TaKaRa 凝胶回收说明书.
TAKARA公司pMD19-T说明书
出现的菌落有可能呈现蓝色（或淡蓝色）。
Q-3 欲对克隆 DNA 片段进行测序时，使用何种引物？ A-3 本载体来源于 pUC19 载体。因此，用于 pUC19 载体测序的通用引物都可以使用。 Q-4 pMDTM19-T Vector与pMDTM18-T Vector相比有何不同？ A-4 pMDTM19-T Vector与pMDTM18-T Vector相比，β -半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的
B）结 果 使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5×108 cfu/μg pUC19 DNA。
Control Insert
连接/转化效率 （cfu/μg Vector）
白色菌落比率（%）
效率（%）*
＋
2.8×106
96.3
90 以上
－
2.2×105
4）全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
4）全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
pMD19-T载体说明书
TaKaRa Code：D102ApMD®19-T Vector宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保 存 1●纯 度 1●用 途 1●pMD®19-T Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD ®19-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。
本载体由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。
此外，本制品中的高效连接液Solution I 可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。
本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control 反应。
本载体与pMD ®18-T Vector 相比，本制品的 β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。
因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。
●制品内容pMD ®19-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支 Control Insert（50 ng/μl）10 μl×1支 Solution I*75 μl×2支* 使用时请于冰中融解。
●保存： -20℃●纯度■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA 片段。
TAKARA植物DNA提取试剂盒说明书
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 M
1.0 kbp 0.5 kbp
2.0 kbp
PCR 反应液 4 μl，1％ Agarose 电泳，M：Wide-Range DNA Ladder（50～10,000 bp） 图 3 以提取的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增的电泳图
图 1 从植物组织中提取的基因组 DNA 电泳图 -2-
表 1 从植物组织中提取的基因组 DNA 纯度*
样品名称
样品量
Sample No.
A260/A280
A260/A230
20 mg
1
拟南芥幼芽
2
3
50 mg
4
2.2
1.4
2.2
1.4
2.1
1.7
2.1
1.7
20 mg
5
6
西红柿幼芽
7
50 mg
8
图 5 以提取的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增的电泳图
注：长时间存放可能会有夹杂物沉淀，尽量迅速进入 下一步操作。
12. 12,000 rpm 4℃离心 10 分钟。 13. 弃上清，注意不要吸取沉淀。
注：沉淀有时肉眼看不见。
14. 加入 1 ml 70％乙醇，清洗沉淀。 15. 12,000 rpm 4℃离心 3 分钟。 16. 弃上清，注意不要吸取沉淀。 17. 沉淀干燥，加入适量 TE Buffer（约 20 μl）溶解沉
2. 取出冻结的植物组织于室温放置 5 分钟左右，使其融解。 3. 轻微离心，将植物组织收集在 Microtube 底部。 4. 使用 Pipet Tip 尖端将植物组织按压 Microtube 底部 10 次左右，进行物理破碎。 5. 加入 400 μl 的 Extraction Solution 1，剧烈振荡 5 秒钟。如果植物组织仍滞留于 Microtube 底部，
pMD18-T载体说明书
TaKaRa Code：D101ApMD®18-T Vector宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保 存 1●纯 度 1●用 途 1●pMD®18-T Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD®18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。
本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。
此外，本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。
本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control反应。
●制品内容pMD®18-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支Control Insert（50 ng/μl） 10 μl×1支Solution I* 75 μl×2支* 使用时请于冰中融解。
●保存：-20℃●纯度■ Control Insert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。
●用途■ 进行TA克隆，克隆PCR产物。
■ 对克隆后的PCR产物使用Bca BEST TM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。
胶回收攻略
胶回收攻略一、这个回收小片断,我还比较在行,我以前的片断只有100bp市售的试剂盒常常有小片断回收效率很低的问题。
PCR产物经过酶切、回收等步骤后，损失太大。
进入连接反应的PCR片断量太小常常是试验失败的原因。
我的做法是，简化步骤、减少核酸在处理过程中的损失，让较多量的PCR产物和质粒片断进入酶连反应——以量取胜。
我的做法是很粗放型的，但是成功率很高。
如果愿意，你可以试试。
大致的做法是：制作100微升PCR产物；酒精沉淀回收PCR产物；PCR产物及载体酶切；跑回收胶；将回收胶上的PCR产物和载体片断切下，回收到一个试管中；冰冻、碎胶，酚、氯仿抽提，酒精沉淀；加入8微升水、1微升连接酶和1微升连接buffer，4度过夜；转化涂板。
具体的操作：PCR产物回收1. 制备100μL PCR产物。
2. 将100μL PCR产物加入一1.5mL离心管中，再加入400μL双蒸水，颠倒混匀。
加入 900μL 预冷无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。
颠倒数次混匀。
（提示本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。
）3. 4℃静置30分钟，以利于核酸沉淀。
4. 12000rpm 4℃离心15分钟，沉淀核酸。
5. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。
室温下吹风干燥。
（提示可将试管至于超净台吹风干燥。
如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。
）酶切直接在回收PCR产物的试管中配置酶切体系：PCR产物酶切－制作插入片断10×Buffer 6μLSal I 5μLPCR产物——双蒸水 49μL合计 60μL要将PCR产物接入的质粒载体A，取A质粒（小提的质粒即可）3μL进行酶切。
A质粒酶切－制作载体片断10×Buffer 3μLSal I 1μL质粒 3μL双蒸水 23μL合计 30μL混匀。
37℃，酶切3小时。
1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。
pMD18-T使用说明书(附序列)
-4-
MEMO
-5-
技术咨询热线：
0411-87641685，87641686 8008909508，4006518769
宝生物工程（大连）有限公司
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●制品说明
pMD®18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。本载体由pUC18 载体改建而成， 在pUC18 载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切 反应后，再在两侧的 3＇端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物 的 3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 由于本载体以 pUC18 载体为基础构建而成，所以它具有同 pUC18 载体相同的功能。此外，本制品中的高 效连接液 Solution I 可以在短时间内（约 30 分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大 大方便了实验操作。本制品中的 Control Insert（500 bp）还可以用于 Control 反应。
2）加入 5 μl（等量）的 Solution I。 3）16℃反应 30 分钟。
注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ③ 长片段 PCR 产物（2 kbp 以上）进行 DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。
●使用注意
1. Solution I 请于冰中融解。 2. 克隆时使用的 Insert DNA 片段（PCR 产物）建议进行切胶回收纯化，否则 PCR 产物中的短片段
DNA凝胶回收方法
DNA凝胶回收方法
一、材料：
1.5ml的离心管，离心管架
二、设备：
移液枪，离心机
三、试剂：
溶胶液，75%乙醇
四、操作步骤：
1. 切胶回收后，称重，在离心管中用1ml的枪头捣碎。
2. 加入等体积的溶胶液（如胶为100mg，则加100ul的溶胶液），颠倒混匀。
3. 55℃恒温加热直到凝胶完全融化（约10分钟）,每隔2-3分钟需将管内混悬液混匀一次，以加速凝胶溶解。
4. 加入到回收柱中，室温放置1分钟。
5. 12000rmp离心1分钟，倒弃收集管中的液体。
6. 在DNA回收柱中，加入700ul的75%的乙醇，倒弃收集管中的液体。
7. 重复步骤6。
8. 12000rmp离心1分钟，除去残留的液体。
9. 室温放置5-10分钟，让残留的乙醇充分挥发。
10. 将DNA回收柱置于1.5ml的离心管上，加入30ul的洗脱夜（TE缓冲液），放置1分钟，12000rmp离心1分钟，所得的液体即为回收的DNA。
takara反转录试剂盒说明书
takara反转录试剂盒说明书说明书一、产品简介takara反转录试剂盒是一种高效、可靠的反转录试剂盒，适用于转录RNA为cDNA的实验操作。
本试剂盒由takara公司制造，经过严格的质量控制，确保产品的稳定性和可靠性。
二、试剂盒组成本试剂盒包含以下组分：1. 反转录酶：高效反转录酶，能在广泛的实验条件下进行反转录反应。
2. 基质：提供反应所需的核酸和其他辅助物质。
3. 标记物：用于标记反转录产物的荧光染料或放射性同位素。
4. 缓冲液：维持试剂盒中酶的活性，调节反应条件的缓冲体系。
5. 控制样品：用于检验试剂盒的反应效果和稳定性。
三、实验操作1. 准备工作在进行实验前，请准备所需的实验仪器和试剂，确保实验环境的清洁和无菌，避免污染对实验结果的影响。
2. RNA提取使用适当的方法提取目标RNA样本，并在提取过程中避免RNA的降解。
3. 反转录反应将提取的RNA样本与反转录试剂盒中的反转录酶、基质和缓冲液按推荐比例混合，并在适当的温度下进行反应。
反应时间根据样本的RNA含量和实验要求确定。
4. 停止反应通过停止反应来终止反转录反应，一般使用热敏感性酶来达到这个目的。
5. 产物处理反转录产物可以直接用于下游实验，如实时定量PCR、聚合酶链式反应等，也可以进行储存和后续处理。
四、实验结果解读根据试剂盒的使用目的和实验设计，对反转录产物进行相应的分析和解读。
常见的分析方法有凝胶电泳、实时定量PCR和测序等。
根据实验结果，可以得到RNA的表达情况、差异表达基因等相关信息。
五、注意事项1. 试剂保存：请按照试剂盒上的说明保存试剂，避免暴露在高温、冻融循环和光照等不利条件下。
2. 操作规范：请按照本说明书中提供的实验操作步骤进行操作，避免实验误差对结果的影响。
3. 质量控制：在每次实验中，请使用合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
4. 废弃物处理：请将使用过的试剂和实验废弃物按照相关规定进行处理，避免对环境造成污染。
TaKaRa 提取RNA说明书
TaKaRa Code N0.9769 TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extration Kit 说明书
一、制品说明
本试剂盒是小量提取植物组织Total RNA 的试剂盒。
试剂盒采用了独特的裂解系统，可以对各种简单的植物材料（叶片、茎、幼苗等）富含多糖多酚的植物组织材料（果实、种子）、真菌等进行RNA的提取，适用范围广。
按照标准流程使用本试剂盒可以有效提取分子量大于200nt的RNA，也可以按照可选步骤提取得到包含Small RNA（＜200nt）的Total RNA。
试剂盒中包含了RNA提取所需的全部是局，无需额外购买其他试剂。
本试剂盒具有高效、快速、方便的特点，组织或自爆裂解后，提取操作仅需要30min 便可完成操作。
提取过程中无需苯酚氯仿抽提等步骤。
利用该试剂盒提取的RNA纯度高，基本不含蛋白质及及基因组DNA污染。
本试剂盒可以从50mg—100mg植物组织中纯化得到多至数十微克的高纯度RNA。
提取得到的RNA可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、Real Time PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。
二、制品内容（50次量）
本试剂盒分两部分|Part 1和Part 2。
Takara说明书
Code No. RR047A 研究用PrimeScript TM RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ●Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。
为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。
但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。
在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。
而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。
Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。
同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA 合成的全过程。
使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR®Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）、Premix Ex Taq（Probe qPCR）等定量试剂组合使用。
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Code No. 9762 研究用TaKaRa MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit Ver.4.0说明书v201306Da目录内容页码●制品说明1 ●制品内容1 ●保存与运输1 ●使用前的准备事项1 ●操作方法1 ●使用例3 ●注意事项3 ●Q&A 4●制品说明本试剂盒是从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段的试剂盒。
试剂盒采用了独特的凝胶溶解Buffer,其具有较强的缓冲性能并含有pH指示剂,方便判断溶液的pH值是否适合与DNA制备膜结合,其溶胶能力很强,无需加热,在室温(15-25℃条件下即可快速溶解凝胶。
本试剂盒结合DNA制备膜技术,具有高效、快速、方便之特点,全套操作只需20分钟便可完成。
使用本试剂盒每次可纯化得到多至20 μg以上的DNA片段(50 bp~20 kb,回收率高达50~80%,20~50 kb的DNA片段回收率略低。
经本试剂盒回收纯化的DNA片段纯度高,完整性好,可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。
●制品内容(50次量每次处理的胶块量约为300 mg(1%凝胶浓度时,本试剂盒可使用50次。
本试剂盒分试剂Set与Column Set两部分。
■试剂SetBuffer GM*1 50 mlBuffer WB*2 24 mlElution Buffer 2 ml ×2*1含有强变性剂,应避免与皮肤、衣物等接触。
若不小心接触到眼睛或皮肤时,请立即到医院进行处理。
*2首次使用前,向Buffer WB中添加56 ml的100%乙醇。
■Column SetSpin Columns 50支Collection tubes 50支【试剂盒之外所需准备试剂】◆无水乙醇◆灭菌水或Tris-HCl(pH8.0◆ 3 M醋酸钠溶液(pH5.2●保存与运输1. 本试剂盒可以在室温下(15-25℃保存。
2. 本试剂盒于室温下(15-25℃运输。
3. 低温状态下Buffer GM可能会出现沉淀,使用前请于37℃加热至沉淀消失并恢复至室温后使用。
●使用前的准备事项1. 首次使用前,向Buffer WB中添加56 ml的100%乙醇。
2. 检查Buffer GM是否仍为黄色。
3. 试剂中含有变性剂,操作时应佩戴手套等防护用具。
●操作方法操作流程见图1,全套操作约需20分钟,详细说明如下。
1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶,然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶,尽量减小凝胶体积,提高DNA回收率。
胶块超过300 mg时,请使用多个Column 进行回收,否则严重影响收率。
注切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下,以防止DNA损伤。
-1-3. 切碎胶块。
胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块溶解时间,提高DNA回收率。
4. 称量胶块重量,计算胶块体积。
计算胶块体积时,以1 mg=1 μl进行计算。
5.向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM,Buffer GM的加量如下表:6.均匀混合后室温15-25℃溶解胶块(胶浓度较大或比较难溶时可以在37℃加热。
此时应间断振荡混合,使胶块充分溶解(约5~10分钟。
注胶块一定要充分溶解,否则将会严重影响DNA的回收率。
高浓度凝胶可以适当延长溶胶时间。
7.当凝胶完全溶解后,观察溶胶液的颜色,如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色,向上述胶块溶解液中加入3 M醋酸钠溶液(pH5.210 μl,均匀混合至溶液恢复黄色。
当分离小于400 bp的DNA片段时,应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
8.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9.将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中,12,000rpm离心1分钟,弃滤液。
注如将滤液再加入Spin Column中离心一次,可以提高DNA的回收率。
10.将700 μl的Buffer WB加入Spin Column中,室温12,000rpm离心30秒钟,弃滤液。
注请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。
11. 重复操作步骤10。
12. 将Spin Column安置于Collection Tube上,室温12,000 rpm离心1分钟。
13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上,在SpinColumn膜的中央处加入30 μl灭菌蒸馏水或Elution Buffer,室温静置1分钟。
注将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。
14. 室温12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。
如果实验室备有适合于Spin Column接口的负压装置,可从上述操作步骤7以后进行以下操作。
8.将试剂盒中的Spin Column插到负压装置的插口上。
9.将上述操作步骤7的溶液转移到Spin Column中,开启调节负压装置,缓慢吸走Spin Column中的溶液(流速控制在1滴/秒。
10.向Spin Column中加入700 μl的Buffer WB,吸尽SpinColumn中溶液。
注请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。
-2- 溶液转移至将新DNA solution图1. 操作流程简图11. 重复操作步骤10,然后从负压装置上取下Spin Column ,将其安置于Collection Tube 上。
12. 室温12,000 rpm 离心1分钟。
13. 将Spin Column 安置于新的1.5 ml 的离心管上,在Spin Column 膜的中央处加入30 μl 灭菌蒸馏水或Elution Buffer ,室温静置1分钟。
注将灭菌蒸馏水或Elution Buffer 加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。
14. 12,000 rpm 离心1分钟洗脱DNA 。
● 使用例1. 500 bp 、2 kb 、5 kb 、10 kb 的PCR 片段起始量分别为3 μg 、3 μg 、2μg 、2 μg 进行1%的琼脂糖凝胶电泳后,使用本试剂盒回收纯化各DNA 片段,然后取1/10量进行琼脂糖凝胶电泳,其结果见图2,回收率高达60%以上。
1% Agarose凝胶电泳M1:DL2,000 DNA Marker1:切胶回收前的500 bp 的DNA 片段 2:切胶回收后的500 bp 的DNA 片段 3:切胶回收前的2 kb 的DNA 片段 4:切胶回收后的2 kb 的DNA 片段 5:切胶回收前的5 kb 的DNA 片段 6:切胶回收后的5 kb 的DNA 片段7:切胶回收前的10 kb 的DNA 片段 8:切胶回收后的10 kb 的DNA 片段M2:λ–Hin d Ⅲ digest M3:pUC119 DNA2. 18 kb 的PCR 片段起始量为4 μg 进行1%的琼脂糖凝胶电泳后,使用本试剂盒回收纯化DNA 片段,然后取1/10量进行琼脂糖凝胶电泳,其结果见图3,回收率高达50%以上。
M 1 2 MM :λ–Hin d Ⅲ digest1:切胶回收前的18 kb 的DNA 片段 2:切胶回收后的18 kb 的DNA 片段● 注意事项1. 使用前请确认Buffer WB 中是否加入指定体积的乙醇。
2. 切胶时切忌胶块过大,应尽量减小凝胶体积,否则会影响DNA 收量。
3. DNA 需长期保存时,建议在Elution Buffer 中保存。
4. 纯化的DNA 用于DNA 序列分析时,最好使用灭菌水洗脱DNA 。
-3-M1 1 2 3 4 5 6 7 8 M2 M3 图2. DNA 片段回收电泳图图3. DNA 片段回收电泳图● Q&A Q1. 回收 DNA 时，一般使用多少洗脱液洗脱？ A1. 可以根据所需浓度计算使用洗脱液的体积，一般情况下，洗脱液体积大于30 μl 即可洗脱 Column 上90%以上的 DNA（但要注意洗脱液需直接加至膜中央），所以洗脱液体积最好大于30 μl，当对 DNA 浓度要求较高时，也可以适当减少洗脱液体积至20 μl，但回收率会略有下降，应注意使用预热的洗脱液洗脱，并在洗脱离心之前静置 1 分钟以上，以提高洗脱效率。
Q2. 本试剂盒一次可以回收的 DNA 量的范围是多少？A2. 本试剂盒中 Column 一次回收的最大吸附量可达20 μg 以上，最小 DNA 起始量也可低至 500 ng，所以使用前请对 DNA 样品的总量进行估算。
Q3. DNA 的收量较低，为什么？ A3. 一般情况下，DNA 的回收率可以达到 50-80%。
DNA 收量较低时，可以从以下几个方面考虑：①胶块体积过大，单个 Column 可以承载的凝胶体积最好小于 300 mg，大于 300 mg 的凝胶，请使用多个 Column 进行回收，否则收率较低。
②使用请确认 Buffer WB 中是否加入了指定体积的乙醇。
③溶胶未完全。
溶胶时注意观察胶块是否完全溶解，胶块未完全溶解会严重影响收量。
溶胶时，间断颠倒混匀溶胶液有助于胶块的快速溶解。
④溶胶液 pH 值过高。
溶胶后注意观察溶胶液颜色，若溶胶液的颜色由黄色变为橙色或粉色表明溶胶液的 pH 值过高，会造成 DNA 收量较低，此时应向溶胶液中加入 3 M 醋酸钠（pH5.2）10 μl,混合后至溶胶液颜色变回黄色时，再将溶胶液转移至 Column 上进行后续操作。
⑤使用离心方法时，注意要在常温下离心，使 DNA 更好地和 Column 上的膜结合。
⑥洗脱前的空离步骤不可省略，此步骤可以除去 Column 上残留的洗液中的乙醇，否则影响洗脱效率。
⑦洗脱时将灭菌蒸馏水或 Elution Buffer 加热至 60℃后使用有利于提高洗脱效率。
Q4. 长片段 DNA 回收时应该注意哪些问题？ A4. 当DNA 片段长度较长（10 kb 以上）时，回收效率会有所下降，这是 DNA 切胶回收时的常见现象。
此时建议按以下方法解决问题：①适当增加待回收 DNA 样品的添加量（如起始量加至 2～5 μg）。
②由于长片段 DNA 不易从滤膜上洗脱下来，建议使用加热至 60℃的 Elution Buffer 洗脱 DNA，可以提高回收效率。
③减少操作过程中对长片段 DNA 的物理损伤：如振荡混合操作不要过于剧烈，切胶时不要将 DNA 长时间暴露于紫外灯下，在进行电泳时可以使用 6×Quadricolor-loading Buffer（Code No. 9171）判断核酸的迁移情况，避免使用紫外灯反复照射观察核酸迁移情况。