酶联免疫技术-快速检测试剂盒50页PPT
合集下载
酶免测定技术ppt课件
温育：
1 4℃过夜最佳， 37℃2h较好， 2 43℃20min可造成弱“+”假“-” 3 2 水浴较温箱等空气浴均匀
洗板：
手洗效果最佳 自动洗板要注意残留液量。
显色
对HRP，显色完全需30min, 15min只达80%, 易造成弱“+”假“-”
比色：
单波长比色需设空白孔： OD=OD样品-OD空白
第二节 ELISA的技术要点
一、试剂制备 ㈠ 免疫吸附剂 ㈡ 酶标记抗原或抗体 二、反应条件的选择 ㈠ 酶标二抗浓度选择 ㈡ 包被抗原浓度的选择 三、操作标准化
一、试剂制备：
㈠ 免疫吸附剂
1. 固相载体
2. ⑴ 要求：① 吸附力强
3.
② 能保持Ag或Ab活性
4.
③ 不参与化学反应
5. ⑵ 载体性能比较
将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物例如放射性核素荧光素酶等进行标记试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后不必测定抗原抗体复合物本身而是测定复合物中的标记物这种免疫技术称为标记免疫技术标记免疫技术的分类
酶免疫测定技术
广州医学院第一附属医院检验科 廖伟娇
概述
1 标记免疫技术：将试剂抗原或试剂抗体用可以微量 检测的标记物（例如放射性核素、荧光素、酶等） 进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后， 不必测定抗原抗体复合物本身，而是测定复合物中 的标记物，这种免疫技术，称为标记免疫技术
异相法 固相酶免疫测定
液相酶免疫测定
均相法：不需分离复合物与游离标记物即可直 接测定的方法。异相法 则需分离后测定
均相酶免疫测定 ： 1.EMIT(酶扩大免疫测定技术):
位阻
2.克隆酶供体免疫测定 ：
酶
Ab 标本中Ag
《酶联免疫》课件
加样：将待测样品和标准品加入酶标板中 孵育：将酶标板放入孵育器中，设定温度和时间进行孵育 洗涤：孵育结束后，用洗涤液洗涤酶标板，去除未结合的物质 检测：加入底物，进行酶促反应，生成有色物质，通过比色法进行检测
清洗：使用洗涤液清洗酶标板，去除未结合的抗体和抗原 显色：加入显色液，使结合的抗体和抗原发生反应，产生颜色变化 观察：在特定波长下观察颜色变化，判断结果 终止：加入终止液，终止反应，防止颜色变化过快
优点：灵敏度高，特异性强，适用于多种抗原的检测。
应用：广泛应用于临床检验、科研实验等领域。
注意事项：操作过程中需要注意避免非特异性结合，影响检测结果。
原理：利用抗原-抗体特异性结合的 原理，通过酶标记的抗体与待测抗 原结合，形成抗原-抗体-酶复合物
特点：灵敏度高，特异性强，操作简 便，结果稳定
应用：广泛应用于临床检验、科研实 验等领域
局限性：需要特定的酶标记抗体，成 本较高
抗原纯化：通过离心、过滤 等方法去除杂质
抗原选择：选择合适的抗原， 如蛋白质、多肽等
抗原定量：使用酶标仪等设 备进行定量分析
抗原保存：低温保存，防止 降解和污染
抗体选择：选择特异性高、亲和力强的抗体 标记方法：常用的标记方法有生物素化、荧光素化等 标记条件：标记条件包括温度、时间、pH值等 标记效果检测：通过ELISA实验检测标记效果
微型化：酶联免疫 技术将更加微型化， 便于携带和使用
智能化：酶联免疫 技术将更加智能化 ，实现检测结果的 自动分析和处理
快速化：酶联免疫 技术将更加快速化 ，缩短检测时间， 提高检测效率
技术进步：酶联免疫技术将更加灵敏、准确、快速 应用领域：酶联免疫技术将在疾病诊断、药物研发、食品安全等领域得到更广泛的应用 技术融合：酶联免疫技术与其他技术如基因测序、生物芯片等相结合，提高检测效率和准确性 市场前景：酶联免疫技术市场将持续增长，预计未来几年市场规模将保持稳定增长
酶联免疫吸附实验ppt课件
作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
《ELISA试剂盒》课件
CHAPTER 04
ELISA试剂盒的操作步骤
实验前的准备
实验环境
确保实验室环境清洁、无尘， 并具备适当的照明和通风设施
。
实验器材
准备所需的实验器材，如移液 器、吸头、酶标板、微孔板夹 等，并进行清洗和消毒。
试剂准备
根据实验需求，准备适量的 ELISA试剂盒、样本、标准品、 洗涤液等，并确保试剂在有效 期内。
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种基于抗原-抗体反应的检测方法，通过酶标记 的抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合，再利用酶催化底物反应显色，达到检测 目的。
酶联免疫吸附试验具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，广泛应用于医学、 生物学、农业等领域。
酶标板的设计与制作
酶标板是ELISA试验中重要的实验器材，常用的酶标板有96孔、48孔和12孔等规格 。
《elisa试剂盒》PPT课 件
CONTENTS 目录
• ELISA试剂盒简介 • ELISA试剂盒的原理 • ELISA试剂盒的种类与选择 • ELISA试剂盒的操作步骤 • ELISA试剂盒的应用与注意事项
CHAPTER 01
ELISA试剂盒简介
ELISA试剂盒的定义
酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA ）是一种常用的免疫学检测方法，而 ELISA试剂盒则是根据该方法设计的一
特异性好
针对特定的目标物质设计，能够准确 区分不同物质。
ELISA试剂盒的优点与局限性
操作简便
实验操作简单，易于标准化和自动化。
VS
适用范围广
可用于不同类型样本的检测，如血清、尿 液、细胞培养液等。
ELISA试剂盒的优点与局限性
《酶联免疫分析法》课件
酶联免疫分析法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
酶联免疫分析法广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
分类：直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等 应用：临床诊断、药物研发、食品安全检测、环境监测等领域 优点：灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等 局限性：存在假阳性和假阴性结果，需要标准化操作和严格的质量控制
汇报人：PPT
PPT,a click to unlimited possibilities
汇报人：PPT
CONTENTS
PART ONE
PART TWO
酶联免疫分析法（ELISA）是一种免疫学检测方法，用于检测样品中的抗原或抗体。
原理：利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶催化底物产生颜色反应，从而定量或定性检测样品中的抗原或 抗体。
优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作简便 缺点：成本较高，需要专业人员操作，容易受到环境因素影响
PART THREE
抗原选择：选择合适的抗原，如蛋 白质、多肽等
抗原标记：将抗原与酶或荧光素等 标记物结合
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
抗原纯化：通过离心、层析等方法 纯化抗原
抗原保存：将标记好的抗原保存在 适当的条件下，如低温、避光等
检测水中有机污染物：如农药、多 环芳烃等
检测土壤中的污染物：如重金属、 有机氯农药等
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
检测空气中的污染物：如二氧化硫、 氮氧化物等
检测生物体内的污染物：如农药残 留、重金属等
蛋白质定量分析：通过酶联免疫分析法检测蛋白质的浓度 抗体检测：通过酶联免疫分析法检测抗体的存在和浓度 细胞因子检测：通过酶联免疫分析法检测细胞因子的存在和浓度 基因表达分析：通过酶联免疫分析法检测基因的表达水平和调控机制
酶联免疫分析法广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
分类：直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等 应用：临床诊断、药物研发、食品安全检测、环境监测等领域 优点：灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等 局限性：存在假阳性和假阴性结果，需要标准化操作和严格的质量控制
汇报人：PPT
PPT,a click to unlimited possibilities
汇报人：PPT
CONTENTS
PART ONE
PART TWO
酶联免疫分析法（ELISA）是一种免疫学检测方法，用于检测样品中的抗原或抗体。
原理：利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶催化底物产生颜色反应，从而定量或定性检测样品中的抗原或 抗体。
优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作简便 缺点：成本较高，需要专业人员操作，容易受到环境因素影响
PART THREE
抗原选择：选择合适的抗原，如蛋 白质、多肽等
抗原标记：将抗原与酶或荧光素等 标记物结合
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
抗原纯化：通过离心、层析等方法 纯化抗原
抗原保存：将标记好的抗原保存在 适当的条件下，如低温、避光等
检测水中有机污染物：如农药、多 环芳烃等
检测土壤中的污染物：如重金属、 有机氯农药等
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
检测空气中的污染物：如二氧化硫、 氮氧化物等
检测生物体内的污染物：如农药残 留、重金属等
蛋白质定量分析：通过酶联免疫分析法检测蛋白质的浓度 抗体检测：通过酶联免疫分析法检测抗体的存在和浓度 细胞因子检测：通过酶联免疫分析法检测细胞因子的存在和浓度 基因表达分析：通过酶联免疫分析法检测基因的表达水平和调控机制
酶联免疫吸附试验(ELISA)PPT课件
6. 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓
度按加量及比色液的最终体积而异，在板 式ELISAБайду номын сангаас一般采用2mol/L。
7.参考标准品 定量测定的ELISA试剂盒应含有制作
标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可 检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋 白保护剂及防腐剂的缓冲液中。
ELISA测定方法
前两种方法主要用于测定抗体和大分子 抗原，适用于临床诊断上，而竞争法事测 定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食 品分析。
ELIZA 方法图示
间接法
“Indirect” ELISA
1.The steps of "indirect" ELISA follows the mechanism below: A buffered solution of the protein antigen to be tested for is added to each well of a microtiter plate, where it is given time to
5. 洗涤液 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性
缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是 疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团 ，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的 疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质 与固相载体的结合，并借助于亲水基团和 水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶 液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的 非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可 在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使 包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低 试验的灵敏度。
ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971 年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过 程简单易行并可以定量，从而使其在食品安 全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市 场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品 中抗生素检测的试剂盒产品。
酶联免疫吸附测定 ppt课件
β- Ｄ－半乳糖苷 甲 基 伞 酮 基 半 乳 糖 苷 (4MuG) 荧 光 360,450 硝基酚半乳糖苷(ONPG) 酶 黄色 420
ppt课件 22
结果的判定
肉眼判定结果： 于白色背景上直接肉眼观察。颜色越
深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。根据 颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。
测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长
对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照） 倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高 浓度方向进行 终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准
2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢
将加样枪调到最大量程（见加样枪顶部数字）
将所有剩余液体倒入水池，所有塑料制品开盖回 收到讲台
ppt课件 26
ELISA在医学中的应用
临床疾病诊断中的应用
ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒
ELISA法筛查α-地中海贫血 ELISA法定量检测乙肝抗原两对半
……
ppt课件 18
基础医学领域的应用 ----ELISA试剂盒商业资讯
ppt课件
19
ELISA在其他相关领域中的应用
食品安全
法医物证
……
环境卫生
ppt课件 20
ppt课件 3
同位素131I标记抗体指示小鼠肿瘤
ppt课件
4
免
疫
荧 光 技 术 用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
ppt课件 5
课程内容
ELISA的原理 ELISA的分类
间接ELISA的具体操作
ELISA在医学中的应用实例
ppt课件
6
ELISA的原理
elisa检测技术 ppt课件
生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅 酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度 亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此，本方法 具有信号放大功能（特点）。
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上 读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上 读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O