酶免疫测定技术PPT课件
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第八章酶免疫技术
cloned enzyme donor immunoassay
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
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2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶联免疫吸附实验ppt课件
作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
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第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
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工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
酶免测定技术ppt课件
Ap不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色
ß-半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-ß-半乳糖苷：荧光
4. 酶结合物的制备： ⑴ 戊二醛交联法 ⑵ 过碘酸盐氧化法
二、反应条件的选择 1. 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标
二抗，取OD=0.8度、时间等
包被缓冲液、包被方法 ⑵ 封闭：包被后在用1~5%小牛血清白蛋白再包
被，以消除非特异吸附的干扰。
㈡ 酶结合物：
1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性 强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。
2. ELISA常用酶：HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 酶的底物：
HRP可溶性底物及呈色：
邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm)
荧光素 酶标记 等等 ⑵按检测对象分类：免疫组织化学技术
免疫测定技术
酶免疫测定技术
概述：
1.酶免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂 抗体用酶进行标记，试剂与标本中相应的抗 体或抗原反应后，测定复合物中的酶，这种 免疫技术，称为酶标记免疫技术。
2.分类：酶免疫组化 酶免疫测定 均相法
异相法 固相酶免疫测定
4. 三、操作标准化 5. 1 加样 6. 2 保温 7. 3 洗涤 8. 4 比色 9.
四、影响ELISA测定的因素：
1 试剂盒因素 2 实验操作中的影响
试剂盒因素：
A 固相材料：孔间不均 B 抗原或抗体：纯化(天然但干扰多)、合成
(多肽分子较小，常有空间位阻)和基因抗 原(与片段的选择和制备水平有关) C 酶结合物 D 色原底物：OPD:致Ca，不稳定(避光)
双波长比色不需设空白： OD=OD450nm-OD630nm
ß-半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-ß-半乳糖苷：荧光
4. 酶结合物的制备： ⑴ 戊二醛交联法 ⑵ 过碘酸盐氧化法
二、反应条件的选择 1. 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标
二抗，取OD=0.8度、时间等
包被缓冲液、包被方法 ⑵ 封闭：包被后在用1~5%小牛血清白蛋白再包
被，以消除非特异吸附的干扰。
㈡ 酶结合物：
1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性 强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。
2. ELISA常用酶：HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 酶的底物：
HRP可溶性底物及呈色：
邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm)
荧光素 酶标记 等等 ⑵按检测对象分类：免疫组织化学技术
免疫测定技术
酶免疫测定技术
概述：
1.酶免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂 抗体用酶进行标记，试剂与标本中相应的抗 体或抗原反应后，测定复合物中的酶，这种 免疫技术，称为酶标记免疫技术。
2.分类：酶免疫组化 酶免疫测定 均相法
异相法 固相酶免疫测定
4. 三、操作标准化 5. 1 加样 6. 2 保温 7. 3 洗涤 8. 4 比色 9.
四、影响ELISA测定的因素：
1 试剂盒因素 2 实验操作中的影响
试剂盒因素：
A 固相材料：孔间不均 B 抗原或抗体：纯化(天然但干扰多)、合成
(多肽分子较小，常有空间位阻)和基因抗 原(与片段的选择和制备水平有关) C 酶结合物 D 色原底物：OPD:致Ca，不稳定(避光)
双波长比色不需设空白： OD=OD450nm-OD630nm
免疫学检验中的酶免疫技术
免疫学检验中的酶免疫技术20世纪中期，以放射免疫技术为代表的标记免疫技术相继问世，它将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，以检测标记物的有无及含量间接反映被测物的存在与多少。
这些将标记技术与抗原抗体反应结合起来的免疫学检测技术以其敏感性高、准确性好、操作简便、易于商品化和自动化等特点逐渐替代了凝集、沉淀等经典的免疫学检验技术，不仅用于抗原、抗体、补体、免疫细胞、细胞因子等免疫相关物质的检测，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等体液中各种微量物质的检查，可以说一切具有抗原性或半抗原性的物质原则上均可利用现代免疫检验技术进行检测，使免疫学检验渗透到医学的各个领域。
目前，免疫学检验中的标记技术主要包括酶免疫技术、荧光免疫技术、放射免疫技术、金免疫技术、化学发光免疫技术等。
其中酶免疫技术是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。
作为经典的三大标记技术之一，酶免疫技术在检验医学中得到广泛应用并不断得到更新。
一、常用的酶及显色底物在酶免疫技术中用于标记的酶应具有催化活性高、催化专一性强；与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物产生的信号产物易于观察和检测；对人无害且价廉、易得等特点，目前常用的酶及底物见表1。
表1 常用酶及底二、标记物的制备在酶免疫技术中制备标记物的抗原应纯度高、抗原性完整；制备标记物的抗体应特异性好、效价高、亲和力强、比活性高、能批量生产和易于分离纯化。
制备酶标记物的方法应符合简单、产量高；避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物；标记反应不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则。
标记物制备的方法基本属于两类：（一）交联法交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为：酶-戊二醛-抗体（抗原）（二）直接法直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法。
酶的免疫化学测定(精)
用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同 工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。巨分子 酶形成的原因主要有： ① 酶与免疫球蛋白形成的复合物，如 CK—BB-IgG、 CK-MM-IgA、LD-IgA等； ② 酶与其他蛋白质形成的复合物，如LD-β-脂蛋 白；③ 酶亚基或酶分子之间形成的聚合物，如CK—Mt 聚合物、LD亚基自身聚合等。 如患者临床症状不明显，血清酶活性不正常，同工 酶图谱异常时要特别警惕血清中有无巨分子酶，以免造 成对酶测定结果的错误判断和临床误诊。
酶的免疫化学测定也有其局限性。主要有：
①要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免 疫化学性质的抗血清常常是很困难的，而且 工作量很大； ②测定步骤多，操作繁琐； ③测定成本高。
第六节
同工酶及其亚型测定
一、概
念
同工酶 是同一种属中由不同基因或等位基因所
编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的 催化功能，但其分子组成、空间构象、理化性质、 生物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类 酶。 亚型 某些酶或同工酶从组织进入体液后，可进 一步变化为数个不同类型即所谓“亚型，也称为同 工型(isoform)”。即指基因在编码过程中由于翻译 后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶。亚型往 往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作用 降解而形成。
与传统的酶活性测定法相比，免疫化 学测定法的优点主要有： ①灵敏度高，能测定其他方法不易测 出的少量或痕量酶； ②特异性高，不受体液中其他物质， 如酶抑制剂、激活剂等的影响； ③能用于一些不表现酶活性的酶蛋白， 如各种酶原或去辅基酶蛋白，或因遗传变 异而导致合成无活性的酶蛋白的酶测定； ④特别适用于同工酶的测定。
(二)免疫化学测定的优缺点
血清酶活性变化分为酶蛋白质量和酶活 性同步变化及酶蛋白质量未变而酶活性变化 两种情况。酶在一些病理条件下或受操作条 件等影响而失活，一些激活剂或抑制剂对酶 活性也有影响，因而酶活性常不能正确反映 酶的情况，出现酶活性与酶蛋白绝对量不一 致，有时甚至出现两者变化完全相反的情况。
《酶联免疫分析法》课件
酶联免疫分析法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
酶联免疫分析法广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
分类：直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等 应用：临床诊断、药物研发、食品安全检测、环境监测等领域 优点：灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等 局限性：存在假阳性和假阴性结果，需要标准化操作和严格的质量控制
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CONTENTS
PART ONE
PART TWO
酶联免疫分析法（ELISA）是一种免疫学检测方法，用于检测样品中的抗原或抗体。
原理：利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶催化底物产生颜色反应，从而定量或定性检测样品中的抗原或 抗体。
优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作简便 缺点：成本较高，需要专业人员操作，容易受到环境因素影响
PART THREE
抗原选择：选择合适的抗原，如蛋 白质、多肽等
抗原标记：将抗原与酶或荧光素等 标记物结合
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
抗原纯化：通过离心、层析等方法 纯化抗原
抗原保存：将标记好的抗原保存在 适当的条件下，如低温、避光等
检测水中有机污染物：如农药、多 环芳烃等
检测土壤中的污染物：如重金属、 有机氯农药等
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
检测空气中的污染物：如二氧化硫、 氮氧化物等
检测生物体内的污染物：如农药残 留、重金属等
蛋白质定量分析：通过酶联免疫分析法检测蛋白质的浓度 抗体检测：通过酶联免疫分析法检测抗体的存在和浓度 细胞因子检测：通过酶联免疫分析法检测细胞因子的存在和浓度 基因表达分析：通过酶联免疫分析法检测基因的表达水平和调控机制
酶联免疫分析法广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
分类：直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等 应用：临床诊断、药物研发、食品安全检测、环境监测等领域 优点：灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等 局限性：存在假阳性和假阴性结果，需要标准化操作和严格的质量控制
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CONTENTS
PART ONE
PART TWO
酶联免疫分析法（ELISA）是一种免疫学检测方法，用于检测样品中的抗原或抗体。
原理：利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶催化底物产生颜色反应，从而定量或定性检测样品中的抗原或 抗体。
优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作简便 缺点：成本较高，需要专业人员操作，容易受到环境因素影响
PART THREE
抗原选择：选择合适的抗原，如蛋 白质、多肽等
抗原标记：将抗原与酶或荧光素等 标记物结合
添加标题
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抗原纯化：通过离心、层析等方法 纯化抗原
抗原保存：将标记好的抗原保存在 适当的条件下，如低温、避光等
检测水中有机污染物：如农药、多 环芳烃等
检测土壤中的污染物：如重金属、 有机氯农药等
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检测空气中的污染物：如二氧化硫、 氮氧化物等
检测生物体内的污染物：如农药残 留、重金属等
蛋白质定量分析：通过酶联免疫分析法检测蛋白质的浓度 抗体检测：通过酶联免疫分析法检测抗体的存在和浓度 细胞因子检测：通过酶联免疫分析法检测细胞因子的存在和浓度 基因表达分析：通过酶联免疫分析法检测基因的表达水平和调控机制
《酶免疫技术》PPT课件
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计 测 量。
精品医学
13
二、酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分
酶结合物 （conjugate）
酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的
结合物
精品医学
14
酶标记抗体或抗原
制备方法要求
➢抗原要求纯度高，抗原性完整
➢抗体需要特异性好、效价高、亲 合力强以及比活性较高，能批量生 产，易纯化。
精品医学
7
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比
精品医学
ELISA中应用最为广 泛的标记用酶
8
酶和酶作用底物
抗原和酶标抗原
或抗体
洗涤
3
使结合在固相上
的抗原抗体复合物
与未结合的分离
4 底物显色
定性或定量的分析
精品医学
31
二、方法类型及反应原理
三个必要试剂
固相的抗原或抗体
酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
精品医学
32
ELISA检测抗原的方法
双抗体夹心法
➢ 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶
标抗体，加底物显色
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
+
捕获法精原品医理学
EE E
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
elisa检测技术 ppt课件
生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅 酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度 亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此，本方法 具有信号放大功能（特点）。
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上 读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上 读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
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ELISA原则上用于检测抗原、抗体及半抗原，在实际应用 中可作疾病临床诊断与监察、食品中有害成分残留的测定、 与基因工程合并使用等，为保障人类健康发挥着巨大的医 学与遗传学作用。
20
医学临床中的应用
医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提 供了特异性，敏感性强的试验基础。
9
双抗体夹心法
此法常用于测定抗原，适用于多价大分 子抗原的检测，而不能用于测定半抗原 等小分子物质。
10
异相酶免疫测定类型
根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法
11
间接法
此法是测定抗体最常用的方法。
12
异相酶免疫测定类型
根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法
5
均相酶免疫测定
测定快速、准确、专一、灵敏 试剂稳定 操作过程简便 数据处理简单
6
酶免疫增强测定技术EMIT
酶免疫测定技术
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫分析CEDIA 液相酶免疫测定
异相酶免疫测定
固相酶免疫测定 ELISA
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酶免疫增强技术EMIT
8
异相酶免疫测定类型
根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法
13
竟争法
此法可用于抗原和半抗原的定量测定， 也可用于测定抗体。
14
异相酶免疫测定类型
根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法
15
捕获法
此法用于血清中某种抗体亚型成分测定。以 IgM测定为例：
抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体
样本 （IgM1、2）
E M IT 方法快速灵敏、准确、专一, 适合临 床上常规检验。药物滥用、药物中毒(包括 误服与有意识服毒) , 吸毒酗酒、麻醉药成 瘾，安眠药成瘾较严重, 此外还有众多的精 神病患者, 因此各种类型的药物中毒是比较 多的。除了医疗工作需要进行治疗药物监 测之外, 在急症及中毒治疗方面也要了解与 掌握体内药物或毒物的品种和浓度。本方 法能够适应上述的需要, 除用于血药浓度测 定之外, 还有药物滥用与药物中毒的检测。
ELISA广泛应用于内分泌、血液、肿瘤、传染病、免疫化学等方面， 例如：用于检测雌性激素、胰岛素等，检查凝血因子、红细胞抗原等； 用于检查甲胎蛋白，其敏感性已达到放射免疫试验相当的水平。
ELISA在抗体检测中优势突出，尤其对病毒检测明显优于常规检测方 法。例如：对流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒、狂犬病毒和脊髓灰 质炎病毒等的检测。同时用作自身免疫病抗体测定以及对过敏的诊断， 例如检测过敏原的抗体。
18
一、治疗药物监测一药物血浓度测定 有地高辛、奎尼丁、利多卡因、双异丙、普鲁卡因酞胺、
N 一乙酞普鲁卡因酞胺(前者的有活性代谢物)、庆大霉素、 妥布霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、氨甲喋吟等。 二、药物滥用的尿检验— 半定量分析 有苯丙胺、巴比妥类、苯甲二氮草类、大麻类、可卡因、 乙醇、美沙酮、安眠酮、阿片类 、丙氧吩等。半定量分 析是以阴性、低、中等三种浓度的标准品为三点制作一条 标准曲线, 测定样品的光吸收值变化率与标准曲线比较, 可以计算样本中存在的药物与代谢物总量。 三、血清三环类抗抑郁药的定性分析 阿米替林、去甲替林、丙咪啧、去甲丙咪嗦、氯丙咪嗦、 三甲丙咪嗓、多虑平、普鲁替林等及其4 种代谢物。 定性分析是应用一个一定浓度的标准品作对照, 如样品的 光吸收值变化率超过标准品, 即为阳性;否则算作阴性。据 此可作快速毒物鉴定。 四、血清巴比妥类及苯甲二氮草类的半定量分析 7 种巴比妥类及13 种苯甲二氮草类药物的半定量分析。 测定方法亦系以阴性、低、中等三种浓度的标准品作对照19 比较, 以测算样本中存在的药物量。
酶免疫测定技 术
1
何为酶免疫测定？
enzyme immunoassay,EIA
抗原抗体反应的特异性
+酶催化反Fra bibliotek的高效性2
酶免疫增强测定技术EMIT
酶免疫测定技术
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫分析CEDIA 液相酶免疫测定
异相酶免疫测定
固相酶免疫测定 ELISA
3
酶免疫增强技术EMIT
4
克隆酶供体免疫分析CEDIA
抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体
IgM1 IgM2
特异抗原（Ag1）
抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体
IgM1 Ag1 Ab1*E
IgM2
Ab1*E
抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体
IgM1 Ag1
IgM2
16
酶免疫测定技术的应用
均相法 ELISA法
17
均相酶免疫测定主要应用于小分子激素和半 抗原（如药物）的测定。
ELISA法
酶 联 免 疫 吸 附 法（ ELISA）是1971 年由Engvall 等建立的一种生物活性物质微量测定新技术，以其灵敏度 高，特异性好等优点，在生命科学各领域得到广泛应用， 它已迈出医药、临床领域，步入农业、渔业、畜牧业和食 品加工业。
常规的 ELISA 测定法有：间接法、双抗体夹心法和抗原 竞争法。在实际应用过程中，该技术常不断改进，形成了 多种分析方法，并且在检测的灵敏度、特异性、操作简单 化以及实时、高效等方面都有很大提高，可以说ELISA 是 当前应用最广、发展最快的一项微量测定技术。
乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的 抗原或抗体，一直受到高度重视。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检 测方法， 绝大多数都是ELISA 法。80％ 原发性肝细胞癌患者的， 血清甲胎蛋白（AFP）含量增高。临床借助对AFP的检测作为对原发 性肝细胞癌的辅助诊断。
HIV 抗体初筛：抗体测定必须区分初筛和确认两个步骤, 目前常用的 初筛实验方法为第3 代ELISA试剂, 其敏感性和特异性均可达99%以 上。现已发展到抗原加抗体联合检测第四代试剂, 包被和标记的分别 是HIV1/2 O 抗原和HIV- l P 2 4 抗原的单克隆抗体, 可同时检测 HIV抗原和抗体, 检出时间提前大约七天。
21
梅毒的早期诊断：检测梅毒螺旋体IgM抗体（Tp－IgM）在早期梅毒诊断中有 重要的意义。采用ELISA法，进行血清/ 脑脊液的梅毒螺旋体IgM抗体的检测。 在献血员中梅毒螺旋体抗体的筛查中也常用此法，有利于控制和减少梅毒的 输血传播。
20
医学临床中的应用
医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提 供了特异性，敏感性强的试验基础。
9
双抗体夹心法
此法常用于测定抗原，适用于多价大分 子抗原的检测，而不能用于测定半抗原 等小分子物质。
10
异相酶免疫测定类型
根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法
11
间接法
此法是测定抗体最常用的方法。
12
异相酶免疫测定类型
根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法
5
均相酶免疫测定
测定快速、准确、专一、灵敏 试剂稳定 操作过程简便 数据处理简单
6
酶免疫增强测定技术EMIT
酶免疫测定技术
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫分析CEDIA 液相酶免疫测定
异相酶免疫测定
固相酶免疫测定 ELISA
7
酶免疫增强技术EMIT
8
异相酶免疫测定类型
根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法
13
竟争法
此法可用于抗原和半抗原的定量测定， 也可用于测定抗体。
14
异相酶免疫测定类型
根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法
15
捕获法
此法用于血清中某种抗体亚型成分测定。以 IgM测定为例：
抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体
样本 （IgM1、2）
E M IT 方法快速灵敏、准确、专一, 适合临 床上常规检验。药物滥用、药物中毒(包括 误服与有意识服毒) , 吸毒酗酒、麻醉药成 瘾，安眠药成瘾较严重, 此外还有众多的精 神病患者, 因此各种类型的药物中毒是比较 多的。除了医疗工作需要进行治疗药物监 测之外, 在急症及中毒治疗方面也要了解与 掌握体内药物或毒物的品种和浓度。本方 法能够适应上述的需要, 除用于血药浓度测 定之外, 还有药物滥用与药物中毒的检测。
ELISA广泛应用于内分泌、血液、肿瘤、传染病、免疫化学等方面， 例如：用于检测雌性激素、胰岛素等，检查凝血因子、红细胞抗原等； 用于检查甲胎蛋白，其敏感性已达到放射免疫试验相当的水平。
ELISA在抗体检测中优势突出，尤其对病毒检测明显优于常规检测方 法。例如：对流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒、狂犬病毒和脊髓灰 质炎病毒等的检测。同时用作自身免疫病抗体测定以及对过敏的诊断， 例如检测过敏原的抗体。
18
一、治疗药物监测一药物血浓度测定 有地高辛、奎尼丁、利多卡因、双异丙、普鲁卡因酞胺、
N 一乙酞普鲁卡因酞胺(前者的有活性代谢物)、庆大霉素、 妥布霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、氨甲喋吟等。 二、药物滥用的尿检验— 半定量分析 有苯丙胺、巴比妥类、苯甲二氮草类、大麻类、可卡因、 乙醇、美沙酮、安眠酮、阿片类 、丙氧吩等。半定量分 析是以阴性、低、中等三种浓度的标准品为三点制作一条 标准曲线, 测定样品的光吸收值变化率与标准曲线比较, 可以计算样本中存在的药物与代谢物总量。 三、血清三环类抗抑郁药的定性分析 阿米替林、去甲替林、丙咪啧、去甲丙咪嗦、氯丙咪嗦、 三甲丙咪嗓、多虑平、普鲁替林等及其4 种代谢物。 定性分析是应用一个一定浓度的标准品作对照, 如样品的 光吸收值变化率超过标准品, 即为阳性;否则算作阴性。据 此可作快速毒物鉴定。 四、血清巴比妥类及苯甲二氮草类的半定量分析 7 种巴比妥类及13 种苯甲二氮草类药物的半定量分析。 测定方法亦系以阴性、低、中等三种浓度的标准品作对照19 比较, 以测算样本中存在的药物量。
酶免疫测定技 术
1
何为酶免疫测定？
enzyme immunoassay,EIA
抗原抗体反应的特异性
+酶催化反Fra bibliotek的高效性2
酶免疫增强测定技术EMIT
酶免疫测定技术
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫分析CEDIA 液相酶免疫测定
异相酶免疫测定
固相酶免疫测定 ELISA
3
酶免疫增强技术EMIT
4
克隆酶供体免疫分析CEDIA
抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体
IgM1 IgM2
特异抗原（Ag1）
抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体
IgM1 Ag1 Ab1*E
IgM2
Ab1*E
抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体
IgM1 Ag1
IgM2
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酶免疫测定技术的应用
均相法 ELISA法
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均相酶免疫测定主要应用于小分子激素和半 抗原（如药物）的测定。
ELISA法
酶 联 免 疫 吸 附 法（ ELISA）是1971 年由Engvall 等建立的一种生物活性物质微量测定新技术，以其灵敏度 高，特异性好等优点，在生命科学各领域得到广泛应用， 它已迈出医药、临床领域，步入农业、渔业、畜牧业和食 品加工业。
常规的 ELISA 测定法有：间接法、双抗体夹心法和抗原 竞争法。在实际应用过程中，该技术常不断改进，形成了 多种分析方法，并且在检测的灵敏度、特异性、操作简单 化以及实时、高效等方面都有很大提高，可以说ELISA 是 当前应用最广、发展最快的一项微量测定技术。
乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的 抗原或抗体，一直受到高度重视。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检 测方法， 绝大多数都是ELISA 法。80％ 原发性肝细胞癌患者的， 血清甲胎蛋白（AFP）含量增高。临床借助对AFP的检测作为对原发 性肝细胞癌的辅助诊断。
HIV 抗体初筛：抗体测定必须区分初筛和确认两个步骤, 目前常用的 初筛实验方法为第3 代ELISA试剂, 其敏感性和特异性均可达99%以 上。现已发展到抗原加抗体联合检测第四代试剂, 包被和标记的分别 是HIV1/2 O 抗原和HIV- l P 2 4 抗原的单克隆抗体, 可同时检测 HIV抗原和抗体, 检出时间提前大约七天。
21
梅毒的早期诊断：检测梅毒螺旋体IgM抗体（Tp－IgM）在早期梅毒诊断中有 重要的意义。采用ELISA法，进行血清/ 脑脊液的梅毒螺旋体IgM抗体的检测。 在献血员中梅毒螺旋体抗体的筛查中也常用此法，有利于控制和减少梅毒的 输血传播。