rtpcr(rt pcr)
RT-PCR的具体步骤
RT-PCR的具体步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常见的分子生物学技术，用于检测RNA分子。
在本文中，我们将介绍RT-PCR的具体步骤，以便您更加全面地了解这种技术。
1.总RNA提取首先需要从细胞中提取RNA。
这可以通过商用试剂盒或手工方法实现。
如果使用试剂盒，则遵循其说明书中的步骤。
如果手工提取RNA，则需要使用三个基本试剂：细胞裂解缓冲液、氯仿和异丙醇。
步骤如下：•将细胞收集在管中，加入裂解缓冲液。
•冷冻-解冻样品3次，使细胞壁破裂并释放RNA。
•加入氯仿并混合。
•离心样品，使沉淀分离出来。
•将上层溶液转移到另一个管中，加入异丙醇。
•冷藏或冷冻，然后离心。
•去除上层液体，并在无水酒精中对RNA进行洗涤和沉淀。
2.反转录在提取出RNA后，需要将其转录为DNA，即逆转录。
这可以通过使用反转录酶（RT）实现。
在反转录步骤中，会加入反转录引物和其他试剂来增强逆转录效果。
这些引物是由需要扩增的RNA序列的反向互补核酸序列构成的。
这些步骤如下：•将RNA加入反转录反应混合物中，该混合物包含反转录酶、引物和其他必要试剂。
•反转录混合物通常通过加热来促进逆转录引物结合到RNA模板上，并形成RNA-DNA杂交链。
随后，反转录酶在杂交链上寻找RNA模板，并通过降低杂交链的熔点来将反转录引物延伸为cDNA链。
3.PCR扩增完成逆转录后，需要进行PCR扩增以增加cDNA的数量。
PCR是一种将 DNA 扩增到数以百万计的技术，能够扩增非常小的DNA模板。
PCR的步骤如下：•在PCR反应混合物中加入适当的引物和其他必要试剂。
•该反应混合物包括DNA聚合酶、模板DNA、引物和核苷酸。
•反应混合物被放入PCR机器中，按照特定的程序进行加热和冷却，使DNA链复制为两条新的DNA链。
•扩增程度由PCR反应的周期数决定。
4.分析最后，将扩增的DNA分离并分析它们的大小、类型和量。
这可以通过游离电泳或毛细管电泳等技术实现。
rtpcr原理
rtpcr原理RT-PCR原理。
RT-PCR全称为逆转录聚合酶链式反应，是一种用于检测RNA的技术。
它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以将RNA转录成cDNA，然后进行扩增和检测。
这种技术在分子生物学和医学诊断中得到了广泛的应用，尤其在病毒检测和基因表达分析方面有着重要的作用。
RT-PCR的原理主要分为三个步骤，逆转录、PCR扩增和检测。
首先是逆转录，即将RNA转录成cDNA。
这一步骤需要逆转录酶和引物，逆转录酶能够将RNA模板转录成cDNA，引物则是用来引导逆转录酶的合成。
在逆转录的过程中，引物将与RNA模板结合，逆转录酶将在引物的引导下合成cDNA链。
这样就得到了cDNA模板，为后续的PCR扩增提供了基础。
接下来是PCR扩增，即利用聚合酶链式反应对cDNA进行扩增。
在PCR反应中，需要两种引物，分别是前向引物和反向引物。
这两种引物将在PCR反应中与cDNA模板配对，聚合酶将在引物的引导下合成新的DNA链。
通过多轮的PCR反应，可以将目标DNA序列扩增到可检测的水平。
PCR扩增是RT-PCR技术的关键步骤，它能够快速、高效地扩增目标DNA序列，为后续的检测提供了充分的材料。
最后是检测，即对扩增后的DNA进行检测分析。
常用的检测方法包括凝胶电泳、实时荧光定量PCR和测序等。
凝胶电泳是一种常规的检测方法，通过电泳将扩增后的DNA分离并观察。
实时荧光定量PCR则是一种高灵敏度和高特异性的检测方法，可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而定量分析目标DNA的含量。
而测序则是一种直接测定DNA序列的方法，可以准确地确定目标DNA的碱基序列。
这些检测方法可以根据实际需求进行选择，以满足不同的研究和临床应用。
总的来说，RT-PCR技术通过逆转录、PCR扩增和检测三个步骤，实现了对RNA的检测和分析。
它具有高灵敏度、高特异性和高效性的特点，可以广泛应用于基因表达分析、病毒检测、肿瘤诊断等领域。
随着生物技术的不断发展，RT-PCR技术也在不断完善和改进，为科研和临床诊断提供了强大的工具和支持。
rtpcr原理
rtpcr原理RT-PCR原理。
RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种将RNA转录成cDNA，然后再进行PCR扩增的技术。
它是PCR技术的一个变种，常用于检测RNA病毒、研究基因表达等领域。
下面将详细介绍RT-PCR的原理。
首先，RT-PCR的第一步是将RNA转录成cDNA。
这一步需要使用逆转录酶（Reverse Transcriptase）来完成。
逆转录酶能够将RNA模板上的核糖核酸序列转录成互补的DNA序列。
在这一步中，需要加入一条引物（primer），它会与RNA模板上的特定序列结合，作为逆转录酶合成cDNA的起始点。
接下来，转录生成的cDNA会作为PCR的模板进行扩增。
PCR扩增是通过DNA聚合酶（DNA Polymerase）在不断变换的温度下进行的。
首先是变性，将双链DNA变性为两条单链DNA。
然后是退火，引物与模板DNA结合。
最后是延伸，DNA聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这样，经过多轮循环，就可以将少量的RNA扩增成大量的DNA。
RT-PCR的原理可以通过以下几个关键步骤来概括，首先是逆转录，将RNA转录成cDNA。
然后是PCR扩增，通过多轮循环将cDNA扩增成大量的DNA。
最终，可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法来检测扩增产物。
RT-PCR的原理在实际应用中有着广泛的意义。
例如，在病毒检测中，可以通过RT-PCR来检测病毒RNA，从而进行病毒的早期诊断和监测。
在基因表达研究中，可以通过RT-PCR来检测特定基因的mRNA水平，从而了解基因的表达情况。
此外，RT-PCR还可以用于克隆特定基因、分析基因多态性等领域。
总的来说，RT-PCR是一种重要的分子生物学技术，其原理简单清晰，应用广泛。
通过将RNA转录成cDNA，然后再进行PCR扩增，可以快速、准确地检测目标RNA的存在，从而在医学诊断、基因表达研究等领域发挥重要作用。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
4．电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；
5．密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
实验方法 原理
• RT-PCR 技术
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是： 提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶 反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
展开
1．在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂；
2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；
3．内参的设定：主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin （β-肌动蛋白）等。其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均 一各孔间的温度差等所造成的误差；
注意事项 其他
轻轻混匀，离心。42℃孵育 2-5 min；
4．加入 SuperscriptⅡ1 μl ，在 42℃水浴中孵育 50 min；
5． 于 70℃加热 15 min 以终止反应；
6．将管插入冰中，加入 RNase H 1 μl ，37℃孵育 20 min，降解残留的 RNA。-20℃保存备用。
三、PCR
1．取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游 引物（10 pM）2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；
rtpcr原理
rtpcr原理RT-PCR原理。
RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测RNA的技术，它能够将RNA转录成cDNA，再进行PCR扩增，从而实现对RNA的定量和定性分析。
RT-PCR技术在医学诊断、生物学研究和疾病治疗等领域具有广泛的应用。
首先，RT-PCR的原理是基于PCR技术。
PCR技术是一种体外扩增DNA的方法，通过不断重复DNA的变性、退火和延伸，从而在短时间内扩增出目标DNA片段。
在RT-PCR中，首先需要将RNA转录成cDNA，然后再进行PCR扩增。
这样一来，就可以通过PCR技术对RNA进行扩增和分析。
其次，RT-PCR的关键步骤是RNA的逆转录。
逆转录是指将RNA模板转录成cDNA的过程，这一步骤需要逆转录酶和引物的协同作用。
首先，RNA模板与引物结合形成引物-RNA复合物，然后逆转录酶将RNA模板转录成cDNA。
逆转录过程中，逆转录酶具有RNA依赖的DNA聚合酶活性，能够合成cDNA链。
经过逆转录，就得到了cDNA，为后续的PCR扩增提供了模板。
接下来，PCR扩增是RT-PCR的另一个重要步骤。
PCR扩增是通过DNA聚合酶在一系列变性、退火和延伸的循环中，对DNA模板进行扩增。
在RT-PCR中，cDNA作为模板，与引物和DNA聚合酶一起进行PCR扩增。
引物是针对目标基因的特异性引物，能够在PCR反应中特异性地结合到目标序列上。
通过PCR扩增，可以快速、高效地获得目标基因的扩增产物。
最后，RT-PCR的结果分析是基于扩增产物的检测。
扩增产物可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法进行检测和分析。
凝胶电泳是一种常用的扩增产物分析方法，通过电泳将扩增产物分离，并通过染色剂染色后观察。
而实时荧光定量PCR则是一种精准、快速的扩增产物定量分析方法，通过实时检测PCR反应体系中的荧光信号，可以实现对扩增产物的定量分析。
RT-PCR百度百科
概念RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA 的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-P CR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。
）RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。
为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative P CR)。
实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内D NA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”[编辑本段]PCR技术相关试剂A液：变性液B液：醋酸钠溶液C液：酚／氯仿／异戊醇混合液（50：49：1）D液：异丙醇E液：75％乙醇F液：DEPC处理的灭菌去离子水G液：RNA酶抑制剂H液：反转录反应液I液：反转录酶J液：PCR反应液K液：Taq DNA聚合酶(0.5u／µl)L液：矿物油M液：50倍TAE电泳缓冲液N液：溴化乙锭溶液0液：上样缓冲液[编辑本段]PCR各步骤的目的（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。
RTpcr技术的原理
RTpcr技术的原理RTpcr技术（逆转录聚合酶链反应技术），是一种基于聚合酶链反应（PCR）原理和逆转录酶（reverse transcriptase）的技术。
逆转录是一种生物学过程，它将RNA转录成相应的DNA。
这项技术在分子生物学和生物医学研究中广泛应用，特别用于病原体检测、基因表达研究和疾病诊断。
1. RTpcr技术的基本原理RTpcr技术的基本原理是先利用逆转录酶将目标RNA转录成cDNA（亦称为反转录，即逆转录），然后以cDNA作为模板进行PCR扩增。
整个过程分为两个关键步骤：逆转录和PCR反应。
2. 逆转录过程逆转录过程是RTpcr技术的第一步，其目的是将RNA转录成cDNA。
逆转录酶是这一步的关键酶类，它能够将RNA作为模板，并合成相应的cDNA。
常用的逆转录酶有AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶和Tth逆转录酶等。
逆转录过程包括以下步骤：1.首先，逆转录酶结合到引物上，在低温下发生结合反应，形成逆转录酶-引物复合物。
2.然后，复合物结合到RNA模板上，在合适的反应条件下，逆转录酶开始合成新的cDNA链。
3.在合成过程中，逆转录酶通过酶的核酸酶活性，将RNA模板逐渐降解，最终产生单链cDNA。
4.最后，通过加热反应停止并灭活逆转录酶。
3. PCR反应过程PCR反应是RTpcr技术的第二步，其目的是扩增cDNA。
PCR反应是通过三步循环反应不断倍增DNA，使其产生指数级的增加。
PCR反应包括以下步骤：1.Denaturation（变性）：将PCR反应体系加热至95℃，使DNA双链解开为两根单链。
2.Annealing（退火）：将反应体系降温至适合引物结合的温度，引物与目标序列互补结合。
3.Extension（延伸）：将反应体系温度升高至逆转录酶的最适温度，逆转录酶开始在引物的引导下合成新的DNA链。
以上三个步骤循环进行，每个循环使DNA序列倍增一倍。
通过适当的循环次数，可以将最初微小的DNA片段扩增至足够数量。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
rt-pcr（rt - pcr）I. Experimental apparatus and materials:1, transfer guns: 1ml, 200 L, 20 L, 10 L, 2 L2, suction head: 1ml, 200 L, 20 L3, homogenate tube: 5ml4, suction head table: put 1ml suction head one, put 20 l suction head one5, EP tubes: 1.5ml, 0.2ml, 100 L6, reagent bottle: 2 60ml Brown reagent bottle (wide mouth, with cover)1 125ml white reagent bottles (with absolute ethanol)7, 50ml, 250ml, 500ml: a8, capacity bottle: 250ml, 500ml, 1000ml9, test tube rack: 5ml, 1.5ml, 20 L10, salt water bottles: 250ml, 500ml each 2 spare, one with absolute ethanol, another with DEPC water11, aluminum lunch box: 412, plastic small lunch box: 113, large porcelain cylinder: 214, tin paper: a roll15 rolls of paper: 2 rolls16, triangle flask: with a cap, slightly largerTwo, the processing and preparation of experimental equipment1, plastic products: (including gun head, EP tube, homogenate tube, etc.)The DEPC of water from the flask into the ceramic cylinder, the plastic products by soaking them, which requires a small tip Straw DEPC into the water, and then dried overnight, high pressure, spare, before the experiment will first put the gun suction head, and a high pressure (EP tube)2, glass products: acid soaking overnight, washed clean, dry spare foil Mongolia (DEPC blister) (wash after the first bubble 1 per thousand DEPC overnight, and then dried)3, homogenizer: (including scissors, tweezers) first wash, and then high pressure (do not need to bubble DEPC)Three. Reagent preparation:1, DEPC water: suck 1ml, placed in 1000ml double steamed water, with 1 per thousand DEPC water, placed in the 1000ml capacitybottle, static 4 hours standby.2, 75% ethanol: with anhydrous ethanol DEPC water, and then put -20 degrees preservation (where DEPC water should be high pressure)3, isopropyl alcohol: put brown bottle4, chloroform: put in brown bottle5 agaroseFour. Preparation of several buffers:1 Electrophoresis buffer:Tris 54GBoric acid 27.5g0.5M, EDTA, 20ml? PH8.0Distilled water 1000ml5 x TBE (Zhu Cunye)The 5 x TBE is diluted 10 times to 0.5TBE, which can be used in electrophoresis (i.e., the concentration of the working fluid), such as 50ml storage solution, 450ml water, 500ml working buffer2, the sample buffer:0.25% bromo phenol blue0.25% xylene green FF30% glycerin6 * buffer solution, stored at 4 DEG CFive. Preparation of agarose gel:1 and 1%:1.0g 100ml agarose electrophoresis buffer, microwave oven fire 30 seconds to boiling, adding2.5 L agar 10mg/ml ethidium bromide cooled to 60 DEG C melting, mixing, will warm into the gel film has been set a good comb, placing 30-45min at room temperature after the electrophoresis.2 and 1.5%:Ditto, change the amount of agarose to 1.5gSix, the purchase of Rt-PCR materials:(working man. Tel. 2236106.)Taq enzyme (containing MgCl2, Buffer) 200u 70DNTP: 1Oligo (dT) 15: 1 OD 40 PromegaM-MLV: 1, 250, Promega (Buffer)RNasin: 1, 110---20 DEG CDEPC 5g 110Trizol 100ml/1 bottles Invitrogen Life technologies - 4 degrees centigradeMarker: 10 g 0.2 g/ml 150 Kuwait(1543., 994., 697., 515., 377.231)Seven. Primer synthesisJustice: 5 '-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3' Antisense: 5 '-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'2, par-4:Justice: 5 '-GGGACCTCGGAACTCAAC-3'Antisense: 5 '-TGTATCTGCCTGGGACTG-3'3. Calculation of annealing temperature2 (A, T) 4 (G, C)The average number of positive and negative averages fluctuates again and again (+ 4 DEG C, or + 5 DEG C)4. The primers are 5 OD each, and each OD bottle is packed separately5 primer dilution:The amount of water added to DEPC is (L)= nmol / OD * on the tube marked OD * 100Is a primer solution for 10p mol / L concentrationEight and PCR electrophoresisThe first 1-10 L PCR products, and has little on paper by LAN, repeatedly playing suction after mixing by electrophoresis, the general current of 10mA, power 100V, electrophoresis 30 minutes, observed under ultraviolet light, satisfactory results for scanning and printing.Nine, several points of attention:1, the key step of reverse transcription is immediate ice water bath2, Rt, first open PCR preheat 30 minutes.3, RNA pumping ahead, open the centrifuge pre cooling.Total RNA was extracted by TRIzolCells 1 * 107Tissue 100mgHerePlus 1mlTRIzolThe cells were blown to the liquid with a 1ml sampler and clarified without cell massHereHomogenate (thoroughly, then transferred to the EP tube)(tissue homogenate >100mg 1ml/ EP tube each time)HereMix it upside down 10 times, room temperature for 5 minutesHereChlorination of 1/5 volume (0.2ml) (must press the total volume of 1/5)HereMix it upside down 10 times, room temperature for 5 minutesHere4 DEG C, centrifuged 12000g, 15 minutesHereTransfer to the upper aqueous phase (about 400 l) in another 1.5mlEP tubeHereAdd an equal volume of isopropyl alcohol (about 400 l) and mix it for 10 minutes at room temperatureHere4 DEG C, centrifuged 12000g, 10 minutesHereSupernatantHere75% ethanol (DEPC water) 1ml with iceHereCentrifuge at 7500g for 4 minutes for 5 minutesHereDiscard the supernatant and let the air dry for 5-10 minutes (not completely dry)HereSoluble in DEPC water to 20 l (10 L-20 L)(water soluble at <10 for 55-60 minutes.)Note:1, RNA if used for nucleic acid transfer, should be dissolved in the sample buffer, or DEPC dissolved2, the cell tissue plus TRIzol homogenate can be placed at least -60 months (or more than a year)3, RNA in 75% ethanol, 2-8 DEG C can be stored for at least one week, -20 DEG C can be stored for at least one yearTwo step RT-PCR(step 1: reverse transcription)Concentration of reagentRNA 23 Mu L (11.5 L)Oligo (dT) 150.05 mu g/ Mu L, 4 Mu L (2 L) 0.005 mu g/ Mu L (diluted 10 times)HereMixing, centrifugation, 70 5minHereImmediately ice bath, slightly centrifugalHereConcentration of reagentM-MLV Buffer 5 * 8 L (4 L) 1 *DNTP 10mM 2 mu L (1 L) 0.5mMRNasin 40U/ Mu L 1 mu L (0.5 L) 20 muM-MLV 200U/ Mu L 2 mu L (1 L) 200UThe total volume is 40 L (20 L)HereMixing, centrifugation, 42 60minHere95 10min (destroy MLV)Here4 degrees preservationTwo step RT-PCR(second step: PCR reaction)The total volume is 20 l (50 L)Concentration of reagentTaq Buffer 10 * 2 L (5 l_) 1 *MgCl2 25mM 1.2 Mu L (3 L) 1.5mMDNTP 10mM 0.2 Mu L (0.5 L) <200uMUpstream primers 10pmol/, Mu L, 0.3 Mu L (1 L) 10pmol Downstream primers 10pmol/, Mu L, 0.3 Mu L (1 L) 10pmol CDNA template X () (1-10 L)DEPC water 20 l-4.3 l-XTaq enzyme 2.5U/ Mu L, 0.3 Mu L (1 L) 2.5U/ Mu L HereMixHere97 degrees, 5 minutesHereInstant ice bathHereMixHerePre denaturation at 95, 594 DEG C, 30 second degenerationAnnealing at 40 X72 degrees, 30 seconds extension72 point, 7 point, end extension28-36 cycle, 4 degree heat preservationThree electrophoresis:Add 1-10 Mu L PCR product bromine Finland (1-2.5 L) mix, add sample, electrophoresis.Note: Taq enzymes, M-MLV and Rnasin are stored at -20 DEG C and placed on ice during operation. DNTP do not freeze again and again.。