生物学实验之凝胶回收基础及操作
生物化学实验@层析技术分离生物大分子(凝胶过滤)
4、蛋白质混合样品的分离
吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面）。打开出水口，使残 余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用移液枪 吸取标准蛋白溶液0.5mL ，小心地绕柱壁一圈（距离胶面2mm）缓 慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，同时打开恒流泵 （开始收集！），开始记录！待溶液渗入胶床后，关闭出水口， 用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后 用3-5mL/10min的速度开始洗脱，同时用核酸蛋白检测仪测定 A280，自动收集器收集时间为10min每管。最后作出洗脱曲线 （由记录仪完成）。
层析技术公式
分配系数
Ve – Vo Kav=
Vt - Vo Vt——层析床总体积 Ve——洗脱液体积 Vo——外水体积 分子量大，全排出 分子量中 分子量小，进入内部
Ve= Vo Ve= Vo+ KavVi Ve= Vo+ Vi
Kav=0 0< Kav<1 Kav=1
二、各类凝胶的结构和性能
1.
葡聚糖凝胶（Sephadex）
SephadexG50、 SephadexG75、 SephadexG100、 2.琼脂糖凝胶（sepharose） Sepharose2B、4B、6B 3.聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel-p）
4.sephacryl (交联葡聚糖和双丙烯酰胺共聚）
凝胶层析分离蛋白质
本次试验分两次完成。 1、讲解技术原理，装柱练习，连接装置等。 2、上样分离，打印图谱等。
生物大分子制备方法基本设计思路
爱思进胶回收说明书
爱思进胶回收说明书
爱思进胶回收试剂盒的使用说明书如下：
1. 制备琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据Marker 判断PCR产物的大小是否符合要求。
2. 切胶：切下包含目的片段的凝胶，尽量切去上下两端的凝胶，以减少非特异性产物的影响。
3. 胶的融化：将切下的凝胶放入一个离心管中，加入适量的胶融化液，使凝胶完全溶解。
4. 洗涤：将凝胶溶液加入一个离心柱中，离心柱的管底会有一个膜，可以吸附凝胶中的DNA片段。
然后加入洗涤液，将离心柱离心，去除残留的胶融化液。
5. 洗脱：加入适量的洗脱液，离心柱离心，将DNA从膜上洗脱下来。
6. 检测：取洗脱液进行电泳检测，观察电泳结果是否包含目的片段。
以上是爱思进胶回收试剂盒的使用说明书的大致步骤，由于不同版本的产品可能存在差异，因此建议在使用前仔细阅读说明书或咨询专业人士。
组织DNA的提取及凝胶回收
回收的DNA片段
DNA分子的体外连接
pUC18 和 pUC19质粒图谱
• pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的质粒 载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的 DNA 片段， GenBank注册号为 L08752(pUC18)和 X02514(pUC19)。 由 pBR322 改造而来，其中 lacZ (MSC)来自 M13 。
• 这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的 排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的 rop 基因，因 此其拷贝数达 500-700 。 pUC 系列载体含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表 现 alpha-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片 段后，可通过alpha -互补作用形成的蓝色和白色菌落筛 选重组 质粒。
• pMD19- T Vector与pMD18- T Vector相比，pMD19- T Vector的β半乳糖 苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。因 此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白斑筛选。
质粒DNA限制性酶切 图谱分析
点击此处添加正文，文字是您思炼，为了演示发布的 良好效果，请言简意赅的阐述您的观点。点击此处添 加正文，请言简意赅的阐述您的观点。
• 由于这两种载体是分别以pUC18、pUC19载体为基础构建而成，所以它具有 同pUC18、pUc19载体相同的功能。此外，这两种制品中的高效连接液 Ligation Mix可以在极短时间内（-5min）完成连接反应，且此连接液可以直 接用于细菌转化，大大方便了实验操作。制品中的 Control Insert 500bp） 还可以用于 Control示发布的 良好效果，请言简意赅的阐述您的观点。点击此处添 加正文，请言简意赅的阐述您的观点。
胶回收
除了选择合适的方法外,实验中还要注意以下几点:(1)防止抽提过程中污染DNA酶与回收片段接触的试剂与器皿等都应进行灭菌(酶)处理,即使是不能用干热或湿热法灭菌的器皿也要用乙醇浸泡以灭杀活菌与DNA酶,不然可能发生回收片段部分降解的现象,有时甚至一无所获.即使是轻微的降解反应——当发生在粘性末端时也会导致严重的连接困难.(2)紫外照射选择长波段回收过程往往需在紫外等监测下进行,与一般观察电泳结果不同的是这时应用长波紫外灯.因为短波紫外线(254nm)会引起DNA的断裂或是形成TT二聚体,前者会使以后的连接与转化等实验失败,后者可能造成基因突变,给克隆工作带来麻烦.即使是使用了长波紫外照射,回收DNA时也要尽量短时照射,避免连续长时间照射.(3)实验操作要轻柔特别在处理较大片段时应防止机械剪切作用DNA对的破坏,如吸取液体,转动离心管等操作均应缓慢,轻柔.综上所述,只有在合适的回收方法基础上注意具体操作步骤是才能有效回收所需片段,为以后的酶切,连接,标记等工作打下良好基础.3 实验步骤一、试剂盒法(Kit回收法,以上海申能博彩生物科技有限公司生产的试剂盒为例)(1)从电泳板上切割含目的DNA片段的凝胶块(割胶尽可能的小,提供后续回收效率)(2)凝胶称重后并将其放入1.5ml管中,将其适当切小,加速溶解.每100mg凝胶加入400μl solution SN.(若称重省略,一般加入400μl SN)(3)凝胶溶解:55-60℃,保温5-10分钟,每2分钟混匀一下,使凝胶溶解,胶完全融化后每400μl solution SN中加入solution B 100μl,混匀.(4)将3S柱装入2ml洗管,将上述混合液转移至3S柱,室温放置2min.室温10 000 rpm离心1分钟,稳定45秒.(5)取下3S柱,倒掉收集管中的废液,将3S柱放入同一收集管中,加入600μl Wash Solution,室温10 000 rpm离心1分钟.(6)重复步骤5一次.(7)取下3S柱,倒掉收集管中废液,将3S柱放入同一收集管中,室温10 000 rpm离心2分钟.(8)将3S柱放入新的离心管中,在3S柱子膜中央加30μl ddH2O,不加盖室温放置2分钟.(9)盖上离心管,室温10 000 rpm离心1分钟,离心管中的液体即为回收的DNA片段.胶回收一. 提高胶回收量的办法：1) 增加电泳时的上样量。
分子生物学实验技术实验操作指南
《分子生物学实验技术实验操作指南》目录1 植物基因序列分析 (3)2 引物设计的原则 (4)3 试剂的配置和灭菌 (5)4 植物基因组DNA的提取 (6)5 DNA的定量 (8)6 DNA的电泳 (9)8 PCR产物的回收 (12)9 PCR产物连接T载体和感受态细胞的转化 (14)10 菌落（液）PCR (17)11 质粒DNA的提取 (19)12 质粒DNA的酶切 (21)1 植物基因序列分析1.基因组DNA（genomic DNA, gDNA）：功能基因包括三个基本序列：5’上游区，转录区和3’下游区。
2.5’上游区和3’下游区：转录起始位点上游和转录终止位点下游的序列，主要起到基因表达调控作用。
3.转录区：转录起始位点和转录终止位点之间的序列，经核不均一RNA最终被加工为成熟的mRNA。
4.信使RNA（messenger RNA, mRNA）：由DNA的一条链作为模板转录而来的，携带遗传信息的能指导蛋白合成的一类单链核糖核酸。
由编码区、上游的5’非编码区和下游3’非编码区组成，5’端带有7-甲基鸟苷-三磷酸帽子结构，3’端有多腺苷酸尾巴。
5.互补DNA（complementary DNA, cDNA）：具有与某mRNA链呈互补的碱基序列的单链DNA。
6.蛋白质编码区（sequence coding for amino acids in protein, CDS）：与蛋白质序列一一对应的DNA序列，且该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列。
只有外显子，不含内含子。
7.5’非翻译区（5’-untranslated region, 5’UTR）：mRNA位于基因转录起始位点至编码区翻译起始密码子之间顺序。
8.3’非翻译区（3’-untranslated region, 3’UTR）：mRNA位于编码区翻译终止密码子下游一段不被翻译的序列。
2 引物设计的原则1.引物长度：一般为20-25bp。
若产物长度等于或小于500bp，可选用16-18bp的引物；若产物长达5kb，则需要用更长的引物。
凝胶dna回收实验报告
凝胶dna回收实验报告1. 理解DNA凝胶电泳的原理和方法；2. 学习DNA凝胶回收的方法和步骤。
实验材料：1. DNA凝胶电泳仪；2. DNA样品；3. DNA凝胶；4. DNA染料。
实验步骤：1. 准备DNA样品：从细菌或真核生物中提取DNA并纯化。
2. 制备DNA凝胶：根据DNA样品大小选择合适的琼脂糖浓度和电泳缓冲液，将琼脂糖溶解于电泳缓冲液中，加热溶解后，在凝固前加入DNA样品，并将其转移到电泳槽中。
3. 进行DNA凝胶电泳：将DNA凝胶置于电泳仪中，接通电源，设定适当的电流和电压，进行电泳分离。
根据不同的目的和需求，可以选择不同的电泳方法，如平行电泳或垂直电泳。
4. 理解DNA凝胶图谱：观察DNA在凝胶中的迁移情况，根据分离程度和片段大小推断DNA的特性和组成。
5. 染色：使用DNA染料将凝胶中的DNA染色，以便观察和记录。
6. 回收DNA：使用切割刀将感兴趣的DNA片段从凝胶中割下，转移到离心管中。
7. 纯化和测定：使用DNA纯化试剂盒或其他方法纯化回收的DNA，并通过测序或其他技术确认其准确性和纯度。
实验结果：1. DNA凝胶图谱：根据分离情况和染色结果，可以观察到DNA片段的迁移情况和大小分布。
2. 回收的DNA样品：经过回收和纯化后，获得从凝胶中割下的DNA片段。
实验讨论：1. 实验中电泳条件的选择对于DNA凝胶分离的效果和准确性至关重要。
2. 切割凝胶时需要注意避免外源性DNA污染和片段交叉污染。
3. 回收的DNA样品需要经过纯化和测定，以确保其准确性和纯度。
实验结论：1. 通过凝胶DNA回收实验，我们可以将感兴趣的DNA片段从凝胶中割下，并进行后续的纯化和分析。
2. DNA凝胶电泳是一种常用的DNA分离和分析方法，可以用于研究DNA的大小、构成和数量。
3. 正确选择电泳条件，合理操作和纯化步骤，能够获得准确和高质量的回收DNA样品。
实验改进：1. 优化电泳条件，提高凝胶分离效果。
快速凝胶回收实验报告
一、实验目的本实验旨在通过快速凝胶回收方法，从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段，为后续的PCR扩增、酶切、连接等分子生物学实验提供高质量的模板DNA。
二、实验原理凝胶回收是分子生物学实验中常用的技术之一，主要用于从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段。
本实验采用的方法是利用琼脂糖凝胶中的DNA片段在低盐、高pH值条件下，可被特定的吸附剂（如硅胶膜、磁珠等）特异性吸附的特性，通过简单的操作步骤，将目的DNA片段从凝胶中分离、纯化。
三、实验材料1. 琼脂糖凝胶2. 目的DNA片段3. DNA回收试剂盒（含吸附剂、缓冲液等）4. 1.5 mL离心管5. 离心机6. 电泳仪7. 凝胶成像系统四、实验方法1. 准备琼脂糖凝胶电泳，将目的DNA片段与载体DNA混合，加入琼脂糖凝胶中，进行电泳分离。
2. 将电泳后的凝胶在紫外灯下观察，确定目的DNA片段的位置。
3. 使用DNA回收试剂盒中的吸头，将目的DNA片段从凝胶中剪下。
4. 将剪下的凝胶片段放入1.5 mL离心管中，加入适量的缓冲液，用吸头充分混匀。
5. 将混匀后的离心管置于离心机中，以12,000 rpm离心5分钟，使DNA片段吸附在吸附剂上。
6. 弃去上清液，用缓冲液洗涤吸附剂，重复洗涤步骤2次。
7. 将洗涤后的离心管置于离心机中，以12,000 rpm离心3分钟，使DNA片段充分沉淀。
8. 弃去上清液，加入适量的TE缓冲液，用吸头充分混匀，使DNA片段溶解。
9. 使用凝胶成像系统观察DNA片段的回收情况。
五、实验结果与分析1. 电泳结果显示，目的DNA片段成功从琼脂糖凝胶中回收。
2. 凝胶成像系统显示，回收的DNA片段大小与预期相符。
3. 回收的DNA片段纯度较高，可用于后续的PCR扩增、酶切、连接等分子生物学实验。
六、实验讨论1. 本实验采用快速凝胶回收方法，操作简便，节省时间，适用于大量样品的回收。
2. 实验过程中，应注意以下几点：a. 凝胶回收时，应确保目的DNA片段在凝胶中的位置准确。
PCR产物胶回收实验
实验六 PCR产物胶回收实验（一）一、实验目的1. 掌握胶回收的常规操作2. 了解胶回收PCR产物的目的二、实验原理利用胶回收试剂盒纯化PCR产物。
本试剂盒提供一个从TBE或TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度≤3%，高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp~23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%~55%，0.1~10kbDNA片段回收率最大为99%，大于10kbDNA片段回收率为20~70%。
回收的基因组DNA可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学实验。
三、试剂及配套设备和材料3.1 试剂Extraction buffer Wash buffer Elution buffer3.2 配套设备和材料无菌1.5ml离心管各种规格移液器和无菌移液器吸头无水乙醇异丙醇可能需要3M KAc (pH 5.0) 离心机四、基本技术参数1. 用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5或2.0 ml离心管中。
请尽量切去不包含DNA片段的凝胶。
一般情况下，电泳的DNA上样量≥50 ul（50ul为最终洗脱体积）。
2. 按1：3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入Extraction buffer。
例如：100mg凝胶应加入300ul Extraction Buffer。
对于每人份试剂用量，凝胶质量不能超过400mg。
3. 于恒温水浴或金属浴中50℃温育，直到凝胶融化。
一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔23分钟混匀一次。
如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入10 ul 3M KAc （pH 5.0），使混合液颜色变回黄色。
4. 可选：按1：1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混合均匀。
如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加异丙醇。
5. 将混合液全部转移到Spin column内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内液体。
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1. 分类
2. 应用
试剂耗材与设备
四 五
6
操作流程
常见问题解答
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生物实验培训
2.1 分类
1
• 硅胶柱法
2
• 玻璃奶/纯化填料法
• 低熔点琼脂糖法 • 透析带电洗脱法 • DEAE纤维素膜纸片法
特别是大片断的回收。
9
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2.1.3 低熔点琼脂糖法
传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，
电泳后切割目的条带，在 TE 溶液中 65 ℃保温融化，
用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。
这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇
由于绑透析带很难操作，只有在回收非常大的片断时 才会考虑的。
丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一。
11
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2.1.5 DEAE 纤维素膜纸片法
将 DEAE 纤维素膜裁成小条活化处理 。 电泳后 在目的条带前切一刀 ，将比条带略宽 的 DEAE 纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳，条 带上的 DNA 被膜片截留，取出膜片冲洗后转移 到离心管中加缓冲液 65 ℃保温洗脱，直到膜上 DNA 被完全洗脱，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。
33
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4.2 注意事项
６ . 切胶是，紫外照射时间应尽量短，以免对
DNA 造成损伤。
7. 回收 <100bp 及 >10kb 的 DNA 片段时，应 加大溶胶液的体积，延长吸附和洗脱的时间。 8. 回收率与初始 DNA 量和洗脱体积有关，初 始量越少、洗脱体积越少，回收率越低。
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目 录
一 二 三
胶回收基础知识 方法及应用
试剂耗材与设备
四 五
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操作流程
常见问题解答
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5 常见问题解答
问题 可能原因 胶溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例 胶体积太大，可用枪头捣碎，若不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收 紫外灯下切胶时间过长，导致 DNA 部分降解，应尽量把切胶时间控制 在 30s 以内 用胶回收试剂 盒从凝胶中回 收 DNA 得率低 是什么原因？ 洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率 TAE 电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致 pH 值升高，降低 DNA 和膜的吸 附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好 回收前的样品量太少，加大点样量 洗脱前，预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可 以有效提高回收率 30% 以上
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4.1 实验流程
1
2
3
将吸附柱CA2放回 收集管中
12000rpm, 离心2min
将吸附柱CA2置于 室温放置数分钟， 晾干
25
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4.1 实验流程
1
2
3
将吸附柱CA2放到 一个干净离心管中
8
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2.1.2 玻璃奶/纯化填料法
利用特殊玻璃微珠吸附
DNA 的 特 性 ， 根 据 每 次 回 收实验时预期回收量来调整
玻璃奶/纯化 填料法
纯化填料的量，使得实验不
受限于柱子的载量，也不会 造成浪费。
适合各种不同大小的片断，
1.2 胶回收原理
利用核酸在裂解 液下与硅胶膜吸
电泳后 ，切下凝胶 称重后，加入等体积溶胶液 上柱吸附DNA
附柱特异性结合，
在洗脱液条件下 被洗脱，从而达 到核酸纯化回收 的目的。
除胶 脱盐
洗脱
5
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一 二 三
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4.1 实验流程
琼脂糖凝胶制作
上样
电泳
①
在锥形瓶中加入 1mL 50xTAE 、 49mL 蒸馏水、 0.4g 琼脂糖，混匀；
①
取 1μ L 上 样 缓 冲 液 与 5μ L 产 物混匀
电泳条件： 140V ， 20min 。
23
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4.1 实验流程
1
2
3
向吸附柱CA2中 加入μ L漂洗液PW
12000rpm, 离心30~60sec
弃废液，将吸附 柱重新放回收集管 中。重复操作1,2,3
24
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胶回收基础知识 方法及应用
1. 试剂
试剂耗材与设备
2. 耗材 3. 设备
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3.1 试剂
产品组成 平衡液BL（Buffer BL） 溶胶液PN（Buffer PN） 漂洗液PW（Buffer PW) 洗脱缓冲液EB（Buffer EB）
Lane M:1kb DNA Marker Lane 1: 胶回收前的 2.7kb DNA 段 Lane 2: 胶回收后的 2.7kb DNA 段 切割 Lane 1 后，经处理回收 DNA ，
切割 回收
经电泳得到 Lane 2 。
4
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早期实验室最常用方法之一。
这个方法不适合做较大的 DNA ，因为洗脱比较 困难。
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2.2 应用
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目 录
一 二 三
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4.1 实验流程
1
2
3
将目的条带从 琼脂糖凝胶中 切下
放入干净的 离心管中
称取重量
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4.1 实验流程
1
2
向胶块中加入 等体积溶液PN
复澄清。
32
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4.2 注意事项
3. 电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电
泳和回收效果。
4. 如下一步实验要求较高，则应尽量使用 TAE 电 泳缓冲液。 ５ . 如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测 pH 值，如 pH 值大于 7.5 ，可向含有 DNA 的胶溶液 中加 10~30 μ L3M 醋酸钠（ pH5.2) 将 pH 值调制 5~7 之间。
②
放入微波炉中加热，约煮沸三次，
冷却至不烫手；
③
加入 2.5 μ LNuclleic Acid Stain 核 酸染料，轻轻摇匀，避免产生气泡，
②
垂直加入上样 孔中。
倒入已垂直插好梳子的铺胶版中，
待凝固。
29
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4.2 结果分析 —琼脂糖凝胶电泳
1. 实验流程 2. 注意事项
四 五
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常见问题解答
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4.1 实验流程
1
2
3
向吸附柱CA2柱 加入500μ L 平衡液BL
12000rpm, 离心1min
弃废液，将吸附柱 重新放回收集管中
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50℃水浴，不 断温和地上下翻 转离心管，确保 胶块充分溶胶。
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4.1 实验流程
1
2
3
将所得溶液加入 一个吸附柱CA2中， 室温放置2min
12000rpm, 离心30~60sec
弃废液，将吸附柱 重新放回收集管中
向吸附膜中间 位置悬空滴加适量 洗脱缓冲液EB， 室温放置2min
12000rpm, 离心2min 收集DNA溶液
26
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4.1 实验流程
原理：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动称为电泳。 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。
3
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2.1.1 硅胶柱法
采用可以高效、专一结合 DNA 的硅基质材料和