实验8_植物基因组DNA的提取20101104
基因组dna提取实验报告
基因组dna提取实验报告基因组 DNA 提取实验报告一、实验目的本次实验的主要目的是从不同的生物样本中提取高质量的基因组DNA，以便进行后续的分子生物学实验，如 PCR 扩增、基因测序等。
通过本次实验，掌握基因组 DNA 提取的基本原理和操作方法，了解影响 DNA 提取质量的因素，并对提取的 DNA 进行质量检测和分析。
二、实验原理基因组DNA 提取的基本原理是利用细胞裂解液破坏细胞膜和核膜，使细胞内的物质释放出来，然后通过蛋白酶 K 消化蛋白质，去除 RNA 等杂质，再利用酚/氯仿等有机溶剂抽提，将蛋白质、多糖等杂质去除，最后通过乙醇沉淀或异丙醇沉淀得到纯净的基因组 DNA。
三、实验材料与试剂（一）实验材料1、新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉等）2、植物叶片3、细菌培养物（二）实验试剂1、细胞裂解液（含 TrisHCl、EDTA、NaCl、SDS 等）2、蛋白酶 K3、酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）4、无水乙醇5、 70%乙醇6、 RNA 酶 A7、 3M 醋酸钠（pH 52）8、 TE 缓冲液（10 mM TrisHCl，1 mM EDTA，pH 80）（三）实验仪器1、离心机2、移液器3、恒温水浴锅4、紫外分光光度计5、电泳仪及电泳槽四、实验步骤（一）动物组织基因组 DNA 提取1、取约 01g 新鲜的动物组织，放入 15ml 离心管中，加入 1ml 细胞裂解液，用剪刀将组织剪碎，然后在冰上放置 10min。
2、向离心管中加入20μl 蛋白酶 K（20mg/ml），充分混匀，在 55℃水浴锅中孵育过夜，直至组织完全消化。
3、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），轻轻颠倒离心管10min，使溶液充分混匀。
4、 12000rpm 离心 10min，将上清液转移到新的离心管中。
5、重复步骤 3 和 4 一次。
6、向上清液中加入 1/10 体积的 3M 醋酸钠（pH 52）和 2 倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒离心管，可见白色的 DNA 沉淀出现。
实验报告-植物基因组的提取和检测
题目：植物基因组DNA的提取与检测一、实验目的1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理；2.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。
二、实验原理1.在液氮中对植物组织进行研磨，破碎细胞；2.SDS等离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来；3.苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质；4.上清液中加入异丙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE缓冲液中，即得植物基因组DNA 溶；5.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。
DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。
DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。
因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
三、实验材料1.设备移液器，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心管2.材料植物幼嫩叶片3.试剂（1）细胞提取液：100mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 5mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.25% SDS，1%β-巯基乙醇（去除酚类）（2）氯仿:异戊醇（24:1）（3）其它试剂：液氮、无水乙醇、 TE缓冲液、异丙醇、洗涤缓冲液四、方法和步骤1、取500μL细胞提取液于650C水浴（金属浴）中加热备用；2、研钵用液氮预冷，新鲜植物叶片（自来水清洗，蒸馏水冲洗干），去除叶脉，剪成细条状，置于研钵中研磨成粉末状（越细越好）；3、取0.1g粉末（大约两勺半）转移至500μL预热的细胞提取液中，迅速摇匀，650C 水浴（金属浴）中保温30min，10min左右温和颠倒混匀一次；第 1 页题目：植物基因组DNA的提取与检测4、从水浴（金属浴）中取出离心管，加等体积(约500μL)氯仿/异戊醇（24:1），室温下10000rpm×10min；5.将上清液转移到另一1.5mL离心管中（使用的枪头用剪刀剪成大口），加等2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，静置1min,使核酸沉淀下来，12000r/min× 5min，倒掉上清液；6、加入1ml洗涤缓冲液，轻轻转动离心管使核酸沉淀悬浮起来，静置5min,12000r/min × 2min,去除上清液，再加入1ml洗涤缓冲液，轻轻转动离心管使核酸沉淀悬浮起来，放置5min;7、12000r/min× 10min后，倒去上清液，用小滤纸条将管壁上多余的水分吸掉，室温静置干燥；8、干燥后，加入20μLTE缓冲液，溶解DNA，做好标记；9、取5μL溶液，0.7%琼脂糖凝胶电泳检测DNA大小和质量。
植物基因组DNA提取技术
EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变
使酚容易去除。
CTAB提取缓冲液的改进配方
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与
问题解析
DNA提取常见问题
问题三：DNA提取量少。 原 因
1.
实验材料不佳或量少
1.
ห้องสมุดไป่ตู้
尽量选用新鲜（幼嫩） 的材料
2.
3. 4.
破壁或裂解不充分
吸附或沉淀不完全 洗涤时DNA丢失
对 策
2.
3.
植物要匀浆研磨充分
增加吸附的时间，或低 温沉淀
4.
小心操作
琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
作业
紫外仪上观察电泳带及其位置。 绘制核酸电泳示意图。
思考
1. 结合原理 ，简述 CTAB 法分离 提取植物总DNA的基本过程。 2. 为了获得高质量的植物总 DNA ， 在分离提取过程中应注意那 些问题？
实验一 植物基因组DNA的提取
DNA extraction
农业生物学实验教学中心
DNA是遗传信息的载体，是最重
要的生物信息分子，是分子生物学
研究的主要对象。为了进行测序、
杂交和基因的表达，获得高分子量
和高纯度的DNA是非常重要的前提。
背景知识
DNA的存在形式
与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。 在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋 白释放出来。 植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存 在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性 复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和 叶绿体DNA(ctDNA)。
植物基因组dna的提取实验报告
植物基因组dna的提取实验报告植物基因组DNA的提取实验报告引言：DNA提取是生物学研究中的基础实验之一，它可以帮助我们了解植物的遗传信息和基因组结构。
本实验旨在通过提取植物基因组DNA，探索DNA的提取方法以及其在植物基因研究中的应用。
材料与方法：1. 实验材料：新鲜植物叶片、细碎器、提取液（含有细胞裂解酶、蛋白酶K和盐酸）、离心管、离心机、冰浴装置、乙醇、磷酸盐缓冲液等。
2. 实验步骤：- 步骤一：取一片新鲜植物叶片，用细碎器将其细碎成细小颗粒。
- 步骤二：将细碎的植物组织转移到离心管中，并加入适量的提取液。
- 步骤三：将离心管放入冰浴装置中，在4℃下反应30分钟。
- 步骤四：离心管中的混合液离心10分钟，将上清液转移到新的离心管中。
- 步骤五：加入等体积的冷乙醇，轻轻摇晃离心管，使DNA沉淀。
- 步骤六：用微量移液器将DNA沉淀转移到新的离心管中。
- 步骤七：加入适量的磷酸盐缓冲液溶解DNA。
结果与讨论：通过上述实验步骤，我们成功地从新鲜植物叶片中提取到了DNA。
下面将对实验结果进行讨论。
首先，实验中使用的提取液含有细胞裂解酶和蛋白酶K。
细胞裂解酶可以破坏细胞膜，使细胞内容物释放出来，而蛋白酶K则能降解蛋白质，避免其对DNA的影响。
这两种酶的作用协同进行，为DNA的提取提供了基础。
其次，实验中的冰浴装置和离心机的使用是为了维持低温和分离混合液中的固体和液体。
低温可以减缓酶的活性，防止DNA的降解。
离心则可以将细胞碎片和其他杂质沉淀下来，使上清液中富含DNA。
最后，实验中的乙醇是用来沉淀DNA的。
加入乙醇后，DNA会与乙醇结合形成白色沉淀物。
通过轻轻摇晃离心管，可以帮助DNA更好地沉淀。
而且，乙醇的加入还能帮助去除杂质，使得提取到的DNA更纯净。
DNA的提取是植物基因研究的重要步骤之一。
通过提取到的DNA，我们可以进行一系列的遗传学研究，如PCR扩增、DNA测序等。
此外，DNA的提取还可以用于植物种质资源的鉴定和保护，以及基因工程的应用等领域。
实验2、植物基因组DNA的提取
实验二、植物基因组DNA的小量提取【实验目的】掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。
学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
【实验原理】通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因DNA水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA 溶液。
【实验材料】拟南芥叶片【试剂和器材】DNA提取液（1L）：称取24.228 g Tris-HCl（0.2 M, pH=9.0），LiCl 16.956 g（0.4 M），EDTA 9.306 g（2.5 mmol/L），全部溶解完全后加入10 g SDS先加入少量双蒸水搅拌至透明定容。
器材：研钵，恒温水浴，离心机，离心管等。
【实验步骤】1、剪取新鲜幼嫩的植物叶片1~2片于1.5 mL离心管中.2、先加入少量的DNA提取液100 μL，用研磨棒充分研磨尽量避免提取液溅出。
3、再加入600 μL的DNA提取液，使DNA提取液的总体积为700 μL，上下颠倒混合均匀。
4、放入高速离心机4 ℃条件下12 000 rpm离心15 min。
5、取上层水相，移入标有相应序号的新的离心管中，加入600 μL的异丙醇（与加入DNA提取液的总体积相同），上下颠倒混匀。
植物基因组 DNA 提取
植物基因组D NA 提取2ml 离心管提取取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下：1. 2.0 ml 离心管加入离心管盖大小新鲜叶片2片；2. 液氮充分研磨成粉末，加入900 µL CTAB 缓冲液；3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次；4. 置于4℃冰箱冷却至15 ℃以下；5. 加入900 µL25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5 分钟，保证样品与氯仿充分混合；6. 12,000 rpm 离心20-30 分钟；7. 取上清液约800 µL，加入预先加好的700 µL 异丙醇的1.5 ml 离心管中，轻轻上下颠倒混匀；8. -20℃冰箱静止30 分钟以上；9. 12,000 rpm 离心15-20 分钟，弃上清夜；10. 75%酒精洗涤沉淀，弃上清液，12,000 rpm 离心15-20 分钟；11. 风干D NA，让酒精挥发干净（4 小时以上或过夜）；12. 加入100 µL 的纯水（含终浓度为1%RNase）溶解D NA；13. 放入37 ℃环境中，约60 分钟消化R NA；14. 取2 µL DNA 进行检测。
50ml 离心管提取取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下：1. 取新鲜叶片在研钵用液氮研磨成粉末；2. 向50ml 离心管里加入叶片粉末，至刚好覆盖住管圆底部，加入20mlCTAB 缓冲液充分混匀；3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次；4. 取出，冷却至15 ℃以下；5. 加入20ml 的25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5min，保证样品与氯仿充分混合；6. 4500rpm 离心40 分钟；（如不需要抽提第2次，可直接到9步骤）7. 小心吸取上清液至新的50ml 离心管中，加入20ml 的氯仿溶液，混匀2-5min左右8. 4500rpm 离心40 分钟；9. 取上清液于50ml 离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，此时会看到絮状沉淀；10. -20℃冰箱静止30min 以上；11. 4500rpm 离心40min，弃上清夜；12. 加入5ml 的75%酒精洗涤沉淀，4500 rpm 离心30min，弃上清液；13. 风干D NA，让酒精挥发干净（4 小时以上或过夜）；14. 加入约300 µL 的纯水（含终浓度为1%RNase）溶解D NA；15. 放入37 ℃环境中，约60min 消化R NA；16. 取2 µL DNA 进行检测。
植物基因组DNA提取
实验一植物基因组DNA提取一、目的与原理DNA是绝大多数生物(除少数RNA病毒外)储存、传递信息的生物大分子。
为了进行DNA 分子的体外重组，必须提取具有天然结构并具有一定长度的DNA大分子。
提取分离DNA大分子，有酚法，氯仿一异丙醇法、酶法、SDS法、CTAB法等方法。
主要操作都是围绕如何尽可能除尽结合蛋白质和多糖等杂质，本实验的目的是介绍CTAB法。
CTAB 法提取基因组DNA 原理：CTAB 是一种非离子去污剂。
CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（＞0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1－0.5 mM NaCl）下CTAB－核酸复合物就因浓度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经离心弃上清后，CTAB－核酸复合物再用75％酒精浸泡可洗脱掉CTAB。
二、实验材料、仪器和试剂(一) 实验材料：新鲜的植物叶片（水稻叶子），适量液氮(二) 试剂：(1)EDTA溶液(0.5M、pH=8.0、500 mL)(2)Tris·HCl溶液(1.0 M、pH=8.0、500 mL)(3)2％CTAB抽提液(pH=8.0、500 mL)①称取CTAB粉末10.000 g，NaCl粉末40.908 g，PVP 405.000 g；②0.5M EDTA溶液20 mL；1.0M Tris·Cl溶液50 mL；③定溶至500 mL，121℃高压灭菌后，常温放置，待用。
(4)1×TE缓冲液(pH=8.0、200 mL)(5)RNase(10 mg/mL)1.5 mL离心管(121℃高压灭菌)，加入0.015 g RNase，15μL 1M Tris·Cl溶0.001305 gNaCl(几小粒)，无菌ddH2O(重蒸水)定容至1.5 mL，100℃煮15min；低温放置，待用。
(RNaseA，Sigma，M=487.5)。
（三）仪器通风橱、天平、离心机、摇床、微量移液器、水浴锅、研钵三、植物组DNA提取步骤1.准备工作。
实验8植物组织总DNA的提取
10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； 60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中； 放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解； 10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；
实验十一 植物组织总DNA的提取
实验目的 掌握用CTAB法提取植物总DNA的方法和基本原理。 学习利用紫外分光光度法测定DNA溶液的浓度。
二、实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB, SDS等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
保温1h,期间不停的摇均
吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀,10000rpm,10min
取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀, 10000rpm,10min
取上清液，加入的异丙醇（预冷），后4 ℃ /-20 ℃保温沉淀
10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干
10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）； 加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解； 置于-20℃保存、备用。
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10、紫外检测仪。
五、实验操作方法和步骤 （一） 植物基因组DNA的提取
称取植物幼嫩叶子0.5g 65℃水浴保温1hr， 其间经常轻柔摇动 离心5,000g×5min 臵于预热到65℃的研体中， 加少许石英砂；加入预热到 65℃的核酸提取缓冲液3ml 迅速研成匀浆 转移到7ml带盖离心管中
⑴ DNA纯度：OD260/OD280≈1.8，表示为纯的DNA；
OD260/OD280 ＞1.9，表示有RNA污染； OD260/OD280 ＜1.6，表示有蛋白质、酚等污染。
⑵ RNA纯度：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0，表示为纯的RNA；
OD260/OD280 ＜1.7时，表示有蛋白质或酚污染； OD260/OD280 ＞2.0时，表示可能有异硫氰酸残存。 ⑶ OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子 如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量； 同时也会影响酶切和PCR的效果。
加入等体积的平衡酚，轻柔颠倒混匀，室静臵10min 加入1/2体积的平衡酚与1/2 体积的氯仿，轻柔颠倒混匀， 室温放臵15min 加入等体积的氯仿，颠 倒混匀，室温放臵5min
4℃离心12,000g×10min
4℃离心（12,000g，5min）
4℃离心（12,000g，10min）
吸取上清转移到一新7ml 离心管中，记录体积*④
当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的 准确测定。由于 DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸 收峰，盐和小分子则集中在230nm处。所以，一般情况下同时检测同一样品的 OD260、OD280和OD230，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。 2、核酸样品纯度判断的一般标准：
三、实验材料与试剂
1、实验材料 植物基因组DNA样品
2、实验试剂
⑴ ddH2O； ⑵ TE缓冲液（pH 8.0）。 四、实验器材与仪器 1、离心机、离心管（5ml）及离心管架； 2、微量移液器10ul、200ul、1000ul及枪头； 3、紫外分光光度计； 4、石英比色皿（0.5cm光径）或1cm光径的微量石英比色皿（50ul、100ul）。
实验八
植物基因组DNA的提取 及纯度与含量的测定
20101104
第一部分 植物基因组DNA的提取
一、实验目的和要求
1、学习并掌握植物基因组DNA的提取原理和方法；
2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测基因组DNA结果的初步分析。
二、实验基本原理 植物基因组DNA的提取一般经过破碎细胞壁、裂解细胞膜、除去多糖和酚 等次生物质、变性蛋白质、沉淀核酸、去除RNA和浓缩DNA等几个步骤。 传统提取方法主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB)法、十二烷基 硫酸钠 (SDS)法。其基本原理是：十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等 离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得 以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分 相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和 大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，加 入RNA酶去除核酸中的RNA,即得植物基因组 DNA溶液。 由于植物中的次生代谢产物——多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的 污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及 DNA聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。传统的CTAB-DNA提取法步骤多，较 烦琐，DNA产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的 效率。SDS法操作简单，温和,也可提取到较高分子量DNA，但所得产物含糖类 杂质较多,这将直接影响DNA的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆 含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液 中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
加入3ml氯仿-异戊醇-乙醇溶液
轻柔颠倒混匀后， 室温静臵分层5m 记录体积，弃沉淀，*①
加入等体积异丙醇试剂， 混和后静臵20min沉淀DNA
4℃离心5,000g×3 min收集絮状沉淀
加入3mlTE，65℃水浴中助溶15min，使之完全溶解 转移上清于新7ml离心管中，记录体积*② 吸取上清转移到一新7ml离心管中， 记录体积*③
（14） DNA分子量Markers： 125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp.
四、实验器材与仪器
1、研体 2、离心机、离心管（7ml）及离心管架； 3、微量移液器10ul、1000ul及枪头； 4、恒温水浴箱65 ℃ 5、制冰机； 6、冰箱；
7、恒温水浴箱 37℃；
三、实验材料与试剂 1、实验材料：植物幼嫩叶子 2、实验试剂 （1）基因组DNA提取缓冲液 （2）氯仿:异戊醇:乙醇抽提液 （3）TE缓冲液 （4）平衡酚： （5）RNA酶A （6）酚/氯仿 （7）氯仿/异戊醇 （8）异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。 （9） 3mol/L NaAc （10） 5×TBE缓冲液 （11） 6×电泳上样缓冲液 （12） 1.0%琼脂糖凝胶 （13） EB
加入5μl RNase（5μg/μl）， 37℃ 保温10min
加入1/10体积3mol/L NaAC和 2×体积–20℃预冷的无水乙 醇–20℃放臵20min
4℃离心（5,000g，3min）收集沉淀*⑥
4℃保存备用
*⑤
用70%乙醇洗涤沉淀，倾倒掉乙醇溶 液，干燥，让酒精完全挥发
用1mlTE溶解沉淀，即为植物基因组DNA溶液*⑦ 说明：如果蛋白质和RNA未去除干净，重复酚，酚/氯仿， 氯仿抽提步骤，继续用RNase处理，乙醇沉淀和洗涤， 重溶于TE中，直至基因组DNA纯度和质量符合要求。
影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有： ⑴ DNA分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分 子量越大，迁移率越小。 ⑵ DNA构型的影响：超螺旋DNA＞线状DNA＞开环DNA ⑶ 胶浓度的影响： 浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度 为1％～2％； ⑷ 电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分 离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm） （电场强度） 。而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0V/cm电泳过夜。进行 高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。 ⑸ EB的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增 加。 ⑹ 电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们 各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。 TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用 TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护 DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。 ⑺ 碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大
本实验采用十二烷基硫酸钠 (SDS)法提取植物基因组DNA，基因组DNA提
取后，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA分子量大小、纯度；用紫外吸收
法测定基因组DNA纯度与含量。
DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定:
DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电 点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分 子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速 度不同。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后， 在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位臵。
① 凝胶电泳检测基因组DNA（分子量大小、纯度） ② 紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量
*植物基因组DNA的提取操作过程现象
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*植物基因组DNA的提取操作过程现象
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（二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 1、制胶（1％琼脂糖凝胶） 在胶模上架好梳子。称取01g琼脂糖，臵于250ml锥形瓶中，加100ml 0.5×TBE电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至50～60℃后， 加入EB，使其终浓度为0.5mg/L，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固 后，放入电泳槽中，倒入适量0.5×TBE（刚好淹过胶面），拔去梳子备用。 （注：EB为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作） 2、加样 取5ul纯化的DNA原溶液样品，与1ul 6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移 液枪小心加入样品槽中（注：勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡）。若DNA含 量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完 一个样品要换枪头以防互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将 样品槽底部凝胶刺穿。 3、电泳 加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100V，恒压电泳。 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需30～60min）。 4、观察和拍照 取出胶块臵于紫外灯下观察，DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光 带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。（注：紫外光对眼睛有害，观察时戴 上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察）。
第二部分 基因组DNA纯度与含量的测定
一、实验目的和要求
1、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法； 2、学习并掌握紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量的方法。
二、实验基本原理 核酸——DNA和RNA所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具 有紫外吸收的性质，它们在260nm处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长 进行核酸含量的测定。 波长为260nm时，DNA或RNA的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们 的不同构型而有差异。 对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02。 当OD260＝1时，双链DNA含量约为50μg / ml 单链DNA含量约为37μg / ml RNA含量约为40μg / ml 寡核苷酸含量约为30μg / ml（由于底物不同有差异） 1、核酸样品DNA、RNA含量的测定： 如用1cm光径石英比色皿，用 H2O稀释DNA或RNA样品n倍并以H2O为空白对 照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前DNA的含量： DNA（μg/μl）=50×OD260读数× DNA样品稀释倍数/1000 RNA（μg/μl）=40×OD260读数× RNA样品稀释倍数/1000 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量， 可使用溴化乙锭法或其他方法进行估算。