Westernblot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的
Westernblot法检测大鼠肝组织清蛋白的表达实验
蛋白质的分离与电泳
蛋白质的分离与电泳是Westernblot法的关键步骤之一。通过电泳，将复杂的蛋白质混合物根据分子量大小进行分离，以便 后续的转膜和检测。
常用的电泳方法包括SDS-PAGE和Native-PAGE，前者利用SDS将蛋白质变性并带负电荷，根据分子量大小分离；后者则在不改变 蛋白质天然电荷和形状的情况下进行分离。
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详细描述
实验结果表明，清蛋白在正常大鼠肝组织中高表达， 而在肝损伤大鼠肝组织中表达量明显降低。这可能是 因为清蛋白合成减少或降解增加导致其在肝损伤大鼠 肝组织中的表达量降低。此外，我们还发现清蛋白表 达量与肝组织病变程度呈负相关，这提示清蛋白可能 对肝组织的保护作用。因此，我们推测清蛋白可能通 过某种机制参与了肝组织的保护作用，具体机制需要 进一步研究。
处理肝组织样本
将肝组织样本进行匀浆处理，以充分破碎细胞，释放出细胞内的清蛋白。
蛋白质的提取与定量
蛋白质提取
利用细胞裂解液将处理后的肝组 织样本中的蛋白质提取出来。
蛋白质定量
利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对 提取出的蛋白质进行定量，以确 保后续实验的准确性。
电泳与转膜
电泳
将提取出的蛋白质进行SDS-PAGE电泳分 离，以便将不同大小的蛋白质分开。
荧光染料等）。
通过免疫杂交，目标蛋白质与特异性抗体结合，形成 复合物。
显色反应是利用标记物催化底物生成有色产物，从而 在膜上显示出目标蛋白质的位置和量。常见的显色反
应包括酶促反应和化学发光反应。
03
实验步骤
肝组织样本的收集与处理
收集大鼠肝组织样本
在实验动物大鼠处死后，迅速取出肝组织，并立即放入液氮中冷冻保存。
蛋白质印迹法westernblot
蛋白质印迹法蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。
它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot蛋白免疫印迹Western Blot类似方法1 Southern Blot 杂交方法类似方法2 Northern Blot 杂交方法使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴原理与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
⑴分类Western Blot 显色的方法主要有以下几种:i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下(二抗用HRP标记)：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRR 即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
western blot
凝胶制备
1、清洗玻璃板：洗洁精、避免划痕、水既不聚集成滴，又不成股流下
2、制胶（分离胶）：按顺序各组分加入离心管中（注意Tris-HCl的浓 度 和 PH ， 最 后 加 入 适 量 Aps 和 TEMED ） ， 混 匀 后 迅 速 灌 胶 ， 乙 醇 /ddH2O压胶（隔绝氧气对丙烯酰胺聚合的抑制作用，将胶压平），待 分离胶完全凝固（乙醇/ ddH2O 与分离胶之间有一条明显的折光线）
➢ 蛋白变性
20
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
电荷效应
------
-
v=at
a=F/m F=qC
v：速度 a：加速度 t：时间 F：电场力
q=nm
v=nCt
m：质量 q：粒子所带电荷 n：电荷质量系数
++++++
s：位移
s= 1 at2 = 1 nCt2
2
2
21
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
分子筛效应
22
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
33
抗体
Fc（种属特异性）
34
一抗&二抗
目的蛋白
二抗
➢ 放大信号 ➢ 标记Fra bibliotek一抗35
兔源抗体&鼠源抗体
兔源一抗 山羊抗兔
鼠源一抗
SDS-PAGE电泳
………………………………………………
14
电泳
带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极 移动，称为电泳
15
电泳设备
16
SDS-PAGE凝胶
➢ Tris-HCL（PH6.8/8.8）
➢ 30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺
➢ SDS
➢ APS ➢ TEMED
Westernblot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的
Western blot实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法。
原理与Southern 或Northern 杂交方法类似，但Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
三、操作步骤（一）样品处理1 培养的细胞：⑴ 去培养液后用温的PBS 冲洗2~3 遍（冷的PBS 有可能使细胞脱落）。
⑵ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶ 用细胞刮刮下细胞，收集在EP 管后超声（100~200w）3s，2 次。
⑷ 12000g 离心，4℃，2min。
⑸ 取少量上清进行定量。
⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2 天，每次上样前98℃，3min。
或收取细胞于EP 管中加入适量的1×SDS，吹匀，100 度5min,重复一次。
1200rpm ,10min.取上清定量。
3．组织：⑴ 匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg 加1ml 裂解液，肺100~200mg 加1ml 裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g 离心，4℃，2min。
⑶ 取少量上清进行定量。
⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
Western-blot试验技术
Western-blot试验技术Western-blot试验技术概论它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无需对靶蛋白进行同位素标记。
几乎总在变性条件下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题。
具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。
被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。
溶解蛋白策略1使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这可能导致免疫反应性的丢失。
2采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。
机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。
细胞表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力，变性蛋白比天然蛋白更容易降解。
往往可以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调整提取的条件。
为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血清或多种单克隆抗体的混合物，因为他们可与某一蛋白的多种形式起反应。
溶解方法溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质：1表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解。
2酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后制备提取液。
3哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液。
4哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。
如果靶抗原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲液裂解。
细胞准备用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变得很粘稠。
吸入1.5ml离心管。
超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。
4度，13000rpm，30分钟离心。
分成三层：上层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。
有必要时重复上一步骤。
上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可将上清转入另一Eppendorf-80°C保存注意事项细胞裂解液的量超声的频率，时间，次数。
western blot原理
western blot原理
Western Blot是一种常用的分子生物学实验技术，旨在检测和
分离特定蛋白质的方法。
该技术基于蛋白质的分子量差异和亲和性分离效应。
首先，蛋白质样品需要经过电泳分离，通常是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离。
SDS-PAGE中，样品中的
蛋白质会被不带电的SDS包膜所覆盖，使得蛋白质带有负电荷。
之后，这些带有负电荷的蛋白质会被电场引力依据其分子量大小而迁移，从而在聚丙烯酰胺凝胶上分离得到。
然后，将经过分离的蛋白质转移到一个膜上，通常是聚乙烯二醇或聚维尼尔丙烯酰胺膜。
这个过程被称为电转移。
转移到膜上的蛋白质保持了相同的排列方式，以便进行后续的检测。
接下来，膜被孔隙充满的非特异性蛋白质、胶原蛋白等阻塞物浸泡，以防止非特异性的蛋白质与特定抗体非特异地结合。
在这之后，将特定的一抗（一种针对感兴趣蛋白质的抗体）加入膜上与特定的蛋白质结合形成复合物。
经过洗涤，使非特异性抗体被彻底洗除。
为了检测复合物，通常需要给予一抗一个标记。
通常使用放射性同位素（如^125I），酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记剂。
标记剂的选择取决于进一步检测的方法。
最后，利用放射活性计数器、酶连显色法或荧光显微镜等设备
对膜进行成像，可量化检测特定的蛋白质。
总之，Western Blot技术利用蛋白质的分子量差异和亲和性分离效应，将蛋白质分离、转移到膜上、与特定抗体结合，并通过标记剂检测来获得特定蛋白质的信息。
这是一种广泛应用于生物学研究中的分析工具。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
1. 引言1.1 概述Western blot技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测、定量和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达和相互作用。
它具有高灵敏度、高特异性和较为准确的测量能力，因此在医学科研领域中得到广泛应用。
1.2 文章结构本文将详细介绍Western blot技术的原理、方法、注意事项以及在医学科研中的应用。
首先，我们将阐述免疫检测原理、蛋白质分离与转移原理以及免疫染色与检测原理，帮助读者全面了解该技术的基本原理。
其次，我们将描述样品制备与电泳条件设置、蛋白质转移与固定方法以及免疫染色及可视化方法，为读者提供详细的实验步骤。
随后，我们将介绍实验室操作要求及安全措施、样品处理和保存注意事项以及技术参数调整和结果解读注意事项，以保证实验的准确性和可重复性。
最后，在医学科研领域中的应用方面，我们将以蛋白质表达水平检测、蛋白质亚细胞定位分析以及蛋白质相互作用和功能分析为例，展示Western blot技术在疾病诊断和药物研发等方面的重要应用。
1.3 目的本文的目的是为读者提供对Western blot技术全面了解，并指导其在医学科研中正确应用该技术。
通过详细介绍该技术的原理、方法和注意事项，读者将能够准确地进行实验操作并正确解读结果，同时也能够认识到其在医学科研中的重要性和广泛应用价值。
2. Western blot技术原理2.1 免疫检测原理Western blot技术是一种常用于检测特定蛋白质的免疫学方法。
它基于抗原与抗体的特异性结合关系，通过将蛋白质溶液经过电泳分离、转移到固体载体上，并使用特异性抗体识别目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质的定性和定量检测。
在Western blot中，首先需要将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。
然后，通过将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶或其他固体载体上，在固相载体上形成一个被称为“Western blotting”的蛋白质模式。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
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Western blot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法。
二、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
三、操作步骤（一）样品处理1培养的细胞：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷ 12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
或收取细胞于EP管中加入适量的1×SDS，吹匀，100度5min,重复一次。
1200rpm ,10min.取上清定量。
3．组织：⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml 裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。
提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。
1×loading buffer配方：10% 甘油，50mM Tris·Cl (pH6.8)，2% β-巯基乙醇，0.2~0.5‰溴酚蓝，2%或5%的SDS。
Buffer可配成2×~5×，注意SDS终浓度勿超过10%。
对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。
)（二）配胶1. 注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡加入10%AP及TEMED.2. 封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。
封胶后切记，勿动。
本实验室一般用水或异丙醇封胶。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。
片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。
3.封好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
(10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。
30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.)各种分离胶（三）电泳1．上样前将胶板下的气泡赶走。
2．在需要的地方加入marker (Fermentas)3ul,所有蛋白样品调至等浓度后上样或上等量的蛋白，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。
2．以初始电压为100V强度进行电泳，当marker 分开后换用150V 至距胶下缘1cm 以上结束。
（四）转膜1．电泳结束前10 min戴上手套开始准备：浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。
PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。
将滤纸也浸入转移液中。
2．取胶：将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。
注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）3．转膜：湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入转膜液。
将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。
降温，将电泳槽置于冰水混合物中。
100伏80min 左右，注意不同蛋白的要求不同。
干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2h。
负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。
（五）封闭5%脱脂奶，室温1h。
（六）免疫反应1用TBST洗膜×3/5min.2加入一抗，4℃放置12hr以上。
3弃一抗，用TBST洗膜×34加入辣根过氧化物酶偶联的二抗平稳摇动，室温1h。
弃二抗，用TBST洗膜×3/5min.（七）显色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
本实验室用FUJI仪器进行扫描膜（具体见仪器使用说明）。
四、主要试剂1、烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液: 1.5mol/LTris-HCL(pH8.8):18.17gTris、水75ml再加HCL至pH8.8，加水稀释到100ml终体积。
4、浓缩胶缓冲液: 1mol/LTris-HCL(pH6.8):12.11gTris溶于75mlH2O中，用HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL 调节PH值，而不用Tris.CL。
5、 TEMED原溶液：实验室有商品化的可直接用。
6、 2×SDS 加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。
临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
或10×转膜液：Tris碱30.28，甘氨酸150.14 至800ml.9、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。
使用后应予以废弃。
10、脱脂奶粉5%(w/v)。
11、BST20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/NACL.Tween 按1：1000加入。
12、过化物酶标记的二抗。
五．常见问题1.如何选择最合适的蛋白杂交膜？解答：蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。
选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。
根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。
硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。
在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。
在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
但是膜孔径如果小于0.1mm，蛋白的转移就很难进行了。
因此，我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。
大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的现象。
从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。
硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，因而降低了蛋白的结合量。
S&S公司采用的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150μg/cm2。
由于100%的纯度，因而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。
其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。
常规的硝酸纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。
PVDF转移膜：PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。
PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF 作为替代品，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。