早播、稀植、高肥等措施培育多分枝的大株型甘蓝型油菜自交不亲和系，采用品质分析和亲和性鉴定等选择方法得到甘蓝型油菜自交不亲和系原原种，进一步得到甘蓝型油菜自交不亲和系原种。
本发明为甘蓝型油菜自交不亲和系的大量繁殖提出了一种简单，有效的方法，促进了甘蓝型油菜自交不亲和性杂种优势的利用。
200810236719.X权 利 要 求 书第1/1页 1、一种甘蓝型油菜自交不亲和系的快速繁殖方法，其步骤如下： (1)在中国长江中下游的冬油菜地区于每年的8月下旬至9月上旬隔离条件下播种甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300，设株、行距分别为2米和1米，培育尽可能多分枝的大株型甘蓝型油菜自交不亲和系，于该自交不亲和系的蕾薹期用60目的尼龙纱帐套住每一个甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300单株，在尼龙纱帐内配置蜜蜂辅助授粉；对该自交不亲和系的主花序套袋，使其自交，鉴定该自交不亲和系植株的亲和性；(2)在甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的开花期，对隔离条件下的甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300植株每天上午喷施3％NaCl溶液1次，累计喷20-30次；(3)在甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的成熟期分单株收获所述自交不亲和系的种子，按亲和指数＝籽粒数/花朵数的公式计算亲和指数，淘汰亲和指数大于2的植株，分析每一单株种子的芥酸和硫苷含量，选芥酸含量小于1％、硫苷含量小于30umol/g植株的种子作为原原种，保存在-20℃冰箱中备用，得到甘蓝型油菜自交不亲和系原原种；(4)在下一个繁殖季节继续在隔离条件下播种步骤(3)的原原种，并在所述的自交不亲和系的开花期每天上午喷施3％的NaCl溶液1次，共喷20-30次，配置蜜蜂辅助授粉，收获得到作为生产上应用的甘蓝型油菜自交不亲和系原种。
油菜杂交
四川农业大学实验（习）报告班级：姓名：日期：实验二油菜杂交和自交技术一、实验目的了解油菜的花器构造和开花习性，练习和掌握油菜的有性杂交和自交技术。
二、实验内容1. 自交先观察并识别油菜的花器构造，然后以套袋自交方式依次进行选择花序、套袋隔离、去掉纸袋步骤，最后收获自交种子，并计算自交结实率。
2. 杂交先观察并识别油菜的花器构造，然后依次进行父本套袋隔离、母本选株整序、去雄、授粉步骤，最后收获并贮藏杂交种子，并计算杂交结实率。
三、材料与工具1. 材料：不同品种油菜开花期植株，由四川农业大学青浦园试验地提供；2. 工具：小剪刀、小镊子、培养皿、羊皮纸袋（10 cm×6 cm）、回形针、铅笔、纸牌（宽3 ~ 4 cm）、70 %酒精等。
四、方法步骤1. 自交本实验所选择的自交方式为套袋自交。
甘蓝型和芥菜型油菜品种一般自交亲和性强，套袋自交容易得到自交种子。
其步骤如下：（1）选择花序选择健壮、无病虫害的典型植株上的主花序，以及靠近它的1 ~ 3枝。
小心摘去本花序上已经开放的花朵和花序顶端的较小花蕾。
（2）套袋隔离将所选的花序一并套入羊皮纸袋内，纸袋下部经对折后用回形针封口，然后在被套花枝的基部挂上纸牌，纸牌上应注明品种名称、自交符号、日期。
注意纸袋上部应留有一定的空隙，以便花序能正常生长。
（3）去掉纸袋待顶端花蕾均已经开放，且花瓣大部分已经脱落时，可将纸袋取下，以利于角果和种子发育。
（4）收获待角果成熟后，摘下整个花序连同塑料牌一起放入尼龙丝网袋中，晒干脱粒后，将种子放入透明塑料袋中保存，并写明品种代号或名称。
2. 杂交（1）父本套袋隔离在杂交前1天，选取具有父本典型性状、健壮无病虫害的植株，用剪刀剪去花序上已开花和结果的花器，然后套袋隔离、挂牌，以供采粉用。
（2）母本选株整序在父本套袋隔离的同时，选取具有母本品种典型性状、健壮无病虫害的植株，用剪刀剪去已经开花和角果，并用镊子摘去花序上已开放的花朵和花序顶端的幼小花蕾，剩下次日即将开放(花萼已裂开、微露黄色)的10-15个花蕾供去雄。
油菜杂交种种子生产技术—自交不亲和亲本选育途径
凡亲和指数符合要求的植株，下年用剥蕾自交 种子种植1～2行，再从中选株，并按上述方法分别 进行人工授粉自交，及剥蕾授粉自交，直至不亲和 性稳定为止。
在自交分离三代以后，除上述两种套袋外，还要套袋测定 姊妹交的结实情况。其方法是见袋内花朵开放10～20朵以后， 用同系内异株花粉给予人工授粉(父本花也要套袋防止混有其它 花粉)，挂上纸袋，记明授粉花朵，计算不亲和指数，凡姊妹交 亲和指数在“1”以下者就可以当选。用上述选育程序一般经过 3—5代的自交分离以后，就可育成自开花当天起到开花后1—6 天内自交或姊妹交部不亲和而剥蕾自交能正常结实的不亲和 系。
1、测定亲和指数
• 袋中有10～20朵花开放时，摘取刚开放的1～2朵 花，进行人工授粉自交，授粉后仍套袋，挂上纸 牌，记明授粉花数，成熟时计算亲和指数，在早 期世代，凡亲和指数 “1”以下即可当选。
2、计数及统计
• 在另一袋中，见有少数花开放时，对未开花蕾用镊子 剥蕾(不去雄)，每个花序剥20个左右，用袋中已开花 朵给剥蕾花授粉，其目的是保存繁殖本株上不亲和系 种子。亲和指数在10以上可作为结实正常。一株剥蕾 完毕，所用镊子用酒精消毒，再在第二株上剥蕾授粉。
二、选配杂交组合
• 任何一种利用杂种优势的方法都必须具备两个条件，
即亲本本身高产稳产和配制出杂种优势强的组合。所以 选育出了优良不亲和系，还要有一个性状优良、能恢复 自交不亲和性、杂交优势强的父本亲本(等于恢复系)， 杂种一代自交、交不亲和制杂交种
亲本选育方法
选育自交不亲和系的材料来源很多，可在现有品种中 筛选。但根据现有经验，在甘蓝型油菜(2n=38)和白菜 型油菜(2n=20)的种间杂种(亲和性较强)后代中进行套 袋自交分离和定向选择，效果较好。
预测亲和性选择优良植株，在开花时进行套袋自交分离每株上套两 种不同的袋子，各套一个分枝花序(或主轴)，套袋时摘去已开的花朵， 套袋的目的有两个：
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实验五油菜自交不亲和性鉴定
一、目的
了解植物自交不亲和性的表现特征，掌握植物自交不亲和性的鉴定方法。
二、内容说明
植物的自交不亲和性是指能产生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌雄同体植物，在自花授粉或相同基因型异花授粉时不能完成受精的现象，是花粉与雌蕊相互作用的综合结果。
受单一位点或多位点的自交不亲和基因控制。
自交不亲和性广泛存在于十字花科、禾本科、豆科、茄科等许多植物中，十字花科中自交不亲和性尤为普遍。
自交不亲和株正开放花的柱头上，如果授于同株或同系统的花粉时，柱头就被激发产生胼胝质等物质，阻碍花粉发芽和花粉管发育，故不能正常受精结实，不结子或结少量种子；而授于别的品种或系统的花粉时，则柱头不会被激发产生这类物质，故能正常受精结实。
但在花蕾柱头上，即使授于同株或同系统的花粉也不会被激发这种反应，因此可通过蕾期人工控制自交获得自交不亲和系的种子。
可根据自交结实情况对自交不亲和性进行判断，以自交亲和指数来表示。
自交亲和指数＝自交结实种子总数／套袋自交总花蕾数；
自交亲和指数＜1者为自交不亲和；
自交亲和指数≥1者为自交亲和。
胼胝质是β－1、3葡聚糖，通常分布于高等植物的筛管、新形成的细胞壁、花粉粒以及花粉管中，将其用苯胺蓝染色后，在紫外光激发下，可发出黄至黄绿色的荧光。
把授粉后经用苯胺染色的子房放到荧光显微镜下观察，可看到花粉在柱头上萌发、花粉管发育的状态，以及胼胝质在柱头表面的沉积状况等，进行判断花粉与柱头是否亲和。
三、材料与用具
1、实验材料：
自交不亲和材料：白菜型油菜；
自交亲和材料：甘蓝型油菜。
2、仪器用具：荧光显微镜、广口瓶（20～50ml）、载玻片、盖玻片、镊子、铅笔、纸牌、纸袋、甲醛、冰醋酸、无水乙醇、普通酒精、磷酸钾、苯胺蓝、氢氧化钠、甘油、蒸馏水等。
四、试验方法步骤
（一）自交亲和指数测定法1、套袋自交：选3～5株已开花且发育健壮的植株，每株上选3～4个花序，摘除已经开放的花朵和角果，然后套上纸袋，并在相应的花序上挂牌标记。
2、蕾期人工强制自交：在每个花序上选择10～15个较大的花蕾，用镊子轻轻摘除幼小的花蕾。
开花后未散粉前，用镊子小心摘取本株上隔离袋内新鲜花朵的花药（粉），授到开放花朵的柱头上，即进行花期人工强制自交。
（二）荧光显微法
Martin(1959)发现水溶性苯胺蓝能显示花柱中花粉管的伸长情况：在荧光显微镜下，对于大部分附着于柱头上的SSI花粉，看不见它们的花粉管穿过乳突细胞，一经穿过乳突细胞的少数SSI花粉管,会长驱直入，到达子房，完成授精。
因此，可根据穿越花柱的花粉管数量来测定自交不亲和性。
1.试剂配置
（1）FAA固定液：将40%甲醛、80％乙醇和冰醋酸，按1:8:1的比例配制而成。
（2）卡诺固定液：用3份无水乙醇和1份冰醋酸配制而成。
（3）0.1N磷酸钾水溶液：称取71g磷酸钾，用蒸馏水定容至1000ml。
（4）0.1%苯胺蓝溶液：称取0.1g水溶性苯胺蓝，用0.1N磷酸钾水溶液定容至100ml。
（5）8N氢氧化钠溶液：称取32g氢氧化钠，用蒸馏水定容至100ml。
2.取样、固定和保存
解开自交授粉6～12h的花枝上的纸袋，摘取子房，于花柱基部切下花柱，将花期授粉
和蕾期授粉的花柱分别固定于FAA固定液或卡诺固定液中，
24h后，转移到70%乙醇溶液中保存。
在瓶上注明株号、花期授粉还是蕾期授粉处理以及试验者姓名。
3.透明和软化
将上述固定材料用水冲洗后，转移到指形管中，用8N氢氧化钠溶液浸泡8～24h。
4.染色
把软化后的试材用自来水多次换水浸泡1h以上，除去大部分氢氧化钠溶液之后，转移到0.1%苯胺蓝染液中染色4h左右。
5.观察
用镊子挑取一枚染色后的花柱，放在载玻片上，用滤纸吸出染液，滴上一滴甘油，盖上盖玻片，轻轻敲压盖玻片，使花柱展开。
然后把载玻片放到荧光显微镜下，观察记载每株柱头胼胝质沉积状况，花粉萌发及花粉管生长状态。
6.统计花粉管数量和伸长状况，判断自交不亲和情况
依据 Georgia (1982)提出的判断甘蓝自交不亲和性的标准；在花柱中能观测到0～10条花粉管的定为不亲和，10～25条为部分亲和，25条以上者为亲和。
复习思考题、作业题：
1.学生课前预习，并写出详细的预习报告；
2.课前查阅文献资料，了解自交不亲和性的不同测定方法；
3.完成表格作业并分析实验中存在的问题并通过思考或相互讨论找出相应的解决办法。