RTPCR
标准终点RTPCR
标准终点RTPCR实时荧光定量PCR（real-time PCR）是一种高灵敏度、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、遗传疾病诊断等领域。
在实时荧光定量PCR技术中，终点PCR是一种常用的PCR方法，它可以通过检测PCR反应终点的荧光信号来定量目标DNA或RNA的含量。
本文将介绍标准终点RTPCR的原理、方法和应用。
1. 原理。
标准终点RTPCR是一种半定量PCR技术，其原理是利用DNA或RNA模板，在PCR反应体系中进行多轮扩增，通过检测PCR反应终点的荧光信号来定量目标DNA或RNA的含量。
在PCR反应中，每一轮循环都会产生指数级增加的DNA或RNA产物，同时伴随着荧光信号的累积。
当PCR反应达到饱和时，荧光信号会呈指数级增加，最终趋于平稳。
通过检测PCR反应终点的荧光信号强度，可以确定起始模板的含量，从而实现对目标DNA或RNA的定量分析。
2. 方法。
标准终点RTPCR的方法包括PCR反应体系的准备、PCR程序的设置、荧光信号的检测和数据分析等步骤。
首先，需要准备PCR反应体系，包括模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶等。
然后，设置PCR程序，包括预变性、PCR扩增和荧光信号采集等步骤。
在PCR扩增过程中，荧光信号会随着PCR产物的累积而增加，直至达到饱和。
最后，通过荧光检测仪器采集PCR反应终点的荧光信号，并进行数据分析，得出目标DNA或RNA的定量结果。
3. 应用。
标准终点RTPCR技术在科学研究和临床诊断中具有广泛的应用价值。
在基因表达分析中，可以利用标准终点RTPCR技术对特定基因的表达水平进行定量分析，从而揭示基因调控网络和信号转导通路。
在病原微生物检测中，可以利用标准终点RTPCR技术对病原微生物的核酸进行定量检测，实现对病原微生物的快速、准确的诊断。
在遗传疾病诊断中，可以利用标准终点RTPCR技术对患者的遗传物质进行定量分析，为临床诊断和治疗提供依据。
rtpcr原理
rtpcr原理RT-PCR原理。
RT-PCR全称为逆转录聚合酶链式反应，是一种用于检测RNA的技术。
它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以将RNA转录成cDNA，然后进行扩增和检测。
这种技术在分子生物学和医学诊断中得到了广泛的应用，尤其在病毒检测和基因表达分析方面有着重要的作用。
RT-PCR的原理主要分为三个步骤，逆转录、PCR扩增和检测。
首先是逆转录，即将RNA转录成cDNA。
这一步骤需要逆转录酶和引物，逆转录酶能够将RNA模板转录成cDNA，引物则是用来引导逆转录酶的合成。
在逆转录的过程中，引物将与RNA模板结合，逆转录酶将在引物的引导下合成cDNA链。
这样就得到了cDNA模板，为后续的PCR扩增提供了基础。
接下来是PCR扩增，即利用聚合酶链式反应对cDNA进行扩增。
在PCR反应中，需要两种引物，分别是前向引物和反向引物。
这两种引物将在PCR反应中与cDNA模板配对，聚合酶将在引物的引导下合成新的DNA链。
通过多轮的PCR反应，可以将目标DNA序列扩增到可检测的水平。
PCR扩增是RT-PCR技术的关键步骤，它能够快速、高效地扩增目标DNA序列，为后续的检测提供了充分的材料。
最后是检测，即对扩增后的DNA进行检测分析。
常用的检测方法包括凝胶电泳、实时荧光定量PCR和测序等。
凝胶电泳是一种常规的检测方法，通过电泳将扩增后的DNA分离并观察。
实时荧光定量PCR则是一种高灵敏度和高特异性的检测方法，可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而定量分析目标DNA的含量。
而测序则是一种直接测定DNA序列的方法，可以准确地确定目标DNA的碱基序列。
这些检测方法可以根据实际需求进行选择，以满足不同的研究和临床应用。
总的来说，RT-PCR技术通过逆转录、PCR扩增和检测三个步骤，实现了对RNA的检测和分析。
它具有高灵敏度、高特异性和高效性的特点，可以广泛应用于基因表达分析、病毒检测、肿瘤诊断等领域。
随着生物技术的不断发展，RT-PCR技术也在不断完善和改进，为科研和临床诊断提供了强大的工具和支持。
rtpcr原理
rtpcr原理RT-PCR原理。
RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种将RNA转录成cDNA，然后再进行PCR扩增的技术。
它是PCR技术的一个变种，常用于检测RNA病毒、研究基因表达等领域。
下面将详细介绍RT-PCR的原理。
首先，RT-PCR的第一步是将RNA转录成cDNA。
这一步需要使用逆转录酶（Reverse Transcriptase）来完成。
逆转录酶能够将RNA模板上的核糖核酸序列转录成互补的DNA序列。
在这一步中，需要加入一条引物（primer），它会与RNA模板上的特定序列结合，作为逆转录酶合成cDNA的起始点。
接下来，转录生成的cDNA会作为PCR的模板进行扩增。
PCR扩增是通过DNA聚合酶（DNA Polymerase）在不断变换的温度下进行的。
首先是变性，将双链DNA变性为两条单链DNA。
然后是退火，引物与模板DNA结合。
最后是延伸，DNA聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这样，经过多轮循环，就可以将少量的RNA扩增成大量的DNA。
RT-PCR的原理可以通过以下几个关键步骤来概括，首先是逆转录，将RNA转录成cDNA。
然后是PCR扩增，通过多轮循环将cDNA扩增成大量的DNA。
最终，可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法来检测扩增产物。
RT-PCR的原理在实际应用中有着广泛的意义。
例如，在病毒检测中，可以通过RT-PCR来检测病毒RNA，从而进行病毒的早期诊断和监测。
在基因表达研究中，可以通过RT-PCR来检测特定基因的mRNA水平，从而了解基因的表达情况。
此外，RT-PCR还可以用于克隆特定基因、分析基因多态性等领域。
总的来说，RT-PCR是一种重要的分子生物学技术，其原理简单清晰，应用广泛。
通过将RNA转录成cDNA，然后再进行PCR扩增，可以快速、准确地检测目标RNA的存在，从而在医学诊断、基因表达研究等领域发挥重要作用。
RTPCR常见问题分析
严格控制实验操作过程
总结词
实验操作过程的准确性和规范性对RTPCR实验结果具有重要影响，严格控制实验操作 过程可以有效提高实验的准确性和可靠性。
详细描述
遵循标准的RTPCR实验操作流程，确保每一步操作的准确性和规范性。在实验过程中， 注意避免交叉污染和误差传递，使用一次性吸头和离心管，避免使用污染的工具和容器。
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RTPCR常见问题分析
目录
• RTPCR技术概述 • RTPCR实验过程常见问题 • RTPCR结果解读常见问题 • RTPCR技术改进和优化建议
01
RTPCR技术概述
RTPCR技术简介
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR），简称RTPCR， 是一种在PCR反应过程中实时监测荧 光信号的分子生物学技术。
同时，对实验操作人员进行培训和考核，确保其具备足够的技能和经验。
完善扩增产物检测方法
总结词
扩增产物检测是RTPCR实验的关键环节，完善扩增产物 检测方法可以有效提高实验的准确性和可靠性。
详细描述
选择灵敏度高、特异性好的检测方法，如荧光定量PCR 、熔解曲线分析等。同时，采用内参基因对实验结果进 行校正和标准化处理，以排除实验过程中可能存在的误 差和干扰因素。此外，应定期对检测方法进行验证和优 化，以确保其性能的可靠性和稳定性。
04
RTPCR技术改进和优化 建议
优化样本采集和保存方法
总结词
详细描述
样本质量是影响RTPCR实验结果的重要因素， 优化样本采集和保存方法可以有效提高实验 的准确性和可靠性。
在采集样本时，应选择适当的采集时间、部 位和数量，避免样本受到污染或降解。采集 后应尽快将样本保存于适当的介质中，并保 持低温，以维持样本的稳定性和活性。
rtpcr原理
rtpcr原理RT-PCR原理。
RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测RNA的技术，它能够将RNA转录成cDNA，再进行PCR扩增，从而实现对RNA的定量和定性分析。
RT-PCR技术在医学诊断、生物学研究和疾病治疗等领域具有广泛的应用。
首先，RT-PCR的原理是基于PCR技术。
PCR技术是一种体外扩增DNA的方法，通过不断重复DNA的变性、退火和延伸，从而在短时间内扩增出目标DNA片段。
在RT-PCR中，首先需要将RNA转录成cDNA，然后再进行PCR扩增。
这样一来，就可以通过PCR技术对RNA进行扩增和分析。
其次，RT-PCR的关键步骤是RNA的逆转录。
逆转录是指将RNA模板转录成cDNA的过程，这一步骤需要逆转录酶和引物的协同作用。
首先，RNA模板与引物结合形成引物-RNA复合物，然后逆转录酶将RNA模板转录成cDNA。
逆转录过程中，逆转录酶具有RNA依赖的DNA聚合酶活性，能够合成cDNA链。
经过逆转录，就得到了cDNA，为后续的PCR扩增提供了模板。
接下来，PCR扩增是RT-PCR的另一个重要步骤。
PCR扩增是通过DNA聚合酶在一系列变性、退火和延伸的循环中，对DNA模板进行扩增。
在RT-PCR中，cDNA作为模板，与引物和DNA聚合酶一起进行PCR扩增。
引物是针对目标基因的特异性引物，能够在PCR反应中特异性地结合到目标序列上。
通过PCR扩增，可以快速、高效地获得目标基因的扩增产物。
最后，RT-PCR的结果分析是基于扩增产物的检测。
扩增产物可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法进行检测和分析。
凝胶电泳是一种常用的扩增产物分析方法，通过电泳将扩增产物分离，并通过染色剂染色后观察。
而实时荧光定量PCR则是一种精准、快速的扩增产物定量分析方法，通过实时检测PCR反应体系中的荧光信号，可以实现对扩增产物的定量分析。
RTpcr技术的原理
RTpcr技术的原理RTpcr技术（逆转录聚合酶链反应技术），是一种基于聚合酶链反应（PCR）原理和逆转录酶（reverse transcriptase）的技术。
逆转录是一种生物学过程，它将RNA转录成相应的DNA。
这项技术在分子生物学和生物医学研究中广泛应用，特别用于病原体检测、基因表达研究和疾病诊断。
1. RTpcr技术的基本原理RTpcr技术的基本原理是先利用逆转录酶将目标RNA转录成cDNA（亦称为反转录，即逆转录），然后以cDNA作为模板进行PCR扩增。
整个过程分为两个关键步骤：逆转录和PCR反应。
2. 逆转录过程逆转录过程是RTpcr技术的第一步，其目的是将RNA转录成cDNA。
逆转录酶是这一步的关键酶类，它能够将RNA作为模板，并合成相应的cDNA。
常用的逆转录酶有AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶和Tth逆转录酶等。
逆转录过程包括以下步骤：1.首先，逆转录酶结合到引物上，在低温下发生结合反应，形成逆转录酶-引物复合物。
2.然后，复合物结合到RNA模板上，在合适的反应条件下，逆转录酶开始合成新的cDNA链。
3.在合成过程中，逆转录酶通过酶的核酸酶活性，将RNA模板逐渐降解，最终产生单链cDNA。
4.最后，通过加热反应停止并灭活逆转录酶。
3. PCR反应过程PCR反应是RTpcr技术的第二步，其目的是扩增cDNA。
PCR反应是通过三步循环反应不断倍增DNA，使其产生指数级的增加。
PCR反应包括以下步骤：1.Denaturation（变性）：将PCR反应体系加热至95℃，使DNA双链解开为两根单链。
2.Annealing（退火）：将反应体系降温至适合引物结合的温度，引物与目标序列互补结合。
3.Extension（延伸）：将反应体系温度升高至逆转录酶的最适温度，逆转录酶开始在引物的引导下合成新的DNA链。
以上三个步骤循环进行，每个循环使DNA序列倍增一倍。
通过适当的循环次数，可以将最初微小的DNA片段扩增至足够数量。
rtpcr的作用
rtpcr的作用什么是rtpcrrtpcr（全称为逆转录聚合酶链反应，Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction），是一种基因检测技术，可以用于检测RNA分子在样本中的存在并量化。
rtpcr的原理rtpcr技术基于聚合酶链反应（PCR）的原理，通过逆转录将RNA转化为反义DNA （cDNA），然后使用一对特定的引物（primers）扩增目标基因的DNA片段。
逆转录过程中，逆转录酶将RNA模板反向转录合成cDNA，在PCR反应中，DNA聚合酶通过引物将cDNA扩增成大量的DNA。
这个过程可以使我们检测到RNA分子的存在，并量化RNA的数量。
rtpcr的应用rtpcr技术在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用，特别是在疾病的诊断和治疗中起着重要作用。
1.病原体检测：rtpcr可以检测感染性疾病的病原体，如病毒和细菌。
通过扩增病原体酸核酸的特定片段，可以快速准确地诊断出病原体感染。
2.基因表达分析：rtpcr可以评估基因在不同组织或细胞中的表达水平。
通过对比不同样本中目标基因的表达差异，可以研究基因在生理和病理过程中的调控机制。
3.肿瘤检测：rtpcr可以检测肿瘤标志物，通过扩增患者体液或组织中的肿瘤相关基因，可以及早诊断出肿瘤，进行早期治疗。
4.遗传疾病诊断：rtpcr可以检测遗传疾病的突变基因，帮助医生确定患者是否携带致病基因，并进行遗传咨询和干预。
5.药物研发：rtpcr可以评估药物对特定基因的调控作用，在新药研发中有着重要的应用价值。
rtpcr的优势和局限性rtpcr技术相比传统的基因检测方法具有以下优势：•高灵敏度：可以检测到非常低浓度的目标RNA，并能够量化RNA的表达水平。
•高特异性：通过引物的设计，可以选择性地扩增目标基因，减少误报率。
•高准确性：可以重复多次扩增同一样本，并获得可重复的结果。
然而，rtpcr技术也存在一些局限性：•需要引物设计：需要针对目标基因设计特异引物，这对于一些未知基因或变异较多的基因可能存在困难。
RTPCR的基本原理
RTPCR的基本原理一、什么是RTPCRRTPCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种基因检测技术，常用于检测RNA的数量和序列特征。
通过该技术，可以对RNA进行逆转录合成DNA，然后利用聚合酶链反应（PCR）放大DNA的特定片段。
RTPCR技术在医学、生物学和疾病诊断领域具有广泛的应用。
二、RTPCR的基本步骤RTPCR技术主要包括逆转录、PCR放大和检测三个步骤。
1. 逆转录逆转录是将RNA转录为DNA的过程。
在逆转录过程中，需要使用逆转录酶、RNA 模板和引物（primers）进行反应。
逆转录酶能够将RNA模板中的核苷酸序列反转录成互补的DNA链。
引物是一小段DNA或RNA序列，在逆转录过程中与RNA模板发生互补配对，作为起始合成新DNA链的起点。
2. PCR放大PCR放大是将逆转录得到的DNA片段进行指数级扩增的过程。
在PCR反应体系中，需要加入逆转录产物、DNA聚合酶、引物和dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）。
PCR 反应通过循环加热和冷却的步骤，在不同温度下引发DNA的分离、复性和扩增。
反复的PCR循环能够使目标DNA片段的数量成倍增加。
3. 检测PCR放大后的DNA片段可以进行进一步的检测和分析。
常用的检测方法包括凝胶电泳、荧光探针或荧光染料结合等技术。
通过这些方法，可以检测到目标DNA片段的数量和特异性。
三、RTPCR的应用RTPCR技术在医学和生物学领域有广泛的应用。
1. 疾病诊断RTPCR可以检测病原体的基因序列，用于疾病的早期诊断和追踪。
例如，在新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情中，RTPCR被广泛应用于检测病毒的核酸，以帮助诊断和追踪病例。
2. 基因表达分析RTPCR可以检测和分析基因的表达水平。
通过检测特定基因的转录水平，可以了解基因在不同组织、不同发育阶段或不同环境条件下的表达差异。
这对于研究基因功能和调控机制非常重要。
rtpcr的原理实验步骤及应用
RTPCR的原理实验步骤及应用概述逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，简称RT-PCR），是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测和定量分析RNA分子在细胞中的表达水平。
本文将介绍RT-PCR的原理、实验步骤及应用。
原理RTPCR利用逆转录酶（Reverse Transcriptase，简称RT）将RNA模板逆转录为cDNA（complementary DNA），然后通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）对cDNA进行扩增，最终得到大量的目标DNA片段。
RT-PCR的基本原理如下：1.逆转录：反转录酶RT利用RNA模板合成与之互补的cDNA。
在逆转录过程中，需要引入一条逆转录引物（反向互补RNA链）作为反转录的起始点。
2.PCR扩增：将逆转录合成的cDNA作为模板，引入一对特异性引物，通过PCR反应进行DNA扩增。
PCR反应分为三个步骤：变性、退火和扩增。
3.变性：将反应温度升高至95°C，使DNA双链变性为两条单链。
4.退火：将反应温度降低至特异性引物的退火温度，使引物与模板序列互相结合。
5.扩增：将反应温度升高至适合DNA聚合酶的活性温度，使DNA聚合酶逆反应合成DNA。
通过多轮的PCR反应，可以扩增出大量的目标DNA片段，其数量呈指数级增长。
实验步骤1. 样品处理首先需要从待检测的样品中提取总RNA，常用的提取方法有酚氯仿法和柱式纯化法。
提取得到的总RNA需要通过比色法或者用分光光度计进行测量，确保样品的质量和浓度。
2. 逆转录反应逆转录反应是将RNA模板转录为cDNA的过程。
需要准备逆转录试剂盒，主要包括逆转录酶、随机引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液。
按照试剂盒说明书的配方，将总RNA与逆转录试剂混合，进行逆转录反应。
反应结束后，需要进行热灭活，以停止反应。
《RTPCR技术原理》课件
RTPCR是一种常用的遗传学分析技术，通过在实验室中模拟自然界的PCR过 程，扩增DNA片段，从而实现对基因的分析和研究。
RTPCR技术原理
什么是RTPCR技术
RTPCR技术是一种基于PCR扩增原理开发而来的遗传学分析方法，可以高效地复制和研究 DNA序列。
RTPCR技术的优点
RTPCR技术具有高灵敏度、高特异性、高通量和快速等优点，成为现代分子生物学研究中 不可或缺的工具。
RTPCR技术利用PCR反应中的循环式 扩增机制，快速复制目标DNA序列， 从而使其在检测中能够得到可靠的结 果。
RTPCR技术原理
RTPCR技术的应用领 域
RTPCR技术在医学领域被 广泛应用于疾病诊断、遗 传性疾病筛查、药物研发 等方面。
RTPCR在食品安全领 域的应用
RTPCR技术可以用于检测 食品中的致病菌、转基因 成分、有害物质等，保障 食品安全。
RTPCR技术原理
1
RTPCR反应体系组成
2
RTPCR反应体系包括RNA、逆转录酶、
引物、酶、核酸酶和缓冲液等多种组
分，以保证反应的高效、特异性和稳
3
Байду номын сангаас
定性。
RTPCR流程介绍
RTPCR技术包括反转录和PCR两个基 本步骤，通过这两个步骤可以将RNA 转录为cDNA并扩增目标DNA序列。
RTPCR放大机制
2 RTPCR技术的发展趋势
RTPCR技术将更加智能化、快速化、低成本化，实现更高效的基因分析和诊断。
3 RTPCR技术的未来应用简述
RTPCR技术有望在个性化医疗、精准农业和环境污染治理等领域得到更广泛的应用。
RTPCR技术原理
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RT-PCR
试剂配制
(1)O.1％DEPC水：l ml DEPC+1000 ml双蒸水，高压灭菌后用于配制RNA提取的相关试剂。
如果浸泡RNA提取的相关器皿，则应在DEPC水配制后立即使用。
(2)10 mg·ml-1溴乙锭：1 g溴乙锭溶于100 ml去离子水中，避光保存，溴乙锭的工作浓度为0.5µg·ml-1。
(3)5×TBE储存液:Tris 54g,硼酸 27.5g，EDTA pH8.0(固体NaOH调,先配100ml) 20ml，定容到1L。
(每种药品都用蒸馏水先溶解，都比较难溶，再互溶效果好点。
)
0.5×TBE工作液是5×TBE储存液稀释10倍。
(4)1％琼脂糖凝胶：0.3 g琼脂糖溶于30 ml 0.5×TBE溶液中，在微波炉中加热充分溶解琼脂糖，待溶液冷却至60℃左右，加入10 mg·ml-1溴乙锭溶液1µL(终浓度为O.5µg·ml-1)，将琼脂糖溶液倒入制胶模中，在适当位置处插上梳子。
凝胶的厚度一般在3-5mm之间。
在室温下使胶凝固，然后点样放置于电泳槽中进行电泳。
RNA提取前的准备
1.组织保存：小鼠处死后脏器迅速冻存于液氮罐中。
2. 研钵，剪刀及镊子的处理
1) 自来水反复冲洗；2) 去污剂或者洗涤灵冲洗；3) 自来水反复冲洗；4) 用锡箔纸包裹研钵研棒等，180度干烤4－8小时，除去RNAase
3. 枪头及EP管（0.5ml,1.5ml，5ml）的处理
1) 0.1%DEPC水浸泡1～2天；2) 用镊子夹起枪头一一装入枪头盒中，用镊子夹起EP管放入饭盒中；3) 高压灭菌50min，45度烘箱烘干（需几天）。
RT-PCR方法
总RNA的提取：
1.组织匀浆：先放入液氮入碾钵内，把分装放入液氮中的一份肝脏入碾钵内，碾磨，边加液氮边碾磨。
用DEPC水处理的1.5ml的EP管刮下碾钵上的肝脏，加入1ml RNAVzol混匀。
裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体。
室温放置5分钟。
对于多糖、蛋白等杂质丰富的组织样品，匀浆后仍会存留有不溶物质，可12,000 g 4℃离心10分钟，然后吸取上清至一新的DEPC水处理的1.5ml离心管中。
2.分离：
在装有裂解物的离心管中加入0.2倍体积的氯仿（1 ml RNAVzol加入0.2 ml氯仿），振荡器上充分振荡混匀30 秒，室温放置2-3分钟。
12,000 g 4℃离心10分钟，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的DEPC水处理的1.5ml离心管中，每毫升RNAVzol约可吸取0.5～0.55 ml。
有机相和中间层含有DNA和蛋白质，应避免触及。
3.沉淀：
按每毫升最初的RNAVzol加入0.5 ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。
12,000 g4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀。
弃上清，每毫升最初的RNAVzol
加入1 ml 75%乙醇（可先加0.75ml的无水乙醇，再加灭菌的DEPC水），轻轻颠倒混匀，以清洗RNA沉淀，12000 g，4℃离心5 min后小心弃去乙醇弃去液体，小心勿丢弃RNA沉淀。
室温倒置晾干（5～10分钟）。
4.溶解：
加入适量（50µl）DEPC 水或TE 缓冲液使RNA沉淀溶解，用手指轻弹后离心3-5 s。
分装成两管，每管22µl，存放于-80℃保存（可保存半年）；另外再取5µlRNA加4µl 灭菌的DEPC水加1µl上样Buffer，准备跑电泳。
RNA的鉴定及定量：
取上述RNA溶液2µl溶于198µl DEPC水中，用紫外分光光度计检测260 nm的吸光度(OD)值及280 nm的吸光度(0D)值，并计算OD260 nm／OD280 nm的比值，测定所提取的总RNA的含量和纯度，用1.0％的琼脂糖电泳鉴定RNA有无降解。
1％琼脂糖凝胶：0.3 g琼脂糖溶于30 ml 0.5×TBE溶液中，在微波炉中加热充分溶解琼脂糖，待溶液冷却至60℃左右，加入10 mg·ml-1溴乙锭溶液1µL(终浓度为O.5µg·ml-1)，将琼脂糖溶液倒入制胶模中，在适当位置处插上梳子。
凝胶的厚度一般在3-5mm 之间。
在室温下使胶凝固，然后点样放置于电泳槽中进行电泳，恒定电压120V，跑15min，取出胶到凝胶成像系统拍照。
(3)引物设计及合成：
根据Genebank公布的相应的mRNA序列，使用Primer Premier5.0引物设计软件设计引物，由有限公司合成。
基因名称上下游引物序列(5’to 3') 产物片断大小bp 退火温度℃
Forward primer GAAATCGTGCGTGACATTA
β-actin 475 54
Reverse primer ACTCATCGTACTCCTGCTTG
Forward primer CACCTTGACACTACACCCTT '
G-6-Pase 420 55.4 Reverse primer GTGGCTGTGAACACCTCT
Forward primer GCCAGCCTACGCCACCATA
GLUT4 345 56.26 Reverse primer ATGCCAACGATGAAGTTACAGG
(4)cDNA的合成：
逆转录反应体系按Fermentas的第一链cDNA合成试剂盒使用说明在冰浴上进行操作：
RNA 0.1-5µg(11.0µl) Oligo(dt)
primer 1.0µl
18
共12.0µl
轻轻混匀后，离心3～5sec，65℃孵育5 min，在冰浴上加入以下反应物。
5x Reaction Buffer 4.0µl Riobolock TM Rnase Inhibitor(20 u·µl-1) 1.0µl
10 mM dNTP Mix 2.0µl RevertAid™ M-MuLV Reverse Transcriptase (200 u/μl) 1.0µl
共20.0µl
轻轻混匀后，离心，42℃孵育60 min，70℃孵育10 min终止反应，置冰浴上
进行后续实验或-20℃冷冻保存。
(5)以cDNA为模板进行PCR扩增反应：
取逆转录产物，在PCR管中分别加入相应引物，以20µl反应体系作PCR。
按GenStar的2×Taq PCR StarMix配制PCR反应液：
cDNA 1.0µl
正向引物（10µM） 1.0µl
反向引物（10µM） 1.0µl
2×Taq PCR StarMix 10.0µl
O 7.0µl
dd H
2
PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，各基因相应最佳退火温度退火45 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃最后延伸7 min。
(6)PCR扩增产物的检测分析：
取上述PCR扩增产物和D2000Maker于1％琼脂糖凝胶中进行电泳，100V 2min后待样品出点样孔，改为80V电泳30min，紫外灯下观察，数码照相，DNA条带光密度用凝胶成像分析系统进行半定量分析。
目的基因mRNA的表达水平用目的基因mRNA ／β-actin mRNA的比值来表示。