基于13C稳定性同位素微观代谢和宏观代谢信息综合分析的发酵过程优化研究PPT课件
代谢工程概述-PPT
（1）基因工程技术的应用 （2）常规诱变技术的应用
2、 生物合成途径的代谢调控
（1）生物合成中间产物的定量生物测定 （2）共合成法在生物合成中的应用 （3）酶的诱导合成和分解代谢产物阻遏
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3、研究生物合成机制的常用方法
（1）刺激实验法 （2）同位素示踪法 （3）洗涤菌丝悬浮法 （4）无细胞抽提法 （5）遗传特性诱变法
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• 1. 生物能支撑观点 • 微生物细胞是工业发酵产物的生产者，微生物细胞的
生长和维持需要由其自身的能量转换机构或从其他形 式的能量转化形成的生物能来支撑。因此，工业发酵 具有生物学属性。
• 2. 代谢网络观点 • 由生化反应网络和跨输送步骤组成的代谢网络既没有
绝对的起点，也没有绝对的终点。代谢网络中任何一 种中间产物(或可借助生物学、化学方法与代谢网络联 网的任何一种化合物)都可能被开发成为工业发酵的目 的产物或原料。
简而言之，代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的 的修饰。
代谢工程要解决的主要问题就是改变某些途径中的碳 架物质流量或改变碳架物质流在不同途径中的流量分布。 其目标就是修饰初级代谢，将碳架物质流导入目的产物 的载流途径以获得产物的最大转化率。
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代谢工程的主要特征就是利用DNA重组技术， 重建代谢网络，改变代谢流及分支代谢速度， 以改进代谢产物及蛋白类产品，由于外源 DNA的引入扩展了固有的代谢途径，获得了 新的化学物质。改变转化蛋白的过程，减少 不必要的废物。例如，谷氨酸发酵
“中心途径”和“离心途径”等连续的代谢途径的代谢，才能在胞内生成目的
产物，最后，目的产物跨过细胞质膜排出细胞回到培养介质中。
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1、胞外酶对原料的降解及营养物质进入细 胞的过程 2、经胞内降解代谢途径汇入中心代谢途径 3、中心代谢途径及其控制 4、合成代谢流及其控制 5、目的产物的跨膜及其控制
13c脯氨酸质谱同位素峰
13C脯氨酸质谱同位素峰：
脯氨酸，作为人体蛋白质中的一种重要氨基酸，对于生物体的生命活动具有不可或缺的作用。
通过质谱技术对脯氨酸进行分析，可以了解其分子结构和化学键等信息，对于研究生物体内蛋白质的合成与分解具有重要意义。
在13C脯氨酸质谱图中，我们可以观察到明显的同位素峰。
同位素峰是指质谱图中特定质量的离子信号，其出现是由于分子中存在同位素元素，导致其质量数与普通元素不同。
在脯氨酸分子中，含有C、H、O、N等元素，其中C元素的存在使得脯氨酸具有明显的13C同位素峰。
在13C脯氨酸质谱图中，主要的同位素峰包括M+1、M+2、M+3和M+4等。
其中，M+1峰是由于脯氨酸分子中C-13的天然丰度较高，因此该同位素峰较为明显。
而M+2、M+3和M+4等峰则是由于分子中存在多个C-13原子，导致其质量数增加而产生的。
除了同位素峰外，脯氨酸质谱图中还包含其他重要的信息。
例如，通过对比不同条件下脯氨酸的质谱图，可以研究脯氨酸分子的化学键断裂规律以及其在生物体内的代谢过程。
此外，利用质谱技术还可以对多肽和蛋白质进行序列分析，对于研究生物体内蛋白质的合成与分解具有重要意义。
总之，13C脯氨酸质谱同位素峰是脯氨酸分子中C-13原子存在的重要标志。
通过对其进行分析，可以了解脯氨酸分子的结构特点以及其在生物体内的代谢过程。
这一技术对于研究生物体内蛋白质的合成与分解具有重要意义，为人类疾病的预防和治疗提供了有力支持。
随着科技的不断发展，相信在未来的研究中，我们还能够利用质谱技术对更多的生物分子进行分析，为人类健康事业的发展做出更大的贡献。
13c标准物质的
13c标准物质的
13C标准物质是指其中的碳元素的同位素含量为13C的化合物。
13C是碳的一种同位素，相对丰度为1.1%，相对于稳定同位
素12C而言，13C含量较少。
13C标准物质在化学、生物、地质等领域中具有广泛的应用。
它可以用于研究化学反应、代谢途径、发酵过程等。
通过测定13C同位素比值，可以确定样品中特定元素的来源和代谢途径，进一步了解样品的性质和过程。
在医学和环境科学研究中，13C标准物质被用于进行同位素示
踪实验。
通过给予受试者带有13C标记的物质，研究者可以
追踪和定量受试者体内物质的代谢路径和转化速率，从而了解疾病发展和环境污染的机理。
常见的13C标准物质包括13C标记的葡萄糖、氨基酸、脂肪
酸等有机物，以及13C标记的二氧化碳等无机物。
这些标准
物质经过特殊制备和纯化工艺，确保其同位素含量和纯度的准确性和稳定性，以提供可靠的实验数据。
13c-尿素同位素丰度的检测方法
13c-尿素同位素丰度的检测方法13C-尿素同位素丰度检测方法是一种分子分析技术，用于分析样品中13C标记的尿素分子的相对丰度。
这种技术可以用来研究胃肠道的运动、蛋白质消化和氮代谢等方面的生理学和病理学过程。
在临床应用中，13C-尿素同位素丰度检测方法主要用于检测幽门螺杆菌感染和胃肠道功能障碍等疾病。
下面将详细介绍13C-尿素同位素丰度检测方法的原理、步骤和实验注意事项。
一、原理13C-尿素同位素丰度检测方法是基于13C同位素的质谱分析技术。
在13C-尿素同位素丰度检测方法中，将富含13C的尿素与患者饮食中含有12C的食物混合后口服，经过一段时间后，采集患者呼出气体中的CO2样品，并利用质谱仪分析13C和12C的相对丰度。
由于富含13C的尿素可以被幽门螺杆菌分解产生CO2，因此这种检测方法可以用来检测幽门螺杆菌感染和评估幽门螺杆菌的灭菌效果。
二、步骤1. 饮食控制：检测前患者需要遵循一些特殊的饮食控制，在检测前3-7天内禁止摄入大量含有13C的食物和药物，如牛奶、面包、饼干、鸡蛋等含有13C的食物，以及含有13C标记的药物。
2. 收集呼气样品：患者进食后，将样品收集瓶插入患者口中，患者闭上嘴唇，用吸气器吹出口腔的空气，然后舌头抵住瓶口，再用力吹气至瓶内。
3. 测量同位素丰度：将收集好的呼气样品放入质谱仪中测量同位素丰度，可以得到13C和12C的相对丰度比例，从而计算出13C-尿素的相对丰度。
三、实验注意事项2. 样品收集：收集患者的呼气样品时，需要采取严格的措施，保证样品不被外界的污染物所影响，建议在空气清新的环境下进行。
3. 质谱分析：在质谱分析时，要注意仪器的调试和校准，确保分析数据的准确性和可靠性。
4. 个体差异：需要注意的是，13C-尿素同位素丰度的检测结果可能受到个体差异的影响，因此一定要结合临床病史和其他检查结果进行综合分析。
基于13C稳定性同位素微观代谢和宏观代谢信息综合分析发酵过程优化及研究共28页PPT
研究
11、不为五斗米折腰。 12、芳菊开林耀，青松冠岩列。怀此 贞秀姿 ，卓为 霜下杰 。
13、归去来兮，田蜀将芜胡不归。 14、酒能祛百虑，菊为制颓龄。 15、春蚕收长丝，秋熟靡王பைடு நூலகம்。
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
Thank you
发酵过程优化与控制(原理部分)
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大型发酵罐 搅拌装置
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现代发酵工程的主要研究内容
1.发酵过程的优化控制技术 2.生化过程的模型化 3.高密度培养技术 4.代谢工程和代谢网络控制 5.新型生化反应器的研究和开发 6.新型发酵和产品分离技术
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第一章
绪论
一. 发酵过程优化在生化工程中的地位 二. 发酵过程优化的目标和研究内容 三. 发酵过程优化的研究进展 四. 流加发酵过程的优化控制
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一. 发酵过程优化在生化工程中的地位
现代生物技术不仅能在生产新型食品、饲料添加剂、 药物的过程中发挥重要的作用，还能经济、清洁地 生产传统生物技术或一般化学方法很难生产的特殊 化学品，在解决人类面临的人口、粮食、健康、环 境等重大问题的过程中必将发挥积极的作用 如何才能更好地发挥现代生物技术的作用？ 以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是 一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必 须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度(便于下 游处理)、较高的底物转化率(降低原料成本)和较高 的生产强度(缩短发酵周期) 20
养或半连续发酵，是指在分批发酵过程
中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵
方法
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流加发酵的研究进展
在20世纪70年代以前流加发酵的理论研究 几乎是个空白，流加过程控制仅仅以经验为 主，流加方式也仅仅局限于间歇或恒速流加
1973年日本学者Yoshida等人首次提出了 “Fed-Batch Fermentation”这个术语，并从理 论上建立了第一个数学模型，流加发酵的研究 才开始进入理论研究阶段
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基于碳氢化合物的经济转变为基于 碳水化合物的经济
将工业革命世纪转变到生物技术世纪 只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再
发酵过程优化与控制PPT课件
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3
发酵过程技术原理
分批发酵 补料-分批发酵 半连续发酵 连续发酵
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4
分批发酵
几个重要参数：
为比生长速率,h-1； -qs 为比基质消耗速率,(g/g)/h； qp 为比产物形成速率,(g/g)/h 。
uX dX dt
q xX d S dt
补充养分，同时解除/消弱代谢产物的抑制。
不足：
丢失了未利用的养分和处于生长旺盛期的菌体；送去提炼 的发酵液体积更大；丢失代谢产生的前体物；利于非产生 菌突变株的生长。
实施：海洋微藻合成藻红素和EPA。
需要摸索最佳的培养基更新速率。
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连续发酵
发酵过程中一面补入新鲜的料液，一面以相同的流速 放料，维持发酵液原来的体积。（恒化培养）
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1
发酵过程优化与控制
发酵
狭义——厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成 乳酸或乙醇等的分解代谢过程。
广义——微生物把一些原料养分在合适的发酵 条件下经特定的代谢途径转变成所需产物的过 程。
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2
发酵是一个很复杂的生化过程，其好坏涉及诸多因素： 菌种性能、培养基组成、原料质量、灭菌条件、种子 质量、发酵条件和过程控制等
pH变化会影响酶活，菌对基质的利用效率和细
胞结构，从而影响菌的生长和产物的合成。
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选择最适发酵pH的原则是获得最大比生产速率和
适当的菌量。
分阶段pH控制策略
如何控制发酵液pH？
基础培养基的配方；通过加酸碱或中间补料 例如，青霉素发酵，通过调节加糖速率来控制pH；链 霉素的生产，补充NH3来控制pH，同时为产物合成提 供氮源。
培养液pH可反映菌的生理状况：pH上升超过最适值，意 味着菌处于饥饿状态，可加糖调节；糖的过量又使pH下 降；用氨水中和有机酸需防止微生物中毒，可通过监测 培养液种溶氧浓度的变化来控制。
13c稳定同位素
13c稳定同位素
13C稳定同位素是化学领域中一个重要的研究课题。
它涉及到一种放射性同位素,即13碳同位素,这种同位素具有非常长的半衰期,可以在实验室中进行研究和分析。
13碳同位素是一种放射性同位素,它的半衰期可以达到数千年。
这种同位素可以通过几种不同的方法进行研究,包括量子计算、核磁共振和化学实验等。
在量子计算方面,13碳同位素可以用来研究碳同系物的结构、性质和反应。
通过对13碳同位素的量子计算,可以获得有关碳同系物的重要信息,包括它们的分子结构、电子分布和反应特性等。
在核磁共振方面,13碳同位素可以用来研究碳同系物的化学性质和生物分子。
通过对13碳同位素的核磁共振研究,可以揭示碳同系物的化学键结构、电子状态和反应性等。
在化学实验方面,13碳同位素可以用来研究碳同系物的物理和化学性质。
通过对13碳同位素的化学实验研究,可以揭示碳同系物的物理和化学性质,包括它们的化学键结构、分子形态和反应性等。
13碳同位素在研究碳同系物的结构和性质方面具有重要的作用。
通过研究13碳同位素的行为,我们可以更好地了解碳同系物的特性,为开发新的材料和药物提供了重要的理论基础。
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4 生产菌株工程菌改造的基础分析，表型与基因型之间的关系的阐明， 更好地指导工程菌构建。
7-ADCA发酵过程中己二酸前体的利用
Fate of labeled CO2 in fatty acid biosynthesis
[1-13C]Alanine Pyruvate
Val
PDH CO2
External 13CO2
PDH CO2
Ac-CoA
Ac-CoA
C Triose-P 1
RubisCO Ru1,5-P2
PGA PGM, ENO
1
1
OAA
PEP
PK
Phe
1
1
1
[U-13C3]Alanine Pyruvate
Val
PDH CO2
CO2
Transcri ptome
Genome
Fluxome
Proteome
Cell
metabolism
Vitamin
Amino acids Peptides
Antibiotics
Organic acids Bio-fuels
Enzymes
基于化学计量学的代谢通量分析（MFA）
其理论基础是中间代谢物的拟稳态假设和物料的质量守恒定律。 它是在构建好的细胞代谢网络的基础上，先假设代谢网络的中间代谢物 都处于拟稳态，然后根据物料质量守恒定律写出符合该代谢网络的化学 计量矩阵方程，再通过测量胞外底物消耗速率和代谢物分泌速率，最后 计算得出整个代谢网络的流量分布。
基于13C稳定性同位素微观代谢和宏观代谢信 息综合分析的发酵过程优化研究
A Powerful Tool in Metabolic Engineering
微观代谢流研究的重要性
Envirome
Nutrition
Toxin/Danger Pressure Osmolarity pH ORP Sheer Stress Temperature Oxygen
Ratio PEP from PPP pathway OAA from PEP OAA from glyoxylate Pyruvate from malate PEP from OAA Serine from glycine Glycine from serine Erythrose-4-P from pentose-5-P Pentose-5-P from glucose-6-P Pentose-5-P from erythrose-4-P Serine through glycolysis Pyruvate through ED pathway
对数生长期和连续培养的拟稳态过程
13C同位素标记代谢原理
细胞代谢物标记信息的测定方法
衍生物 ALA M-15
M-85
F-302
建立氨基酸与相应的中心代谢途径中 间物之间的碳原子映射矩阵对应关系
由测得的氨基酸的标记丰度分布信息 推算出对应的中间代谢物的碳原子标 记信息
由计算得到的对应中间代谢物 的碳原子标记信息，进而计算 出代谢流经各个途径的反应速 率通量。
Ac-CoA
D1
PHE(1-9)
PHE(1-2) PHE(2-9)
Phe
1 Val(1-5) Val(2-5)
Val
calculate ratios
from MS
external feed
feed by 13C1-ala
feed by U-13C1-ala
研究技术的成熟
• 对生产菌代谢途径的变化分析。 • 标记底物的选择。 • 标记底物 模式的选择。 • 数据的处理及分析。
Experiment U U U U U U U U U U 1 1
细胞代谢途径通量计算
13C标记代谢技术的应用
1 发酵生产中底物（糖、前体等）消耗较大造成发酵原材料成本较高， 如青霉素、头孢、环孢菌素、维生素、7-ADCA发酵等。
2 发酵生产过程中副产物的组分含量较高，如谷氨酸发酵过程中乳酸的 积累、维生素B12发酵过程中丙酸积累。
CH
Methionine
CH2
CH2
S
CH3
CH3
CH3 +H3N CH3
COO- Betaine CH H
A
pH
转速
补加甜菜碱 OUR
CER
OUR and CER (mmol/l/h) pH
基于非稳态标记实验的CO2对VB12合成影响的研究
Flux rates
PEP from PP Pathway SER from GLY GLY from SER PYR from MAL OAA from PYR PEP from OAA
发酵过程中非稳态代谢流分析
（传统实验模式） 标记底物
（新实验模式）标记底物
分解合成代谢
细胞
分解合成代谢
中间代谢物
中间代谢物
氨基酸
菌体蛋白
氨基酸
菌体蛋白
水解质谱分析
质谱分析
水解质谱分析
生产规模反应器
在线电极信号线
在线电极信号线 在线参数采集线
尾气质谱仪
微型传感反应器 离心洗涤 细胞破碎 质谱测定
快速取样 灭活
A
A’
B
B’
C
C’
N
ห้องสมุดไป่ตู้
N’
局限性
能量平衡分析上，全面确定与能量相关的反应非常困难 原核生物中存在大量无效循环 细胞中大量存在的可逆反应、双向反应、回补反应 及并行反应中的净通量
13C代谢通量分析
典型的应用是在连续培养过程中使代谢达到拟稳态，利用菌体 蛋白原氨基酸的标记信息，对中心代谢途径通量进行计算。
Scenarios and calculations
A Triose-P 1
RubisCO Ru1,5-P2
PGA PGM, ENO
1
1
B Triose-P 1
RubisCO Ru1,5-P2
PGA PGM, ENO
1
1
PEP
PK
Phe
PEP
PK
Phe
1
1
1
1
1
1
Alanine Pyruvate
Val
Distribution of total pool (mean% ± SD)
Point A
Point B
35.9 ± 1.9
15.7 ± 1.7
数据采集分析系统
GC-MS
基于13CMFA的VB12发酵过程甜菜碱 的代谢及工艺优化
Biomass
(U-13C)Glucos e
Serine COO-
Glycine COO-
CO2
6.55
3PGA
+H3N C H
+H3N C H
NH3
H C OH 93.45
H
CH3
OAA
COO-
H
Biomass
+ H3 N