最新免疫酶组织化学技术
酶免疫组织化学技术的操作程序
酶免疫组织化学技术的操作程序一、取样和固定1. 从动物或人体组织中取得所需样本，并尽快进行处理，以避免样本的降解。
2. 将样本放入适当的缓冲液中进行固定。
常用的固定液包括4%的中性缓冲甲醛和70%的乙醇。
固定时间视样本大小和类型而定，通常为24小时。
二、包埋和切片1. 固定后，将样本从固定液中取出，进行脱水。
脱水过程中，需逐渐用浓度递增的乙醇替换固定液，使组织逐渐脱水。
2. 在脱水完成后，将样本置于透明剂（如苯胶）中浸泡，使其透明化。
3. 将透明化后的样本置于熔蜡中，使其浸透于蜡中。
4. 将浸透于蜡中的样本置于组织芯片中，使其与蜡块紧密结合。
5. 利用组织切片机将蜡块切割成薄片，厚度通常为3-5微米。
三、抗原修复和抗体染色1. 将蜡块上的切片放在载玻片上，并进行抗原修复。
抗原修复可以通过热解蜡或酶解蜡来完成。
2. 在抗原修复完成后，使用PBS（磷酸缓冲盐溶液）或TBST（三丁基甲酸盐缓冲盐溶液）进行洗涤，去除残留的蜡块和其他污染物。
3. 在洗涤完成后，将抗体溶液加到载玻片上，与待测蛋白质发生特异性反应。
抗体可以是一种单克隆抗体或多克隆抗体。
4. 将载玻片置于湿润箱中，保持恒定的温度和湿度，进行抗体与待测蛋白质的结合反应。
反应时间视抗体和待测蛋白质的特异性而定，通常为1-2小时。
四、酶标记和显色1. 在抗体与待测蛋白质的结合反应完成后，进行洗涤，去除未结合的抗体。
2. 加入酶标记的二抗或多抗，与第一次结合的抗体发生反应。
常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
3. 经过二次抗体的结合反应后，进行洗涤，去除未结合的二抗。
4. 加入显色底物，使酶标记物发生显色反应。
常用的显色底物有DAB（二氨基联苯胺）和BCIP/NBT（硝基蓝四唑/硝基蓝硝酮）。
五、结果分析和观察1. 经过显色反应后，用清水冲洗载玻片，停止显色反应。
2. 将载玻片进行脱水，并用透明剂进行封片。
3. 使用显微镜观察载玻片下的切片，观察待测蛋白质的表达情况和定位。
免疫酶技术的原理及应用
免疫酶技术的原理及应用1. 什么是免疫酶技术？免疫酶技术是一种利用抗体-抗原相互作用进行生物分析的方法。
它通过利用抗体与特定抗原结合的高度特异性，将酶标记的抗体用于检测和定量目标分子，广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域。
2. 免疫酶技术的原理免疫酶技术的原理是基于抗原与抗体之间的高度特异性结合。
一般来说，免疫酶技术包括以下几个步骤：2.1 抗原的制备首先，需要获得目标分子的抗原。
抗原可以是蛋白质、多肽、病毒、细胞表面蛋白等。
通常，抗原会被纯化并加工成适合免疫动物生产抗体的形式。
2.2 抗体的制备接下来，需要制备与目标分子结合的特异性抗体。
通常，抗原会被免疫动物（如兔子、小鼠等）注射，形成抗体。
2.3 酶标记的抗体制备为了便于检测和定量目标分子，可以将酶标记与抗体结合，形成酶标记的抗体。
常用的酶标记包括辣根过氧化酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
2.4 抗原-抗体结合反应将样品中的目标分子与酶标记的抗体一起孵育，使抗原与抗体发生特异性结合。
这样，目标分子就被标记上了酶，成为可检测的复合物。
2.5 酶的作用和检测添加适当的底物和辅助试剂后，酶会催化底物的反应，产生可测量的信号。
常见的底物有TMB（3，3′，5，5′-四甲基苯基二氨基甲烷）、BCIP（溴硝基硼邻萘酚磷酸盐）等。
3. 免疫酶技术的应用免疫酶技术在医学、生物学和生物化学等领域有广泛的应用。
以下是免疫酶技术的一些常见应用：3.1 免疫诊断免疫酶技术在临床诊断中被广泛应用。
例如，ELISA（酶联免疫吸附测定法）通过检测血清中特定抗原或抗体的浓度，可以用于诊断疾病，如各类感染病、自身免疫性疾病等。
3.2 蛋白质检测和定量免疫酶技术可以用于检测和定量蛋白质。
例如，Western blotting可以检测特定蛋白质在混合蛋白中的表达情况，通过与标准曲线比较，可以定量目标蛋白的含量。
3.3 免疫组织化学免疫组织化学是一种在组织切片上检测特定蛋白质表达的方法。
7.免疫组化免疫酶相关知识点
葡萄糖氧化酶（Glucose osidase,GO) B-D-半乳糖苷酶(B-D-Galactosidase)
乙酰胆碱脂酶(Acetylcholine esterase)
苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase)
葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase) 溶菌酶(Lysozyme) 6－磷酸葡萄糖脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 酶标抗体的制备
Method）
• 一抗与第三抗必须来源于同一种属动物
• 二抗必须过量
非标记免疫酶法
APAAP法（Alkaline Phosphatase 优点
Antialkaline
Phosphatase
Method）
• ALP免疫组化染色，不受内源性过氧化物酶干扰，处理内源性ALP较易
• 红色易与色素颗粒区别（用坚牢红时）
免疫酶标法（酶标抗体法） 用偶联剂将酶与抗体结合，形成酶标抗体
• 直接法和间接法
非标记免疫酶法 不用偶联剂制备抗体，而用免疫方法制备抗酶抗体，而通过中间抗体连接
• 酶桥法 • 酶免疫复合物法（PAP法，APAAP法）
免疫酶标法
直接法 原理
• 将酶（HRP、AP、GO）标记在特异性抗体上形成酶标抗体 • 酶标抗体直接与相应抗原结合形成抗原－抗体－ＨＲＰ复合物 • 用酶底物显色：如HRP底物，DAB-H2O2过氧化物酶催化H2O2分解，使联苯胺氧化，形成联苯亚（受氢体，底物）来自 DAB-H2＋H2O2
（供氢体,生色原）
DAB+２H2O HRP 棕色沉淀
常用标记酶及其底物的呈色反应
辣根过氧化物酶（HRP）
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
说明免疫组织化学技术检测组织和细胞内蛋白质抗原的关键技术
说明免疫组织化学技术检测组织和细胞内蛋白质抗原
的关键技术
免疫组织化学技术是一种基于免疫学原理的实验技术，适用于检测组织和细胞内蛋白质抗原。
其关键技术包括以下几个方面：
1. 抗原表位的选择：选择合适的抗原表位对于正确识别目标抗原至关重要，通常需要根据已知的抗原序列设计合适的抗原表位。
2. 抗原修复处理：组织标本或细胞病理部分常常因为常规处理方式而导致抗原失活、免疫组织化学染色效果受阻，因此，要使用抗原修复处理方法，如热解或酶解等，来恢复抗原的免疫原性。
3. 抗原特异性抗体的使用：使用特异性抗体与目标抗原发生特异性结合，通常用于检测和定位特定的抗原。
4. 免疫组化染色：将标本与特异性抗体反应后，通过适当的染色方法，如荧光染色、酶染色或放射性标记等方法，来进行成像和信号检测。
5. 图像分析和数据处理：通过数字化成像技术和计算机软件处理技术，对免疫组织化学染色的图像数据进行定量分析和计算，以实现更精确的数据表达和研究结果。
酶免疫组织化学染色技术 -回复
酶免疫组织化学染色技术-回复酶免疫组织化学染色技术（Enzyme ImmunoHistoChemistry, E-IHC）是一种常用于组织学研究和病理诊断的方法。
该技术基于免疫学原理，采用酶标标记抗体和细胞色素底物，通过酶的催化作用来检测组织中特定抗原的分布和表达水平。
本文将一步一步回答与酶免疫组织化学染色技术相关的问题。
第一步：样本处理样本处理是酶免疫组织化学染色技术的重要步骤，它的目的是保持组织结构和细胞膜完整性，同时保留目标抗原的免疫原性。
1. 固定化：将组织样本进行固定化处理有助于保持细胞和组织的形态学结构。
最常用的固定剂包括甲醛和乙醇。
甲醛能够形成甲醛-蛋白质交联，从而固定并保持组织中的抗原。
乙醇可以用于去除水分和酮糖，提高抗体的渗透性。
2. 残胶和抗原修复：许多抗原在标本固定过程中会损失其免疫原性，需要进行抗原修复。
常用的修复方法包括热处理、酶消化和酸碱处理等。
热处理通常使用高温蒸煮或压力加热，可使蛋白质水平解离，恢复抗原性。
酸碱处理则通过改变组织的PH值，使抗原解离。
第二步：抗体选择抗体是酶免疫组织化学染色技术的核心。
选择合适的抗体对于获得可靠的结果至关重要。
1. 一抗和二抗：酶免疫组织化学染色一般采用间接法。
首先，使用一抗与目标抗原特异性结合。
随后，使用标记有酶的二抗来识别和结合一抗，从而可视化目标抗原。
常用的二抗有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
2. 选择合适的抗体：选择抗体需要考虑目标抗原的特异性和抗体的亲和性。
在选择抗体时，可以参考文献报道、试剂公司提供的抗体说明书和其他研究人员的建议。
第三步：酶标标记酶标标记是酶免疫组织化学染色技术的另一个关键步骤。
酶标标记抗体在靶抗原区域内催化底物，从而产生特定的染色反应。
1. 酶标物质的选择：常用的酶标物质有HRP和AP。
HRPHRP常用于DAB法（diaminobenzidine）和AEC法（aminoethyl carbazole）等反应体系中，可产生棕色至棕黑色反应。
免疫组织化学检验技术—酶免疫组织化学检验技术(免疫学检验课件)
（二）技术类型 1.直接法
形成抗原一抗体一酶复合物 2.间接法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物 3.酶标抗体三步染色法 为间接法的改良法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物
（三）方法评价
三、非标记抗体酶免疫组化染色法
（一）原理 该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特
异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结 合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2） 作桥，Ab2既可与 Ab3的Fc段结合，又可与 结合在组织抗原上的第一抗体（Ab1）的Fc 段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对 抗原的检测。
4.APAAP法 APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立
的碱性磷酸酶（AP）- 抗碱性磷酸酶（AAP） 法，简称APAAP法。技术要点与PAP法相似。
（三）方法评价
该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于 酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗 体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的 缺点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥 PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高 的方法。
通过桥抗体（Ab2）将特异性识别组织抗原 的抗体（Ab1）与PAP复合物的抗酶抗体连 接起来Ag-Ab1-Ab2-PAP
3.双桥PAP法 该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体
和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比 PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏 感性。
酶标记抗体免疫组织化学染色法 非标记抗体酶免疫组织化学染色法
二、酶标记抗体的免疫组化染色法
（一）原的共价键作用将酶直接连接在抗体 （或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体） 与组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应 后，通过酶对底物的催化作用，生成不溶 性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗 原定性、定位、定量检测的目的。
免疫组织化学检验技术
免疫组织化学检验技术免疫组织化学检验技术的发展和应用一、引言免疫组织化学检验技术是一种重要的生物医学实验技术，通过对组织样本中特定抗原的检测，可以帮助医生诊断病变组织或肿瘤类型，以及评估其分子表达水平。
本文将从免疫组织化学检验技术的基本原理、发展历程以及应用领域等方面综述相关知识。
二、免疫组织化学检验技术的基本原理免疫组织化学检验技术是一种建立在免疫学原理基础上的组织学检测方法。
其基本原理是通过使用专门设计的抗体与标记物的结合来检测组织样本中的特定蛋白质。
常用的标记物包括酶、荧光染料等，可以使抗原表达区域呈现显色或发光的现象，进而实现对组织中抗原的定性或定量分析。
三、免疫组织化学检验技术的发展历程免疫组织化学检验技术的发展经历了多个重要的里程碑。
早在20世纪50年代，Papst和Russell等学者首次使用抗体来检测肿瘤细胞蛋白质的表达。
从那时起，免疫组织化学检验技术逐渐成为研究和诊断领域中不可或缺的工具。
随着抗体和标记物的不断改进以及细胞和分子生物学的进展，免疫组织化学检验技术也日益完善。
四、免疫组织化学检验技术的应用领域免疫组织化学检验技术在生物医学领域中有着广泛的应用。
在肿瘤病理学中，免疫组织化学检验技术可以用来确定不同类型的肿瘤，并分析其分子表达特征。
在研究某些重要蛋白质表达与疾病关系的基础研究中，免疫组织化学检验技术可以帮助寻找新的生物标志物，促进疾病的早期诊断和治疗。
该技术还可以用于药物研发过程中的药物靶点评估、药效评估以及药物安全性评估等方面。
五、个人观点和理解免疫组织化学检验技术作为一种重要的生物医学实验技术，对于促进人类健康和疾病治疗具有重要意义。
通过使用免疫组织化学检验技术，我们可以更加准确地诊断患者的疾病类型，并对其进行个体化的治疗。
免疫组织化学检验技术还可以帮助我们深入了解蛋白质的分子机制，促进生物医学研究的进展。
总结与回顾本文主要介绍了免疫组织化学检验技术的基本原理、发展历程以及应用领域。
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HRP显色反应： HRP＋H2O2 电子供体 HRP
＋H2O＋电子供体（氧化型）
电子供体被氧化后，迅速改变 颜色，通过聚合等反应，生成不溶 性有色颗粒，并就地原位沉淀。
HRP常用的电子供体：
● 3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色 ● 氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂， 易扩散，用水溶性封固剂。
组织抗原 第一抗原 第二抗体 过氧化物酶
间接法
特点：敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。 但较直接法费时，非特 异染色稍重。
第四节 酶 抗 酶 法
● 制备抗酶抗体 ● 制备PAP复合物
组织抗原 第一抗体 第二抗体 第三抗体（抗酶抗体） HRP
免疫酶组织化学技术
第一节 基 本 原 理
抗原＋抗体（特异性） ＋酶标记抗体，通过酶与 底物作用生成有色反应物， 定位组织或细胞内抗原的 一门技术。
★ 酶易于纯化，获得纯制品。 ★ 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 ★ 酶在PH中性液内较稳定。 ★ 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。
抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗 体）---PAP ---第二抗体--- PAP复合物
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
双PAP法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
双PAP法
步骤：五步法 特点：敏感性较高 缺点：但步骤多，费时，非特
异背景重
三、APAAP法 原理：抗原---特异抗体---第二
1. 抗原修复 2. 内 源 性 过 氧 化 物抑制 3. 正常血清封闭 4. 第一抗体
多聚合物酶法
组织抗原 一抗 HRP 多聚骨架
EPOS 方法
原理：采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架，将特异 性抗体和HRP，同时标记 在多聚合物分子上，形成 HRP---多聚合物---特异性 抗体。
步骤：一步法 特点：快速，简便，特异性强，
敏感性高 但商品化种类不全， 价格昂贵
二、EnVision法 Enhanced Labelled Polymer
LSAB法
● HRP标记Avidin 抗原---特异性抗体---Biotin标记
第二抗体---Avidin ● HRP复合物
步骤：三步法 特点：敏感性高，特异性强，
方法简便
第六节 多聚合物酶法
HRP---多聚合物---抗体 一、Epos法
Enhanced polymer one-step staining
（二）碱性磷酸酶（AKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取
● 组织穿透能力较弱 ● 内源性AKP较高 ● 左旋咪唑具有抑制作用
（三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定 ● 体内无内源性GOD ● 分子量大，穿透力较弱
二、底物及其特点
· 酶＋底物→酶 底物→酶＋
产物（显色）
HRP的底物：
● 4-氯-1-茶酚（4CN）～蓝色，易弥散，不能久保 存
● 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB) ～黄色
AKP底物： AKP 常 用 的 底 物 为 α- 萘 酚
AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB～蓝色 固红TR～红色
第三节 酶标记抗体法
酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在 抗体分子上，制备成酶标记抗体，通 过抗体去寻找相应抗原。
抗体--- APAAP复合物 步骤：三步法
APAAP法
特点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。 但产物易溶于有机溶剂
第五节 卵白素---生物素
Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同 亚基组成
Biotin小分子维生素 Avidin和Biotin具有较高亲和力
一 、ABC法 Avidin Biotin Complex
一、直接法 原理：HRP标记在特异性抗体
（第一抗体）上，抗原--抗体● HRP复合物
组织抗原 第一抗体 过氧化物酶
直接法
步骤：一步完成 特点：方法简便、省时，专一
性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。
二、间接法 原理：HRP标记在第二抗体上，
抗原---特异性抗体---第 二抗体● HRP复合物 步骤：二步法
System 原理：HRP ---多架
第一步
第二步
EnVisionTM方法
特点：
敏感性高：（1 mole复合物中含70mole HRP和 10 mole第二抗体） 特异性强： 复合物内无内源性Avidin和Biotin 的干扰。
第七节 基本操作步骤
酶桥法
一、PAP法 原理：抗原---特异性抗体---第
二抗体（桥抗体）--PAP复合物 步骤：三步法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
PAP法
特点： 敏感性较高，背景染色较轻 但特异性抗体与PAP必须为 同一种属动物
二、双PAP法： 原 理 ： 在 PAP 的 基 础 上 再 重 复 第二抗体和PAP复合物
符合上述条件：
辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶
（一）辣根过氧化物酶（HRP）
★ 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 ★ 稳定，易获得较高纯度酶 ★ 具有较高活性及特异性 ★ 可溶性佳，生成的产物不扩散 ★ 组织中内源性酶较少 ★ 可作用于多种底物，产生不同颜色 ★ HRP穿透力强，易进入细胞内
应用范围广
● 某些脏器存在内源性生物素 干扰
● Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应
SABC法 Streptavidin biotin Peroxidase
Complex SABC法已代替ABC法
二、LSAB法 Labelled Streptavidin Biotin Method 原理： ● Biotin标记第二抗体
原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin
酶素化Biotin＋Avidin --- ABC 复合物 抗原---特异抗体--- Biotin标记 第二抗--- Avidin ● Biotin ●HRP
组织抗原 第一抗体 第二抗体 HRP 生物素 卵白素
ABC法
步骤：三步法 特点：敏感性较高，特异性强，