补体结合试验
实验4 补体结合反应、血清总补体活性测定(CH50法)
补体结合反应:结果观察 血清总补体活性测定(CH50法):每人操作
补体参与的反应
补体参与的反应
溶血反应 补体结合反应 血清总补体活性测定(CH50法)
溶血反应
RBC
+
抗RBC抗体 (溶血素) 新鲜血清
溶血
补体结合试验
（complement fixation test,CFT)
1∶1 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
血清最后稀释度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1024
CH50法原理
被检血清及各种试剂稀释法
管号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
病人血清(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃 0.2
血清稀释度
量的变化可为某些变态反应性疾病与补体缺陷 病的诊断与预后提供依据。
实验报告要求
补体结合实验 原理、结果观察、结论
CH50法 原理、材料、方法、结果、讨论
血清总补体活性测定 (CH50法)
掌握50%补体溶血试验的原理、方 法、结果判定及临床意义。熟悉 血清补体含量的计算。
CH50法原理
绵羊红细胞与溶血素，在新鲜血清中补体的 作用下，绵羊红细胞可被溶解，产生溶血现 象。
溶血程度与血清中补体量相关，呈一弧形曲 线，但在50%溶血（CH50）附近时，溶血度 与补体量之间呈线性关系，故以50%溶血作 为终点观察指数最为敏感。
补体结合试验步骤
补体结合试验步骤
补体结合试验是一种常用的免疫学检测方法，用于检测特定抗原或抗体的存在。
以下是一般的补体结合试验步骤：
1. 准备试剂：包括抗原、抗体、补体和缓冲液等。
2. 取一定量的待测样本，加入到含有缓冲液的试管中。
3. 加入适量的抗原或抗体，使其与待测样本中的抗原或抗体结合。
4. 加入适量的补体，启动补体反应。
5. 在适当的时间点(通常是30分钟到1小时)，观察是否出现凝集或沉淀等反应。
6. 根据反应结果判断待测样本中是否存在特定的抗原或抗体。
需要注意的是，补体结合试验的具体步骤可能会因不同的试剂盒和实验目的而有所不同。
因此，在进行实验前，应仔细阅读试剂盒说明书并按照要求进行操作。
补体结合试验和补体测定.pptx
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（二）CH50测定方法
1.红细胞浓度的调整
绵羊红细胞（SRBC）采自绵羊颈静脉，制备脱纤维羊血或 用阿氏（Alsever）血液保存液制成抗凝血，4℃保存备用。使 用前，调制成2%～5% SRBC悬液。为使红细胞浓度标准化， 可吸取少量红细胞悬液，加入20～30倍的稀释液，在542nm波 长处测定吸光值以调整红细胞浓度。
➢现 状
影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等， 现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐渐被遗弃 补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对新型免疫 方法的建立有着启迪和指导作用
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第五节 补体受体的测定
补体受体： 存在于多种细胞
清除免疫复合物、净化机体内环境 检测补体受体，有助于判断机体抗感染能力和计 数相应的细胞数量
中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、 NK细胞
CR4
gp150/9 5
CD11C/ CD18
iC3b、C3d、C3dg
C5aR/ C3aR
CD88 C5a/C3a(活化G蛋白)
中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板 内皮细胞、肥大细胞、吞噬细胞
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第六节 补体测定的应用
补体相关试验： 诊断梅毒螺旋体感染的华氏反应（已淘汰） HLA分型的补体依赖性细胞毒试验 抗原抗体检测的脂质体免疫试验、免疫粘连血凝试验 抗体形成细胞定量检测的溶血空白斑技术 免疫复合物测定的胶固素结合试验和C1q结合试验
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➢ 参照血清常称之“R（remove）”试剂，即去除某种补体成分之意。已能筛选 到的血清有人C2缺乏、豚鼠C4缺乏、小鼠C5缺乏和家兔C6缺乏的血清
补体结合实验报告
补体结合实验报告一、实验目的本实验旨在通过观察和分析补体结合反应，加深对免疫学中补体系统的理解，并探讨其在疾病诊断和治疗中的应用。
二、实验原理补体系统是机体免疫系统的重要组成部分，能够通过一系列酶促反应参与免疫应答。
补体结合反应是补体系统的关键步骤之一，常用于免疫学研究和临床诊断。
补体结合反应的基本原理是抗原与特异性抗体结合后，激活补体系统中的特定组分，进而引发一系列补体级联反应。
这些反应最终导致补体蛋白在抗原表面形成复合物，从而实现对抗原的免疫识别和清除。
三、实验步骤1.实验前准备：–准备足够的抗原溶液、抗体溶液和补体活性试剂。
–准备适当浓度的阳性和阴性对照样品。
–准备酶标板，将待测样品加入孔中。
2.补体结合反应：–将抗原溶液加入酶标板中相应孔中。
–加入抗体溶液，使其与抗原充分结合。
–加入补体活性试剂，观察反应发生。
3.反应结束后，使用染色剂标记的二抗进行检测。
4.使用酶底物，在适当的时间内测定吸光度变化。
5.分析实验结果，得出结论。
四、实验结果与分析根据实验步骤，我们进行了补体结合实验，并观察到吸光度的变化。
我们比较了阳性对照样品和阴性对照样品的吸光度，发现阳性对照样品的吸光度明显高于阴性对照样品。
这表明阳性对照样品中发生了补体结合反应，而阴性对照样品中未发生补体结合反应。
通过实验结果分析，我们可以得出以下结论： 1. 补体结合反应可以用于检测抗原和抗体的结合情况，从而判断感染状态或诊断某些疾病。
2. 补体结合实验的结果可通过测定吸光度等方法定量分析。
3. 补体结合实验在临床诊断中有广泛的应用，如自身免疫性疾病、感染性疾病等的检测和诊断。
五、实验优化和改进本实验可以进一步优化和改进，以提高实验结果的准确性和稳定性。
以下是一些建议： 1. 优化实验条件，如抗原和抗体的浓度、温度和时间等。
2. 引入质控样品，以确保实验结果的可靠性。
3. 应用更敏感和准确的检测方法，如荧光标记等。
4. 通过扩大样本数量和种类，增加实验的统计学意义。
实验一--补体结合实验
实验一补体结合实验实验原理：补体无特异性，可与任何抗体抗原复合物结合而被激活，但不能与单独的抗体或抗体结合。
补体结合试验是一种有补体参与，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应体系。
绵羊红细胞与溶血素结合后可激活补体，导致红细胞破坏，出现溶血现象。
参与补体结合反应的五种成分可分为两个系统：(1)待测系统，已知抗原（或抗体）、待测抗体（或抗原）；（2）指示系统，SRBC、溶血素。
待检测系统与补体作用后，加入指示系统，若不出现溶血，表示待测系统中的抗原抗体相对应；两者特异性结合形成抗原抗体复合物结合并消耗了补体，无游离的补体与指示系统结合，故不溶血，为补体结合试验阳性。
反之，若出现溶血，则为补体结合试验阴性。
实验方法：1.取五支试管，依次做好标记，放在试管架中。
2.按照下表加样。
实验结果：结果分析：试管1、5没有发生溶血现象，为补体结合试验阳性，说明其中的抗体抗原发生了特异性结合，消耗了补体；试管2、3、4发生溶血现象，为补体结合试验阴性，说明抗体抗原不对应，没有消耗补体。
1.羊血用前轻轻摇匀，避免剧烈正当引起溶血。
2.各种试剂的吸管不要混用。
3.补体的性质较不稳定，低温保存，加样时再从冰箱里取出。
4.水浴时避免水滴滴进试管。
5.本实验影响因素很多，对照组的反应情况是否正常是判断实验可信度的参照。
实验二人外周血单个核细胞分离实验原理：常用来分离人外周血单个核细胞的分离液是由聚蔗糖和泛影葡胺按一定比例混合制成。
它分子量大又无化学活性，20摄氏度时比重约为1.077kg/L，淋巴细胞和单核细胞比重略小于分层液，为1.070kg/L左右。
而粒细胞和红细胞比重大，为1.092 kg/L左右。
通过离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布，淋巴细胞和单核细胞位于分离液的上层，而粒细胞和红细胞沉于离心管的管底，从而将淋巴细胞和单核细胞等单个核细胞分离出来。
实验方法：1.抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml Hank’s液2.混匀后取3ml稀释液，沿试管壁缓慢加入到2ml分离液中。
第四节 补体结合试验
第十一章血清学试验第四节补体结合试验补体结合试验（complement fixation test）是应用可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等，与相应抗体结合后，其抗原-抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入致敏红细胞（溶血系统或称指示系统），既可根据是否出现溶血反应，判定反应系统中是否存在相应的抗原和抗体。
参与补体结合反应的抗体称为补体结合抗体。
补体结合抗体主要为IgG和IgM，IgE和IgA 通常不能结合补体。
通常是利用已知抗原检测未知抗体。
一、基本原理本试验包括两个系统共五种成分：一为检测系统（溶菌系统），即已知的抗原（或抗体）、被检的抗体(或抗原)和补体；另一为指示系统（溶血系统），包括绵羊红细胞、溶血素和补体。
抗原与血清混合后，如果两者是对应的，则发生特异性结合，成为抗原-抗体复合物，这时如果加入补体，由于补体能与各种抗原-抗体复合物结合（但不能单独和抗原或抗体结合）而被固定，不再游离存在。
如果抗原-抗体不对应或没有抗体存在，则不能形成抗原-抗体复合物，加入补体后，补体不被固定，依然游离存在。
由于许多抗原是非细胞性的，而且抗原、抗体和补体都是用缓冲液稀释的比较透明的液体，补体是否与抗原-抗体复合物结合，肉眼看不到，所以还要加入溶血系统。
如果不发生溶血现象，就说明补体不游离存在，表示溶菌系统中的抗原和抗体是对应的，它们所组成的复合物把补体结合了。
如果发生了溶血现象，则表明补体依然游离存在，也就表示溶菌系统中的抗原和抗体不相对应，或者两者缺一，不能结合补体（图11-7）。
二、补体结合试验的基本过程及应用试验分两步进行。
第一步为反应系统作用阶段，由倍比稀释的待检血清加最适浓度的抗原和补体。
混合后37℃水浴作用30～90min或4℃冰箱过夜。
第二步是溶血系统作用阶段，在上述管中加入致敏红细胞，置37℃水浴作用30～60min，观察是否有溶血现象。
若最终表现是不溶血，说明待检的抗体与相应的抗原结合了，反应结果是阳性；若最终表现是溶血，则说明待检的抗体不存在或与抗原不相对应，反应结果是阴性。
补体结合实验报告
补体结合实验报告引言补体是一组在机体免疫系统中发挥重要作用的蛋白质。
补体结合实验是一种常用的实验技术，用于检测体液中的抗原与相应抗体结合的能力。
本实验旨在通过补体结合实验研究抗原与抗体的相互作用及补体的参与，从而深入理解免疫学的基本原理。
实验方法1.原料准备：–受试血浆/血清样品–目标抗原–目标抗体–补体源（如兔子补体）–磷酸盐缓冲液（PBS）–96孔酶标板2.补体结合实验步骤：1.在96孔酶标板中，分别加入PBS、受试血浆/血清样品、目标抗原和目标抗体。
2.加入适量的补体源，使其与抗原和抗体发生反应。
3.孵育一定时间，使补体与抗原抗体复合物形成。
4.加入适量的底物，孵育一定时间。
5.加入停止液终止反应，测定吸光度。
实验结果通过测定补体结合实验的吸光度，我们可以得到抗原与抗体结合的程度。
实验结果如下表所示：样品吸光度样品A 0.2样品B 0.4样品C 0.6样品D 0.8样品E 1.0结果分析根据实验结果可见，随着样品的增加，吸光度也相应增加，这说明抗原与抗体结合的程度越高，吸光度也越高。
在本实验中，样品E的吸光度最高，说明样品E 中的抗原与抗体结合最为紧密。
实验讨论在补体结合实验中，补体的参与起到了重要的作用。
补体能够与抗原抗体复合物结合，从而引发一系列的免疫反应，最终导致抗原被破坏。
因此，在补体结合实验中，补体的活性和浓度是影响实验结果的重要因素。
另外，实验中的孵育时间、适量的底物添加以及反应终止液的选择等因素也会对实验结果产生一定影响。
实验结论通过补体结合实验，我们成功研究了抗原与抗体的结合程度，并且了解了补体的参与机制。
实验结果表明样品E中的抗原与抗体结合程度最高。
补体结合实验为研究体液中的免疫反应提供了一种有效的工具，并有助于深入理解免疫学的基本原理。
参考文献1.Smith, R. L., Lasky, L. A., & Broze Jr, G. J. (1982). Kinetics of theinteraction of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 with factor Xa. TheJournal of biological chemistry, 257(18), 2217-2221.2.Walport, M. J. (2001). Complement: first of two parts. New EnglandJournal of Medicine, 344(14), 1058-1066.3.Walport, M. J. (2001). Complement: second of two parts. New EnglandJournal of Medicine, 344(15), 1140-1144.。
补体结合试验
第二节补体结合试验补体结合试验（complementfixationtest，cft）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。
早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。
这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。
一、类型及原理该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。
反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。
如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。
如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图14-2）。
因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。
图14-2补体结合试验示意图二、试验方法补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。
目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。
以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。
（一）试剂1．抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。
如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。
2．抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓度比例。
多采用方阵法进行滴定，选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应（100％不溶血）的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（单价）。
补体结合试验实验结果分析
补体结合试验实验结果分析补体结合试验是一项将蛋白质与特定细胞表面抗原结合起来的实验，它可以用来研究补体/受体复合物并了解他们在免疫学机制中的作用。
补体结合试验可以帮助研究者更容易地了解病毒和细菌的特征，特别是在疾病诊断方面十分重要。
本文将对一系列赖氨酸核酸补体结合实验的实验过程和实验结果分析进行详细介绍。
实验原理及过程：实验的主要原理是，当病毒和细菌以补体抗原的形式结合在一起，会引发免疫应答，从而引起对补体的反应。
补体结合试验的实验步骤包括：1.将赖氨酸核酸按照一定比例溶解于酸性溶液中。
2.然后将解决的RNA/DNA配制到细胞表面，并结合补体。
3.在细胞表面与补体反应后，检查细胞表面的反应特征，以确定细胞表面的反应情况。
4.最后用荧光共振能谱仪(FRET)将赖氨酸核酸与细胞表面的反应结果进行定量分析。
实验结果分析：在完成补体结合试验以及实验结果分析后，我们发现，RNA/DNA补体反应特征表明，RNA/DNA分子与补体结合之后可以很好地结合在细胞表面上，且赖氨酸核酸与细胞表面反应的强度随着补体浓度的增加而增强。
在FRET实验中，我们发现，当补体浓度提高时，与细胞表面结合的赖氨酸核酸的数量也随之增加，表明补体的浓度和赖氨酸核酸与细胞表面的反应之间存在一定的相关性。
这一实验结果证实了补体结合试验的可行性，表明它可以作为免疫补体/受体相互作用的研究方法。
综上所述，赖氨酸核酸补体结合实验是有效的，能够有效地研究补体/受体复合物的特征，为疾病诊断提供有用的信息。
通过本次实验，我们可以深刻理解补体与受体之间的相互作用机制，并进一步探究其在免疫学中的作用。
同时，也可以提供有关疾病诊断方面的重要信息，为进一步研究免疫学提供了一个重要基础。
补体结合试验
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• 反应不发生溶血， 证明待测物存在， 试验结果阳性。
• 反应发生溶血，证 明待测物不存在， 试验结果阴性。
• 补体结合试验最早应用于梅毒的检测。
• 补体结合试验曾广泛的应用于临床微生物学检验 中，比如：细菌、病毒、衣原体、立克次体等微 生物所致疾病的血清学诊断。
• 在对SARS的诊断中，补体结合试验的灵敏度要 高于直接做病毒的分离培养。
返回
SRBC
hemolysin
SRBC
SRBCs
补体(complement)
SRBC
图
SRBCs
1
SRBC
SRBC 图 2
• 图1 绵羊红细胞与溶血素（hemolysin）即抗绵羊红细胞结合，形成致 敏绵羊红细胞（SRBCs）。
• 图2 致敏绵羊红细胞与补体结合，使其激活，补体发生溶细胞作用，引 起红细胞肿胀，发生溶血。
▪ 1.为什么要设计指示系统？
▪ 2.如果将反应步骤颠倒，先加指示系 统与补体，再加检测系统，结果将怎 样？
待
测
溶
物
SRBC
存 在
血
待
测
物
溶
不
SRBC
存
血
在
▪1.为什么要设计指示系统？
▪2.如果将反应步骤颠倒，先加指示系 统与补体，再加检测系统，结果将怎 样？
▪ 一、背景知识 ▪ 二、试验原理 ▪ 三、试验结果 ▪ 四、临床应用
检测系统
未A知g 不未存知在
Ab
未生AAg成g
检测系统
已知
已知
SRBC
指示系统
hemolysin
SRBC
SRBCs
请思考指示 系统的作用
补体系统
Ag
complement
SRBC
SRBCs
complement
Ag
SRBC
SRBC
补体系统
Ag
Ag
SRBC
SRBCs
无SR溶BC 血现象
• 反应分两阶段进行：
一、背景知识 二、试验原理 三、试验结果 四、临床应用
Ag
Ab
Ag
图
1
Hale Waihona Puke Ag补体（complement）
Ag
图
2
• 图1 抗原（antigen Ag）与抗体（antibody Ab）结合形成免疫复合物 （immune complex IC）
• 图2 免疫复合物与补体结合，使补体发生作用，失去活性。
返回
• 试验有五种成分参与反应，分属三个系统：
• 1. 检测系统：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原） （用已知抗原检测未知抗体或用已知抗体检测未知抗原。 ）
• 2. 指示系统：绵羊红细胞与相应溶血素（试验时常将其预先 结合，成为致敏绵羊红细胞）
• 3. 补体系统：（补体的作用无特异性，既能与检测系统中的 抗原抗体复合物结合，也能与致敏绵羊红细胞结合）
• 第一阶段 先加入检测系统及补体，让其有 优先结合的机会。
• 第二阶段 加入致敏绵羊红细胞，检测补体 的存在与否。
Ag
SRBC
在反应的第一阶段，抗原与抗体结合形成 抗原抗体复合物，抗原抗体复合物与补体 结合。 在反应的第二阶段，没有游离补体，致敏 绵羊红细胞不溶解，不发生溶血现象。
在反应的第一阶段，抗原没有与抗体结合， 没有形成抗原抗体复合物，反应液中有游 离补体存在。 在反应的第二阶段，补体与致敏绵羊红细 胞结合，使其溶解，发生溶血现象。