PCR产物胶回收实验
1.4 胶回收PCR产物(纯化)
一、目的基因的扩增
（四）、PCR产物的提纯
实验目的：
回收得到纯的目的DNA，去除影响DNA连接酶活性的物质及其它DNA片段。
纯化产物用于酶切和连接反应。
主要实验仪器：
冰箱，为试剂、样品或菌种提供冷冻、冷藏的保存环境制冰机，用于制备碎冰块
微量移液器，用于吸取微量试剂及样品
超净工作台，提供无菌工作台面
常温离心机，用于样品的常温离心分离
核酸电泳仪，用于核酸的电泳分离分析
主要实验室剂：
酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、70％乙醇、TE。
实验步骤：
将PCR反应液转入1.5ml离心管中，加入50ulTE和100ul 酚/氯仿/异戊醇，盖好离心管盖子，上下颠倒混匀。
将管置于离心机中，12000rpm离心5min。
取上清，加入1/10体积3mol醋酸钠和2.5倍体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，室温放置20min沉淀DNA。
将管置于离心机中，12000rpm离心10min。
离心后现象：（图片）。
弃上清，加入1ml70％乙醇，12000rpm离心5min。
离心后现象：（图片）。
弃上清。
将管口打开，倒置于纸巾上数秒，使液体尽可能流尽，再平放于纸巾上室温干燥10min。
加30ulTE溶解沉淀，取5ul样品跑电泳。
电泳图谱为：（图片）。
确认回收到PCR产物后，剩余样品置于-20℃冰箱中备用，用于酶切。
END。
PCR-RFLP实验设计经典方案(1)
【思考题】 1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率？
实验六 PCR产物的胶回收分离纯化
满朝来
哈尔滨师范大学生命科学与技术学院 生化与分子生物学教研室
一、实验目的
1、了解分离纯化DNA片段中的污染物方法和原理。
2、掌握PCБайду номын сангаас产物纯化的实验技术，为后续的连接 反应和转化反应打下良好的基础。
二、实验原理
首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段， 分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目 的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收 纯化DNA片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊 硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、 专一地吸附DNA、RNA的原理，配备设计独 特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速 离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸 片段。
【仪器与试剂】 一、实验仪器 1、琼脂糖凝胶电泳系统 2、紫外观察分析仪 3、离心机 4、单面刀片 5、恒温水浴锅
二、试剂
1、 DNA回收试剂盒 2、50×TAE 3、ddH2O
三、实验步骤
1）在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖．放入1.5ml 离心管中。 2） 按每100mg琼脂糖加入300—600μl 溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加 500ul），置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一 次促溶。 3）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管 中的液体．再将吸附柱放入同一个收集管中。 4）在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后， 12000rpm 室温离心30 秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 5）再在吸附柱中加入500uI漂洗液， 12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中 的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 6） 12000rpm 室温空离心1分钟。 7）将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓 冲液，室温静置2分钟后， 12000rpm 室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗 脱一次），将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。 8）琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。
PC产物的回收与鉴定
PC产物的回收与鉴定PCR产物的回收（胶回收试剂盒）1、胶回收的目的（1）去除非特异性扩增的产物（2）去除多余的底物（3）去除多余的Taq酶（4）得到目的片段2、胶回收的过程（1）切胶：紫外下切胶，称重。
之后用枪头将胶块捣碎。
切胶的刀片最好选用一次性刀片，实验台等也尽可能用乙醇擦拭干净。
可通过空EP管与装胶EP管质量的差值计算胶的质量。
注意切胶时尽可能避免切到条带外的凝胶，且避免紫外时间过长。
别忘记胶条有厚度，前后多余的部分也尽量切除。
如果感觉手感不好，可以试试切胶神器：（2）溶胶：每1mg胶加入1μL膜结合液（MB），按比例1:1加入MB，55℃水浴溶解。
每1—2min震荡混匀，待溶解后至少在水浴中保持1—2min，保证胶块完全溶解。
在电泳过程中，DNA会与大分子的多糖紧密结合，凝胶的种类和质量不同，DNA与之结合力也不同，只有凝胶充分溶解DNA才能充分释放。
否则，凝胶将与DNA一起沉淀下来，洗脱后将影响回收结果的纯度。
（3）结合：将溶胶转移至纯化柱内，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将纯化柱重新插回收集管中。
胶块完全溶解后最好将胶液温度降至室温再上柱，因为纯化柱在温度较高时结合DNA的能力较弱。
离心时注意对称放置离心管。
（4）漂洗：向纯化柱正中加入600μL漂洗液（预先加过无水乙醇），12000rpm离心30s，去除废液。
重复一次后，将纯化柱开盖离心2min，彻底去除残余漂洗液中的乙醇。
纯化柱正中为硅基材料，在高盐环境下能够吸附DNA，在低盐环境下能够释放DNA。
漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶切、PCR等实验。
（5）洗脱：将纯化柱置于1、5mL离心管中，向纯化柱正中加入30μL洗脱缓冲液或无菌水，放置1min后，12000rpm离心1min，洗脱DNA。
务必将洗脱缓冲液或无菌水加入纯化柱正中，若沾在管壁上，一定要震动离心管，使液体滑落到管底，以便被纯化柱吸收。
（6）保存：将获得的DNA片段于-20℃保存，或直接用于后续实验。
分子生物学实验课：胶回收-质粒提取-双酶切
子内部中央，放置2分钟，离心1分钟。收集管中的溶液即为已纯化的 GAPDH基因DNA片段。
连接
• 1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全 量为5 μl。
鉴定正反
• TA克隆有两种插入方式，造成正反向 • 常规PCR使得3’端多出一个A碱基
5’ nnnnnnnnnnA 3’ 3’ Annnnnnnnnn 5’
pMD®18-T Vector图谱
酶切鉴定
• 1. 建立酶切反应体系：
DNA
<=1μg
10Xbuffer2
3.0μl
10XBSA
3.0μl
• 42°C下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会 被细胞吸收。
• 进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗 传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可 筛选出转化子。
转化步骤
• 1. 于超净台中取连接产物10μl与100μl大肠杆菌感受态细胞 混合，置冰浴中30分钟。
C：溶液浓度(单位，mol/L) L：光路长度(单位，cm)
核酸纯度分析
• A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长 • A260/A280比值可进行核酸样品纯度评估：
理论上，纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的 A260/A280比值为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳 香族）或酚类物质的污染，依据具体实验要求，考虑是否 纯化样品。
沉淀。 • 10,000g 离心1分钟，弃残液。 • 用500μl HB buffer 洗柱，10,000g 离心1分钟，去残液。 • 用700μl DNA wash buffer (乙醇稀释)洗柱，10,000g离心1分钟，去
pcr切胶回收的步骤
pcr切胶回收的步骤
PCR切胶回收呀，这可是个很有趣的小实验呢。
先说说准备工作吧。
你得有已经跑过PCR并且经过琼脂糖凝胶电泳的胶块哦。
然后呢，把要用的工具都准备好，像干净的刀片啦，还有专门的切胶回收试剂盒。
开始切胶啦。
在紫外灯下看胶块的时候，就像寻宝一样呢。
找到你要的那条DNA 条带，然后用刀片小心翼翼地把它周围的胶切下来。
可别切太大块啦，不然会有好多杂质的。
切的时候就像在给小宝贝做精细的手术一样，要很小心哦。
切好胶之后，就按照试剂盒的说明来操作啦。
一般是把切下来的胶放到一个离心管里，然后加入一些溶液，让胶融化。
这时候你就看着胶慢慢变成液体，感觉就像魔法一样呢。
接着呢，要把融化后的液体加到吸附柱里。
这个吸附柱就像一个小卫士，专门把DNA吸附住，而那些杂质就被留在外面啦。
把液体加进去之后，离心一下，就像坐小过山车一样，让液体在离心力的作用下快速通过吸附柱。
然后呢，要清洗一下吸附柱。
这一步就像是给小卫士洗个澡，把它身上可能残留的杂质都洗干净。
再离心一下，把清洗的液体甩掉。
最后就是把我们想要的DNA从吸附柱上洗脱下来啦。
加入洗脱液，再离心，这个时候我们的DNA就乖乖地跑到洗脱液里啦。
就像把小宝贝从保护它的小房子里接出来一样。
这样，PCR切胶回收就完成啦。
虽然过程有点小复杂，但是只要按照步骤来，就可以得到我们想要的纯净的DNA啦。
每次做这个实验都感觉像是在和小小的DNA分子玩一场有趣的游戏呢。
PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接) PCR实验技术
PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接)
【实验原理】
1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。
商品化的T载体有很多。
本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。
这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
【试剂与器材】
（一）试剂
1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液
3.琼脂糖（Agarose）
4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
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PCR产物胶回收实验
实验六 PCR产物胶回收实验（一）一、实验目的1. 掌握胶回收的常规操作2. 了解胶回收PCR产物的目的二、实验原理利用胶回收试剂盒纯化PCR产物。
本试剂盒提供一个从TBE或TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度≤3%，高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp~23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%~55%，0.1~10kbDNA片段回收率最大为99%，大于10kbDNA片段回收率为20~70%。
回收的基因组DNA可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学实验。
三、试剂及配套设备和材料3.1 试剂Extraction buffer Wash buffer Elution buffer3.2 配套设备和材料无菌1.5ml离心管各种规格移液器和无菌移液器吸头无水乙醇异丙醇可能需要3M KAc (pH 5.0) 离心机四、基本技术参数1. 用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5或2.0 ml离心管中。
请尽量切去不包含DNA片段的凝胶。
一般情况下，电泳的DNA上样量≥50 ul（50ul为最终洗脱体积）。
2. 按1：3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入Extraction buffer。
例如：100mg凝胶应加入300ul Extraction Buffer。
对于每人份试剂用量，凝胶质量不能超过400mg。
3. 于恒温水浴或金属浴中50℃温育，直到凝胶融化。
一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔23分钟混匀一次。
如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入10 ul 3M KAc （pH 5.0），使混合液颜色变回黄色。
4. 可选：按1：1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混合均匀。
如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加异丙醇。
5. 将混合液全部转移到Spin column内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内液体。
质粒或PCR酶切产物切胶回收
质粒或PCR酶切产物切胶回收实验材料实验耗材：枪头（10μl、200μl、1ml）、EP管(200μl、1ml)试剂：普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根）、ddH2O准备工作：50˚C加热块、质粒或PCR酶切产物、PCR产物实验操作步骤：使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇。
1. 柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使用当天处理过的柱子）2. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
3. 向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 µl，则加入100 µl PN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。
注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。
4. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
注意：吸附柱容积为800 μl，若样品体积大于800 μl可分批加入。
5. 向吸附柱CA2中加入600 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW 加入后静置2-5 min再离心。
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实验六 PCR产物胶回收实验
一、实验目的
1. 掌握胶回收的常规操作
2. 了解胶回收PCR产物的目的
二、实验原理
利用胶回收试剂盒纯化PCR产物。
本试剂盒提供一个从TBE或TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度≤3%，高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp~23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%~55%，0.1~10kbDNA片段回收率最大为99%，大于10kbDNA片段回收率为20~70%。
回收的基因组DNA可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学实验。
三、试剂及配套设备和材料
3.1 试剂
Extraction buffer Wash buffer Elution buffer
3.2 配套设备和材料
无菌1.5ml离心管各种规格移液器和无菌移液器吸头
无水乙醇异丙醇可能需要3M KAc (pH 5.0) 离心机
四、基本技术参数
五、操作步骤
1. 用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5或
2.0 ml离心管中。
请尽量切去不包含DNA片段的凝胶。
一般情况下，电泳的DNA上样量≥50 ul （50ul为最终洗脱体积）。
2. 按1：3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入Extraction buffer。
例如：100mg凝胶应加入300ul Extraction Buffer。
对于每人份试剂用量，凝胶质量不能超过400mg。
3. 于恒温水浴或金属浴中50℃温育，直到凝胶融化。
一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔2-3分钟混匀一次。
如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入10 ul 3M KAc （pH 5.0），使混合液颜色变回黄色。
4. 可选：按1：1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混合均匀。
如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加异丙醇。
5. 将混合液全部转移到Spin column内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内液体。
如混合液体积大于750ul可先转移750ul，其余的液体待离心弃液后，再转移。
6. 向Spin column内加500ul Extraction Buffer，于12，000g离心30~60秒，并弃去接液管内液体。
7. 向Spin column内加750ul Wash Buffer，于12，000g离心30~60秒，并弃去接液管内液体。
如果回收的DNA片段将用于盐浓度敏感的实验，请在加入Wash buffer后静置2~5分钟，再离心。
8. 再次于12,000 rpm离心1分钟，然后将spin column转移到无菌的1.5ml离心管中。
如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。
9. 向Spin column内加50ul Elution Buffer、水或TE溶液，并于室温静置1分钟。
可根据实验的实际需要决定Elution Buffer用量。
但不要低于20ul。
10. 于12，000g离心1分钟，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段。
回收的DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20℃。
六、注意事项
1. 为了保证没有外源DNA的污染，电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌。
2. 为了减少胶的体积，我们可以用相对比较薄的胶来跑电泳，这样可以减少回收试剂引起的一些后续麻烦。
2. 在洗脱前，将洗脱液于30~60℃温浴，可提高提取效率。
七、思考题
1. 简述影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素。
2. 简述PCR上样缓冲液（loading buffer）的成分及其作用。