第四讲 核酸、蛋白质实验技术(更新)

（1）原位杂交技术
原位杂交（in situ hybridization, ISH）是将 分子杂交和组织细胞化 学结合而产生的一种实 验手段。细胞中的DNA 或RNA与互补顺序的探 针（probe）结合，通过 探针上的标记物显示其 在组织细胞中的位置分 布。 常用探针标记物：同位 素、荧光素、生物素、 地高辛及酶类。
四、核酸的分析方法
主要内容： 1. 分子杂交(molecular hybridization)技术 2. 聚合酶链式反应（PCR）
3. RT-PCR技术
1. 分子杂交技术
具有互补核苷酸序列的两条 单链核苷酸分子片段，在适 当条件下，通过氢键结合， 形成DNA-DNA，DNA-RNA 或RNA-RNA杂交的双链分子。 这种技术可用来测定单链分 子核苷酸序列间是否具有互 补关系。 常用的技术： 1. 原位杂交 2. Southern blot 3. North blot
定量PCR实验中需要考虑的问题： 1. 溶解曲线：验证有无非特异性扩增，优化引物的退火温度； 2. 扩增效率：标准曲线的斜率2.8~3.5间可以接受，3.3时扩增效率是 100%； 3. 定量的方法可以分为绝对定量和相对定量两大类。绝对定量应用 于病毒、病原菌定量检测，转基因拷贝数分解等领域，相对定量主要 应用于mRNA表达量解析。
6. 核酸、蛋白质相互作
用的分析方法
一、RNA的提取
细胞中的RNA有rRNA（80~85%）、mRNA（1~5%）、tRNA和 小分子RNA（10~15%）组成。其中mRNA和小分子RNA是分子 生物学主要的研究对象。
样 品 来 源
28S 18S 5S
Trizol法或试剂盒提取 总RNA
A260 nm / A280 nm =1.8~2.0可接受
3. 流式细胞术
用荧光标记的抗体标记细胞表面或内部的蛋白质，流式细胞 仪可检测到荧光标记阳性细胞在细胞总体当中所占的比例。 Flow cytometer tells the percentage of positive/negtive cells.
4. 酶联免疫吸附 （ELISA）
酶联免疫吸附 (enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA) 过程包括抗体吸附在固相载体上称为包被，加待测抗原，再加 相应酶标记抗体，生成抗体-抗原-酶标记抗体的复合物，再与 该酶的底物反应生成有色产物。借助光吸收计算抗原的量。待 测抗原的定量与有色产生成正比。
间接标记法
2. Western blot
Western blot是将
蛋白质样品通过聚 丙烯酰胺电泳 (SDS-PAGE)按分子 量大小分离，再转 显影 visualization 电泳 electrophoresis 转膜 transfer
抗体孵育 incubation
移到杂交膜上，通
过抗体-抗原相互 作用进行特异性检 测的方法。
SYBR GREEN法
无需特别设计探针引物，价格便宜，但无法特异区分引物二聚体和产 物，可通过溶解曲线来提高反应产物特异性。
TaqMan探针法
检测特异性强，但需要针对每个基因设计特异的引物探针，且价格相 对较贵。
3. RT-PCR
RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转 录PCR，是将RNA的逆转 录（RT）和cDNA的聚合 酶链式扩增反应（PCR） 相结合的技术。具体步 骤包括： 1. 从细胞或特定组织中 提取总RNA。 2. 逆转录实验。 3.扩增内参和目的基因并 比较基因表达差异。
染色质免疫沉淀技术 (chromatin immunoprecipitation ，ChIP) 的基本 原理是在活细胞状态下固定 蛋白质-DNA复合物，并将其 随机切断为一定长度范围内 的染色质小片段，然后通过 免疫学方法沉淀此复合体， 特异性地富集目的蛋白结合 的DNA片段，通过对目的片断 的纯化与检测，从而获得蛋 白质与DNA相互作用(binding of protein and DNA)的信息。 目前已建立ChIP-chip技术。
proliferation
Stimulation
?
?
Cell
differentiation
apoptosis other changes
Mechanism?
细胞是由蛋白质和核酸为主要功能成分组成的生命复合体系， 因此，蛋白质和核酸是分子细胞生物学主要的研究对象。
主要内容： 1. RNA的提取 2. DNA的提取 3. 蛋白质的提取 4. 核酸的分析方法 5. 蛋白质的分析方法
RNA提取注意事项
一、杜绝外源酶的污染(avoid contamination of exogenous enzyme) 注意一：严格戴好口罩，手套。 注意二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽， 实验台面等要彻底处理。 注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 二、阻止内源酶的活性(inhibit activity of endogenous enzyme) 注意四：选择合适的匀浆方法。 注意五：选择合适的裂解液。 注意六：控制好样品的起始量。 三、操作尽量在冰上(on ice)进行。
integrin 1 CD44v6 -actin Control 0.5 h
1.0 h
(OPN: 1.0 g/பைடு நூலகம்l)
2.0 h
4.0 h
6.0 h
内参基因：即内部参照基因，他们在各组 织和细胞中表达相对恒定，在检测基因表 达是常用他们来作为参照物。其作用是校 正上样量，保证结果的准确性。 常用基因包括：β-actin，GAPDH，18S等。
Cell lysis Synpo interacts with 14-3-3β Collect precipitated protein
Western blot
Add Ab against Add beads to a protein bind Ab
六、蛋白质-核酸相互作用的分析方法 1.染色质免疫共沉淀(ChIP)
二、DNA的提取
DNA的提取方法包括：浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法 和水抽提法，也有试剂盒供挑选使用。 主要步骤包括：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质、多糖、 脂类以及其他不需要的核酸（RNA）等生物大分子。为了获得 完整的DNA，一般用蛋白酶K和去垢剂SDS等温和的方法破碎 细胞。
注意事项： 1. 提取过程应避免剧烈震荡(avoid acute vibration)，保证DNA 的完整性； 2.若A260nm / A280nm 接近于1.8，则说明DNA样品的纯度高； 3. 避免酶的污染。
（3）Northern 印迹杂交
Northern 杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技 术，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分 离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探 针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。
（2）实时定量PCR
在 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应 产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。实时荧光定量 PCR 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板定量分析。
扩增曲线指数增长的某一区，曲线的重复性非常好。如果在适当的区域设置 荧光检出界值（阈值，threshold），就会得到阈值与扩增曲线的交点Ct值 （循环次数）。Ct值与起始模板的对数值成反比线性关系。
（2）Southern 印迹杂交
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼 脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在 原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，再与相对应结构的 标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的 含量、大小。该方法主要用于遗传病诊断、DNA图谱分析、PCR产物分析等。
5. 免疫沉淀（immunoprecipitation ）
6. 免疫共沉淀 （co-immunoprecipitation ）
用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其 他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证 蛋白质之间相互特异性结合(confirm the binding of proteins)。
2. PCR技术
聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变 性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使 目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
（1）半定量PCR
半定量PCR（semi-quantitative PCR）与实时定量PCR（real-time quantitative PCR ）相对，是将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过评估溴 化乙锭（EB）染色条带强弱评估基因表达情况的方法。 产物扩增进入平台期后，样品产物量的对比关系不能反映样品中初始模板 的数量关系，因此不能准确定量。
Co-immunoprecipitation
qPCR or sequence
2. RNA结合蛋白免疫共沉淀
(RNA-binding protein immunoprecipitation, RIP)
RIP是研究细胞内RNA与蛋白结合(binding of protein and RNA)情况 的技术。RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip。
三、蛋白质的提取
细胞裂解：加裂解液，超声30s~1min。可用紫外分光光度计 (ultraviolet spectrophotometer) 定量。细胞裂解过程需加入蛋白酶抑 制剂。 裂解液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.OmL，10%SDS 6.0mL ，β-巯基乙醇 (beta-mercaptoethanol) 0.2mL，ddH2O 2.8mL。