基础生物学实验精品课程10.ppt
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实验十生防细菌的鉴定及抗菌能力测定
01
02
03
细菌形态观察
通过显微镜观察细菌的形 态、大小、排列方式等特 征。
革兰氏染色
利用革兰氏染色法将细菌 分为革兰氏阳性菌和革兰 氏阴性菌两大类。
特殊结构观察
观察细菌的芽孢、鞭毛、 荚膜等特殊结构，以辅助 鉴定。
生理生化鉴定
生长特性测定
测定细菌的生长曲线、最 适生长温度、pH值等指标。
碳源利用试验
谢谢
THANKS
06 结论与展望
CHAPTER
结论
01
生防细菌种类鉴定
通过形态学观察、生理生化特性测定以及16S rRNA基因序列分析，成
功鉴定出实验中的生防细菌属于芽孢杆菌属（Bacillus）。
02 03
抗菌能力测定
采用琼脂扩散法和液体培养法，对生防细菌的抗菌能力进行了测定。结 果显示，该生防细菌对多种植物病原菌具有显著的抑制作用，如大肠杆 菌、金黄色葡萄球菌、枯萎病菌等。
采用牛津杯法测定生防细菌对病原菌的抑菌能力，结果显示抑菌圈直径大于15mm，表明生防细菌具有较强的抑 菌能力。
最低抑菌浓度（MIC）
通过二倍稀释法测定生防细菌对病原菌的最低抑菌浓度，结果显示MIC值为10^5 CFU/mL，表明生防细菌在较 低浓度下即可抑制病原菌的生长。
结果分析与讨论
• 生防细菌种类与数量分析：本次实验鉴定出的生防细菌属于芽孢杆菌属，该属 细菌在土壤中广泛存在且数量较多。实验结果表明，生防细菌在土壤中的数量 较高，这为其在土壤中的定殖和发挥生防作用提供了有利条件。
安全性评价
通过急性毒性试验和亚慢性毒性试验，评估了生防细菌对哺乳动物的安 全性。结果表明，该生防细菌在推荐使用剂量下对哺乳动物无明显毒性 作用。
钾离子对气孔开度的影响
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4、从植株取一叶片，撕取下表皮，做镜检。如有相当部分 的气孔已张开，则可进行下列实验。
5、撕蚕豆叶表皮若干放入上述3个培养皿中。
6、将培养皿至于1000W碘钨灯光下照光1~1.5 h。 7、分别在显微镜下观察气孔的开度。
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五、注意事项
实验前用光照进行预处理，以促进气孔 张开，以对实验成功至关重要。
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一、实验目的
观察钾离子在气孔开张中的作用。
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二、实验原理
保卫细胞的渗透系统可由钾离子所调节，无论是环式 或非环式光合磷酸化，都可形成ATP。ATP不断供给保卫 细胞原生质膜上的钾—氢离子交换泵作功，支持保卫细胞 逆着离子浓度差而从周围表皮细胞吸收钾离子，降低保卫
细胞的渗透势，从而使气孔张开。
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三、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料 盆栽蚕豆 （二）试剂 0.5％硝酸钾 ，0.5％ 硝酸钠 （三）仪器设备 显微镜，培养皿，温箱，镊子，载玻片，盖玻 片
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四、操作步骤
1、配0.5％KNO3、 0.5％ NaNO3溶液。 2、在3个培养皿中分别放入0.5％KNO3、 0.5％ NaNO3 及蒸馏水各15mL。 3、于实验前1h用两支1000W碘钨灯对盆栽蚕豆进行照光 处理，其间随时用水喷洒叶片，以保持叶片湿润，促使气 孔开放。
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六、作业
1、试比较在何种溶液中气孔的开度最大？为什 么？说明原因。 2.完成此次实验报告。
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4、从植株取一叶片，撕取下表皮，做镜检。如有相当部分 的气孔已张开，则可进行下列实验。
5、撕蚕豆叶表皮若干放入上述3个培养皿中。
6、将培养皿至于1000W碘钨灯光下照光1~1.5 h。 7、分别在显微镜下观察气孔的开度。
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五、注意事项
实验前用光照进行预处理，以促进气孔 张开，以对实验成功至关重要。
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一、实验目的
观察钾离子在气孔开张中的作用。
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二、实验原理
保卫细胞的渗透系统可由钾离子所调节，无论是环式 或非环式光合磷酸化，都可形成ATP。ATP不断供给保卫 细胞原生质膜上的钾—氢离子交换泵作功，支持保卫细胞 逆着离子浓度差而从周围表皮细胞吸收钾离子，降低保卫
细胞的渗透势，从而使气孔张开。
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三、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料 盆栽蚕豆 （二）试剂 0.5％硝酸钾 ，0.5％ 硝酸钠 （三）仪器设备 显微镜，培养皿，温箱，镊子，载玻片，盖玻 片
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四、操作步骤
1、配0.5％KNO3、 0.5％ NaNO3溶液。 2、在3个培养皿中分别放入0.5％KNO3、 0.5％ NaNO3 及蒸馏水各15mL。 3、于实验前1h用两支1000W碘钨灯对盆栽蚕豆进行照光 处理，其间随时用水喷洒叶片，以保持叶片湿润，促使气 孔开放。
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六、作业
1、试比较在何种溶液中气孔的开度最大？为什 么？说明原因。 2.完成此次实验报告。
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微生物学实验-细菌染色
革兰氏阳性菌
《基础生物学实验》精品课程 基础生物学实验》
作业
• 实验报告
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1、涂片 、
1. 取一块干净的载玻片平放在载玻片架上，在载 取一块干净的载玻片平放在载玻片架上， 玻片中央滴一滴生理盐水（或蒸馏水）； 玻片中央滴一滴生理盐水（或蒸馏水）； 无菌操作从试管中生长有琼脂斜面上挑取少许 2. 无菌操作从试管中生长有琼脂斜面上挑取少许 菌苔； 菌苔； 3. 将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀 并涂成薄膜。 并涂成薄膜。 注意：载玻片要洁净无油迹； 注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不 宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。 宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。
形态学特征
培养特征、菌落的形状、大小、颜色、 培养特征、菌落的形状、大小、颜色、表 面特征、 面特征、光泽等 细胞形态：形状、大小、 细胞形态：形状、大小、排列方式 特殊结构：鞭毛、芽孢、孢子、 特殊结构：鞭毛、芽孢、孢子、荚膜等 细胞内涵物 染色反应：革蓝氏染色、 染色反应：革蓝氏染色、抗酸性染色 运动性
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2、干燥 、
将涂好菌膜的载玻片平放在载玻片架上， 将涂好菌膜的载玻片平放在载玻片架上， 室温下自然干燥。 室温下自然干燥。
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3、固定 、
手持已经自然干燥的涂好菌膜的载玻片， 手持已经自然干燥的涂好菌膜的载玻片， 涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2 3 涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，热 固定细菌细胞。 固定细菌细胞。 原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固、 原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固、使细 菌细胞质凝固，从而固定细菌细胞形态， 菌细胞质凝固，从而固定细菌细胞形态， 并使之牢固附着在载玻片上。 并使之牢固附着在载玻片上。 注意：热固定温度不宜过高， 注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚 至破坏细胞形态。 至破坏细胞形态。
生物化学与分子生物学实验：实验十 聚合酶链式反应(PCR)及酶切鉴定转化产物
在100μl反应体系中，20 μmol/l dNTPs基本满足合 成 2.6μg DNA ， 50 μmol/l dNTPs 可 以 合 成 6.6μg DNA，而200 μmol/l dNTPs则足以合成25μgDNA。
2.9 变性温度和时间
模板DNA充分变性是PCR顺利进行的前提。
在PCR扩增开始的第一次变性时， 应给予足够的时间 和温度，使基因组DNA充分变性。
对于扩增哺乳动物基因组中单拷贝序列，模板DNA的 加入量一般为0.2-2μg。
对于质粒DNA模板只需要20ng。模板量过多，会增加 非特异性扩增机会。
2.7 Mg2+浓度：
Mg2+是维持Taq DNA聚合酶活性所必需的，还影响 DNA的Tm值、产物的特异性及引物二聚体的形成
Mg2+浓度过低时，酶活性显著降低，使产量降低； 过高时，易生成非特异性扩增产物。
产量降低，过高则导致非特异性扩增。
2.5 耐热DNA聚合酶
通常Taq DNA聚合酶用量为0.5-5U/100μl，酶量过
大会导致非特异产物的增加；
传统使用的Taq DNA聚合酶的一个致命缺点是不具
备 3′→5′校正外切酶活性，错配率高。
大约每聚合9000个核苷酸发生一次错误掺入，经过 约 20 个 循 环 后 ， 扩 增 产 物 中 随 机 突 变 率 大 致 为 1/400-1/900，
目前，限制性内切酶被广泛运用于基因分子克隆技术 中，是体外剪切DNA 片段的主要工具。
由于外源DNA 片段插入质粒中，是在两个限制性内切 酶酶切位点中进行的，因此，可以使用单酶切或双酶 切手段对转化筛选得到的重组子进行鉴定。
三、实验材料
微量移液器，硅烷化的PCR管，PCR仪，琼脂 糖凝胶电泳所需设备，台式离心机，凝胶 成像仪，制冰机以及塑料离心管、枪头等。
2.9 变性温度和时间
模板DNA充分变性是PCR顺利进行的前提。
在PCR扩增开始的第一次变性时， 应给予足够的时间 和温度，使基因组DNA充分变性。
对于扩增哺乳动物基因组中单拷贝序列，模板DNA的 加入量一般为0.2-2μg。
对于质粒DNA模板只需要20ng。模板量过多，会增加 非特异性扩增机会。
2.7 Mg2+浓度：
Mg2+是维持Taq DNA聚合酶活性所必需的，还影响 DNA的Tm值、产物的特异性及引物二聚体的形成
Mg2+浓度过低时，酶活性显著降低，使产量降低； 过高时，易生成非特异性扩增产物。
产量降低，过高则导致非特异性扩增。
2.5 耐热DNA聚合酶
通常Taq DNA聚合酶用量为0.5-5U/100μl，酶量过
大会导致非特异产物的增加；
传统使用的Taq DNA聚合酶的一个致命缺点是不具
备 3′→5′校正外切酶活性，错配率高。
大约每聚合9000个核苷酸发生一次错误掺入，经过 约 20 个 循 环 后 ， 扩 增 产 物 中 随 机 突 变 率 大 致 为 1/400-1/900，
目前，限制性内切酶被广泛运用于基因分子克隆技术 中，是体外剪切DNA 片段的主要工具。
由于外源DNA 片段插入质粒中，是在两个限制性内切 酶酶切位点中进行的，因此，可以使用单酶切或双酶 切手段对转化筛选得到的重组子进行鉴定。
三、实验材料
微量移液器，硅烷化的PCR管，PCR仪，琼脂 糖凝胶电泳所需设备，台式离心机，凝胶 成像仪，制冰机以及塑料离心管、枪头等。
实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档
基础上，通过对靶基因进行特定的加工和修饰，如定 点突变、插入、缺失、置换等，再研究这些修饰对生 物体的表型、性状可能有何种影响，从而了解基因和 其编码蛋白质在生物体内的功能。
模式植物拟南芥
拟南芥（Arabidopsis thaliana ）又称为阿拉伯芥，是一种十字花 科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典 型的模式植物。该植物具有以下特点：
植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培
养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。 拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，
基因高度纯合。易获通过理化处理 获得各种功能的突变体。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使 种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的 培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置 于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE
2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP） 、DNA模版、Taq DNA聚合酶
3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
❖ 仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
每小组按10倍准备混合体系； 每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3
模式植物拟南芥
拟南芥（Arabidopsis thaliana ）又称为阿拉伯芥，是一种十字花 科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典 型的模式植物。该植物具有以下特点：
植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培
养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。 拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，
基因高度纯合。易获通过理化处理 获得各种功能的突变体。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使 种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的 培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置 于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE
2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP） 、DNA模版、Taq DNA聚合酶
3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
❖ 仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
每小组按10倍准备混合体系； 每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3
叶绿素含量的测定(精)
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6、结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子： Ca=12.7A663－2.69A645； Cb=22.9A645－4.69A663； 据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb： mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进 一步求出植物组织中叶绿素的含量： 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体 积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。
3、取滤纸1张，置漏斗中，用80%丙酮湿润，沿玻棒把提取 液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量80% 丙酮冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入 漏斗中。 4、用滴管吸取80%丙酮，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入 容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用80%丙 酮定容至25ml，摇匀。 5、把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以80% 丙酮为空白，在波长663nm、645nm下测定吸光度。
能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素a和叶绿素b的
定量分析，为什么？
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今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、 b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个 特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类 胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。 在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰， 所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸 收峰。 2、了解叶绿素a和b及总量的最大吸收峰，学会分 光光度计的使用方法及其原理。
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四、操作步骤
1、取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组 织表面污物，剪碎(去掉中脉)，混匀。 2、称取剪碎的新鲜样品0.2g，放入研钵中，加少量石英砂 和碳酸钙粉及5ml 80%丙酮，研成均浆，再加80%丙酮 10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。
微生物学实验(10)
实验十
ＩＭＶＩＣ试验
--试验的原理及其在 肠道细菌鉴定中的意义和方法。
实验原理
ＩＭＶＩＣ是吲哚、甲基红、伏－普和
柠檬酸盐四个试验的缩写。这四个试验 主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠 杆菌，多用于水的细菌检查。柠檬酸盐 试验是用来检测柠檬酸盐是否被利用。 产气肠杆菌能利用柠檬酸盐作为碳源， 产生碱性化合物，使培养基的ＰＨ升高， 培养基由绿色转变成蓝色。而大肠杆菌 不能利用柠檬酸盐。
菌种、培养基、试剂及器材
菌种 培养基
大肠杆菌，产气肠杆菌 柠檬酸盐斜面培养基 接种环，酒精灯，
仪器或其他用具
试管架
实验内容
接种→培养（37℃培养48h）
实验结果
阳性为“+”，阴性为“-”
菌
名
柠檬酸盐试验
产气肠杆菌 大肠杆菌
+ -
ＩＭＶＩＣ试验
--试验的原理及其在 肠道细菌鉴定中的意义和方法。
实验原理
ＩＭＶＩＣ是吲哚、甲基红、伏－普和
柠檬酸盐四个试验的缩写。这四个试验 主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠 杆菌，多用于水的细菌检查。柠檬酸盐 试验是用来检测柠檬酸盐是否被利用。 产气肠杆菌能利用柠檬酸盐作为碳源， 产生碱性化合物，使培养基的ＰＨ升高， 培养基由绿色转变成蓝色。而大肠杆菌 不能利用柠檬酸盐。
菌种、培养基、试剂及器材
菌种 培养基
大肠杆菌，产气肠杆菌 柠檬酸盐斜面培养基 接种环，酒精灯，
仪器或其他用具
试管架
实验内容
接种→培养（37℃培养48h）
实验结果
阳性为“+”，阴性为“-”
菌
名
柠檬酸盐试验
产气肠杆菌 大肠杆菌
+ -
食品生物化学实验 课件 实验二 糖类性质实验 (一) ———糖类颜色反应(共10张PPT)
戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红
因α－为萘糠酚醛反及应糠２（醛.试Ｍ衍剂ｏ生ｌ物ｉ对ｓ此ｃ反ｈ应反均应呈）阳性，故此反应不是糖类的
将３支试管同时放入沸水浴中，注意观察 ／Ｌ阿拉伯糖（溶１液），莫混氏匀（。Ｍｏｌｉｓｃｈ）试剂５０ｇ／
Ｌα－萘酚的酒精溶液，称取α－萘酚
α－萘５酚ｇ反，应溶（于Ｍ９ｏ５ｌ％ｉ乙ｓ醇ｃ中ｈ，反总应体）积１００ｍＬ，贮于棕色瓶内，使用前配制。 衍生物，后者能与α－萘酚生成紫红色物质。
阳性反应。在实验条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应。
３.杜氏实验 戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红
色物质。
三、器材与试剂
（２）塞氏（Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ）试剂０.
（１）莫氏（１Ｍ.器ｏ材ｌｉｓｃｈ）试剂５０ｇ／
取３支试管分别加入１０ｇ／Ｌ的葡萄糖溶液、１０ｇ／Ｌ
戊糖在浓酸溶试液管中，脱试水管生架成糠，醛滴，管后，者水与浴间苯锅三。酚结合成樱桃红
，记录各管颜色的变化及变化时间。
３.杜氏实验取３支试管分别加入杜氏试剂１ｍＬ，再分别加入
１滴１０ｇ／Ｌ葡萄糖溶液、１０ｇ／Ｌ半乳糖溶液、１０ｇ
／Ｌ阿拉伯糖溶液，混匀。将试管同时放入沸水浴中，观察颜色的 变化，并记录颜色变化的时间。
思考题
α－萘酚反应（Ｍｏｌｉｓｃｈ反应） 间苯二酚反应（Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ反应） ０５ｇ溶于３０ｍＬ浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至１００ｍＬ。 杜氏实验取３支试管分别加入杜氏试剂１ｍＬ，再分别加入
将３支试管２同时ư放入沸α水－浴萘中，酚注反意应观的察原理是什么？
，记录各管颜色的变化及变化时间。 间苯二酚反应（Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ反应） 取３支试管分别加入１０ｇ／Ｌ的葡萄糖溶液、１０ｇ／Ｌ （２）塞氏（Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ）试剂０. 糖类性质实验（一）———糖类颜色反应 （１）莫氏（Ｍｏｌｉｓｃｈ）试剂５０ｇ／ 硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，在液面交界处有紫红色环 果糖溶液、１０ｇ／Ｌ蔗糖溶液各０.
因α－为萘糠酚醛反及应糠２（醛.试Ｍ衍剂ｏ生ｌ物ｉ对ｓ此ｃ反ｈ应反均应呈）阳性，故此反应不是糖类的
将３支试管同时放入沸水浴中，注意观察 ／Ｌ阿拉伯糖（溶１液），莫混氏匀（。Ｍｏｌｉｓｃｈ）试剂５０ｇ／
Ｌα－萘酚的酒精溶液，称取α－萘酚
α－萘５酚ｇ反，应溶（于Ｍ９ｏ５ｌ％ｉ乙ｓ醇ｃ中ｈ，反总应体）积１００ｍＬ，贮于棕色瓶内，使用前配制。 衍生物，后者能与α－萘酚生成紫红色物质。
阳性反应。在实验条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应。
３.杜氏实验 戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红
色物质。
三、器材与试剂
（２）塞氏（Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ）试剂０.
（１）莫氏（１Ｍ.器ｏ材ｌｉｓｃｈ）试剂５０ｇ／
取３支试管分别加入１０ｇ／Ｌ的葡萄糖溶液、１０ｇ／Ｌ
戊糖在浓酸溶试液管中，脱试水管生架成糠，醛滴，管后，者水与浴间苯锅三。酚结合成樱桃红
，记录各管颜色的变化及变化时间。
３.杜氏实验取３支试管分别加入杜氏试剂１ｍＬ，再分别加入
１滴１０ｇ／Ｌ葡萄糖溶液、１０ｇ／Ｌ半乳糖溶液、１０ｇ
／Ｌ阿拉伯糖溶液，混匀。将试管同时放入沸水浴中，观察颜色的 变化，并记录颜色变化的时间。
思考题
α－萘酚反应（Ｍｏｌｉｓｃｈ反应） 间苯二酚反应（Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ反应） ０５ｇ溶于３０ｍＬ浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至１００ｍＬ。 杜氏实验取３支试管分别加入杜氏试剂１ｍＬ，再分别加入
将３支试管２同时ư放入沸α水－浴萘中，酚注反意应观的察原理是什么？
，记录各管颜色的变化及变化时间。 间苯二酚反应（Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ反应） 取３支试管分别加入１０ｇ／Ｌ的葡萄糖溶液、１０ｇ／Ｌ （２）塞氏（Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ）试剂０. 糖类性质实验（一）———糖类颜色反应 （１）莫氏（Ｍｏｌｉｓｃｈ）试剂５０ｇ／ 硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，在液面交界处有紫红色环 果糖溶液、１０ｇ／Ｌ蔗糖溶液各０.
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《基础取0.4％TTC溶液0.2mL 放入大 试管中，加9.8 mL乙酸乙酯，再加少许Na2S2O4粉末摇匀， 则立即产生红色的TTF 。此溶液浓度为每毫升含有 TTF80μg。分别取此溶液0.25mL、0.50mL、1.00mL、 1.50mL、2.00mL置10mL刻度试管中，用乙酸乙酯定容至 刻度，即得到含TTF20μg、40μg、80μg、120μg、 160μg的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参照，在485nm波 长下测定吸光度，绘制标准曲线。
上部分有何关系 ?
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八、作业
1、了解TTC法测定根系活力与其它方法相比有什 么优点。 2、完成此次实验报告。
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四、操作步骤
1、定性测定
(1)配制反应液把1%TTC溶液、0.4 mol/L的琥珀酸和磷 酸缓冲液按 1:5:4比例混合。
(2)把根仔细洗净，把地上部分从茎基部切除。将根放入 三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处 放1～3h，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根 都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。
2、掌握根系活力测定的原理与方法；
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二、实验原理
氯化三苯基四氮唑(TTC)是标准氧化电位为80mV 的氧 化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红 色而不溶于水的三苯甲(TTF)，如下式：
生成的三苯甲(TTF)比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化， 所以TTC被广泛用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所 引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到 增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示 脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。
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根系活力的测定
基础生物学实验（三）
《基础生物学实验》精品课程
一、实验目的
植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的 生长情况和活力水平直接影响地上部的营养状况及 产量水平。本实验练习测定根系活力的方法，为植 物营养研究提供依据。 教学目的：
1、理解植物根系活力的内涵及其对植物营养研 究的意义；
（3）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙 酯3～4mL，充分研磨，以提出TTF。把红色提取液移入刻 度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2～3次，皆移入刻 度试管，最后加乙酸乙酯使总量为10mL，用分光光度计 在波长485nm下比色，以空白试验作参照测出吸光度，查 标准曲线，即可求出TTC原量。
4. 磷酸缓冲液(1/15mol/L，pH7.0)。 5. 1mol/L硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55mL，边 搅拌边加入盛有500mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至 1000mL。
（三）仪器设备 小烧杯3个，研钵1个，移液管：0.5mL1支、10mL1支、
5mL3支，刻度试管6支，分光光度计，电子天平，温箱， 试管架，药勺，石英砂适量，滤纸。
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（2）称取根尖样品0.5g，放入小烧杯中，加入0.4%TTC溶 液和磷酸缓冲液(pH7.0)各5mL，使根充分浸没在溶液内， 在37℃下暗保温1～2h，此后立即加入1mol/L硫酸2mL ， 以停止反应。(与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加 根样品，37℃下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步 骤同上)。
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三、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料 水培或砂培小麦、玉米等植物根系。
（二）试剂 1. 乙酸乙酯(分析纯)。 2. 次硫酸钠(Na2S2O4，分析纯)，粉末。 3. 1%TTC溶液：准确称取TTC1.0g ，溶于少量水中，
定容到100mL。用时稀释至需要的浓度。
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五、计算结果 根系活力=
[mgTTF/（g.h）]
式中：C ——四氮唑还原量，μg。 W——根重，g 。 h——时间，h 。
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六、注意事项 根系应吸干水分但不能用力挤压伤及细
胞，才能测定准确。
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七、思考与问题 为什么要测定根系活力 ? 植物的根与地