海马神经元细胞免疫荧光检验
四神聪电针预防急性睡眠剥夺大鼠海马神经元凋亡的机制及对焦虑行为的影响
四神聪电针预防急性睡眠剥夺大鼠海马神经元凋亡的机制及对焦虑行为的影响焦博钰;孟凡琪;肖兴茹;张菁芸;裴文娅;阮经文【期刊名称】《中山大学学报:医学科学版》【年(卷),期】2022(43)6【摘要】【目的】探讨四神聪电针预防急性睡眠剥夺大鼠海马神经元凋亡的机制及对焦虑行为的影响。
【方法】将SD大鼠随机分为Sham组(对照组)、sleep deprivation(SD,睡眠剥夺组)、EA+SD组(eletroacupuncture,电针干预组)。
采用改良水平台法对SD组、EA+SD组进行连续4天的急性睡眠剥夺,电针组在睡眠剥夺期间于四神聪穴位进行电针治疗,连续4 d,每天20 min。
采用旷场实验检测大鼠探索能力以评估大鼠焦虑程度,并通过免疫荧光染色检测海马中CA1、CA2、CA3、DG1、DG2区域的神经元(NeuN阳性)和Cleaved Caspase-3的共标情况;采用免疫荧光标记海马中星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP),通过sholl analysis分析星形胶质细胞形态变化,并检测分别与补体C3^(+)、S100A^(+)的共标情况,以了解海马中星形胶质细胞A1、A2分型情况。
【结果】旷场实验发现:EA+SD组大鼠在中心停留时间的时间增加,在中心区域的运动速度下降;免疫荧光染色显示:EA+SD组大鼠在海马不同区域除CA3外,其余的CA1、CA2、DG1、DG2区神经元上Cleaved caspase-3较SD组大鼠表达减少(P<0.05);sholl anal-ysis发现在12µm、15µm、18µm、21µm处EA+SD组星形胶质细胞与同心圆交点数目多于SD组,在海马区A1型星形胶质细胞(C3^(+)GFAP^(+)/GFAP^(+))比例低于SD组,A2型(S100A^(+)GFAP^(+)/GFAP^(+))所占比例高于SD组。
亚低温对OGD
亚低温对OGD/R 模型新生大鼠海马神经元损伤的保护分子机制研究王雪芹 郭小凤 杨培源［摘 要］ 目的 观察亚低温（MH ）对新生大鼠海马神经元氧糖剥夺/复糖复氧（OGD/R ）损伤的保护作用，并探讨其作用机制。
方法 体外培养新生大鼠海马神经元，将实验细胞随机分为对照组、OGD/R 组、OGD/R+MH 组和OGD/R+MH+Chl 组；OGD/R 组神经元给予OGD 处理6 h ，再于37℃复糖复氧处理24 h 建立OGD/R 模型。
OGD/R+MH 组和OGD/R+MH+Chl 组神经元均给予OGD 处理6 h ，再分别于32℃不加或加氯喹（Chl ）条件下复糖复氧处理24 h 。
收集各组复糖复氧处理24 h 后的细胞及细胞培养上清液；采用电镜观察神经元超微结构变化，MTT 法检测神经元活力，ELISA 法检测乳酸脱氢酶（LDH ）漏出率，TUENL 染色法检测神经元凋亡情况，West‑ern blot 检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3剪切体（Cleaved caspase-3）、聚ADP 核糖聚合酶剪切体（Cleaved PARP ）、溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）、泛素结合蛋白P62、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3Ⅱ）表达水平。
结果 与对照组比较，OGD/R 组出现明显的细胞器损伤、降解、线粒体肿胀等神经元损伤表现，神经元活力下降、LDH 漏出率增加、凋亡神经元增多（P <0.05），凋亡标志物Cleaved caspase-3、Cleaved PARP 表达升高（P <0.05），LAMP2、P62蛋白表达降低，LC3Ⅱ蛋白表达升高（P <0.05）。
MH 干预后，OGD/R+MH 组较OGD/R 组细胞器损伤减轻，神经元活力升高、LDH 漏出率减少、凋亡神经元减少（P <0.05），凋亡标志物Cleaved caspase-3、Cleaved PARP 表达降低（P <0.05），LAMP2蛋白表达升高，P62、LC3Ⅱ蛋白表达降低（P <0.05）。
免疫组化海马部位-概述说明以及解释
免疫组化海马部位-概述说明以及解释1.引言1.1 概述在本文中，我们将探讨免疫组化在海马部位的应用。
海马是大脑的重要组成部分，被认为在学习和记忆形成中扮演着关键的角色。
通过使用免疫组化技术，我们可以对海马中的特定分子和细胞进行检测和研究，从而深入了解其在健康和疾病状态下的功能和变化。
免疫组化技术是一种基于特异性抗体与目标分子结合的方法，通过标记抗体使其与感兴趣的目标分子结合，并通过形成特定的信号来可视化目标分子的位置和表达情况。
在海马研究中，免疫组化技术可以用来检测和定位特定的神经元、突触和其他细胞类型，以及特定的信号传导蛋白、激活标记物和神经递质受体等分子。
通过免疫组化技术，我们可以了解海马的结构和功能，以及海马在各种神经系统疾病中的变化。
例如，通过检测和定位特定的神经元和突触，我们可以研究海马的神经回路和信息传递过程，进一步了解学习和记忆的神经机制。
此外，通过检测和定量特定的信号传导蛋白和激活标记物，我们可以了解海马在疾病状态下的功能变化，如阿尔茨海默病和癫痫等。
综上所述，免疫组化技术在海马部位的研究中具有重要的应用前景。
通过这一技术，我们可以深入了解海马的分子和细胞水平的特征，揭示其功能和疾病相关的变化。
随着技术的不断发展和改进，免疫组化将继续为我们揭示海马的奥秘，推动神经科学领域的进步和发展。
1.2文章结构文章结构的目的是为了清晰地展示文章的组织结构和内容安排，使读者能够更好地理解文章的逻辑思路和论证过程。
本篇文章的结构分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分主要对免疫组化海马部位的研究进行概述，介绍本篇文章的目的和意义。
在概述中，可以简要介绍免疫组化技术和海马部位的重要性，突出本篇文章想要探讨的主题。
在文章结构的目的部分，可以强调本篇文章主要通过介绍免疫组化技术和探讨海马部位的重要性，来探索免疫组化在海马部位的应用前景。
正文部分将详细介绍免疫组化技术的原理、方法和应用，使读者对该技术有一个全面的了解。
全脑缺血再灌注后海马 EphA 受体基因表达的变化特点
全脑缺血再灌注后海马 EphA 受体基因表达的变化特点杨锦珊;龙根;徐莉;谢敏杰;王伟【摘要】目的：观察EphA 受体在海马全脑缺血再灌注后基因表达的改变。
方法：SD 大鼠50只随机分为假手术组10只及全脑缺血再灌注组40只，Pulsinelli 四血管阻断法建立全脑缺血再灌注模型，采用半定量 RT-PCR观察假手术组及缺血组在缺血后不同时间点（6 h、1 d、3 d、7d）EphA 受体 mRNA 含量变化的情况，免疫荧光双标法检测 EphA4受体在海马的细胞定位。
结果：EphA1-A8及EphA10 RNA 在正常海马组织均有表达， EphA4受体含量多。
在缺血状态下，EphA1、EphA2、EphA3、EphA6、EphA7及 EphA8的 mRNA 表达水平一过性上调，EphA4、EphA5和 EphA10的 mRNA 表达水平逐步上调；EphA4受体亦是缺血后变化最显著的EphA 受体。
免疫荧光双标显示 EphA4主要分布于海马CA1-CA3区及 DG 区 NeuN 阳性锥体神经元。
结论：在海马不同的 EphA 受体对缺血呈现出不同的应答模式，EphA4是海马正常条件下表达最为丰富的 EphA受体并且在缺血条件下出现最为显著地表达变化。
EphA4受体主要分布于海马CA1-CA3区以及 DG 区 NeuN阳性锥体神经元。
%Objective: To observe the gene expression of EphA receptors in the normal and ischemic hippocampus in rats. Methods: Fifty SD rats were randomly divided into two groups: sham group (n=10) and ischemia group (n=40). The Pulsinelli four-vessel occlusion model was used to induce transient global ischemia. Semi-quantitative RT-PCR was applied to measure gene expressions of EphA receptors in hippocampus at different time points (6h, 1d, 3d, 7d). To detect the cellular location of EphA4 receptors in the hippocampus,dual immunofluorescence was employed. Results: All EphA receptors includingEphA1-A8 and EphA10 were expressed in normal hippocampus, and EphA4 the most abundantly expressed in normal hippocampus. EphA receptors exhibited different change pat-terns of RNA expressions in the hippocampus after transient global ischemia. EphA1, EphA2, EphA3, EphA6, EphA7 and EphA8 presented a transient up-regulation of RNA expression. However, EphA4, EphA5 and EphA10 expressed in persisted up-regulation of RNA since transient global ischemia. EphA4 also the most significantly ex-pressed in the ischemic hippocampus. Immunofluorescence study showed that EphA4 was mainly distributed in the NeuN-positive pyramidal neurons in the hippocampus, especially in the CA1-CA3 and DG regions. Conclusion:EphA receptors exhibited different patterns in RNA expression in the hippocampus after ischemia. EphA4 receptor, the most abundantly expressed in normal hippocampus, experienced dramatic change in the ischemic hippocampus. EphA4 was mainly located in the NeuN-positive pyramidal neurons in the hippocampus, especially in the CA1-CA3 and DG regions.【期刊名称】《神经损伤与功能重建》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】5页(P102-106)【关键词】EphA 受体;短暂性全脑缺血模型;海马;EphA4 受体;锥体神经元【作者】杨锦珊;龙根;徐莉;谢敏杰;王伟【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科武汉 430030; 福建医科大学附属第一医院神经内科福州 350000;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科武汉 430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科武汉 430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科武汉 430030【正文语种】中文【中图分类】R741;R741.02Eph受体家族是目前已知最大的受体蛋白酪氨酸激酶家族，目前在哺乳动物中发现表达的有14种，根据其序列同源性及与配体亲和力分为2个亚家族：EphA （EphA1～EphA8，EphA10）和EphB（EphB1～EphB4，EphB6）。
大鼠海马神经干细胞的分离培养与免疫荧光鉴定
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果
从 新生大 鼠海马齿状 回分离的细胞群可不断增殖形成细胞克隆球 ， 并且呈 ｎｓ ｎ阳性 表达 ， ｅｔ ｉ 具有多 向分化能力 。 结论
分 离培 养 的细 胞 是 中 于细胞 ； 分离培养 ； 免疫荧光鉴定
中图 分 类 号 ： ３ ３ Ｑ ４ 文 献 标 志 码 ： Ａ 文章 编 号 ：６ ４ ４ ０ ２ １ 一２ ０ ０ — ４ １７ — ９Ｘ（０ ０）０ — ０ １ ０
（ ．Ｃ ｌ ｇ ｆ Ｌ －ｃｅ ｃｓ ｅ ｅ Ｕ ｉ ｒｉ ，Ｂ ｏ ｉ ｂ ｉ０ １ ０ ；．Ｃ ｌ ｇ 厂Ａ ｒ ｕｔｒ ，Ｈ ｂ ｉ １ ｏｌ ｅ ｏ ｓｉｎｅ ，Ｈ ｂ ｉ ｎ ｅｓ ｙ ａ ｄｎ Ｈｅｅ ７ ０ ２ ２ ｏｌ ｅ Ｑ ｇｉ ｌ ｅ ｅ ｅ ｅ ｖ ｔ ｇ ｅ ｃ ｕ Ｕ ｉ ｒｉ ｛Ｅ ｇｎ ｅｉ Ｈａ ｄ ｎ Ｈｅｅ ５ ０ １ ３ Ｄ ｐ ｒｍ ｎ ｅｒｌ ｙ ｆ ｌ ｅ ｏｐｔ ｊＨ ｂｉ ｎｖ ｓ ｙ ｏ ｎ ｉ ｒ ｇ． ｎ ａ ｂ ｉ０ ６ ０ ． ｅ ａｔ ｅ ｔｏ Ｎ ｕｏ ｇ，Ａｆ ｉ ｄ Ｈ ｓ ｉｌ０ ｅ ｅ ｅ ｔ ｅ ｎ ｆ ｏ ｉ ￣ ａ
Hes1与小鼠海马齿状回神经再生
Hes1与小鼠海马齿状回神经再生目的：观察幼年小鼠与成年小鼠海马齿状回中Hes1的表达差异，初步分析其对成年神经再生的影响。
方法：将C57BL/6雄性小鼠分为幼年组（10 d，N组）和成年组（4个月，A组），每组8只。
分别对Hes1、BrdU、Doublecortin（DCX）、NeuN采用免疫荧光技术染色并进行相应的细胞计数，初步分析BrdU、Hes1双阳性细胞的细胞类型及表达水平。
在显微镜下分离海马齿状回，采用Western blot 检测Hes1的蛋白水平，观察对比两组间Hes1蛋白表达的差异。
结果：（1）Western blot检测中A组中的Hes1蛋白的表达水平明显高于N组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。
（2）Hes1（+）细胞主要分布于齿状回颗粒细胞下层，并且大部分Hes1阳性细胞同时表达Brdu；（3）A组Hes1（+）细胞数量明显多于N 组，而BrdU（+）细胞明显少于N组，且差异均有统计学意义（P＜0.05）。
结论：Hes1在幼年小鼠与成年小鼠齿状回颗粒细胞下层中的表达差异，导致了神经细胞增殖水平的不同，表明Hes1的高表达可能抑制了神经再生。
1 资料与方法1.1 一般资料选取16只C57BL/6雄性小鼠，分为以下两组：（10 d，N组）幼年组和（4个月，A组）成年组，每组8只小鼠，并且成年组小鼠在动物室饲养10 d以适应环境。
1.2 BrdU给药方法与标本制备两组小鼠均以BrdU 50 mg/kg腹腔注射给药3 d，2次/d，每次间隔12 h，最后一次注射2 h后予戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，经升主动脉灌注生理盐水100 mL，4%多聚甲醛液（pH 7.4）500 mL后，断头取脑，将脑组织置入4%多聚甲醛固定过夜，20%蔗糖4 ℃沉底。
选择海马部位应用冰冻切片机冠状位连续切片，脑片厚度为35 μm，每隔140 μm取一张脑片，将脑片放入防冻液中保存以备用。
1.3 免疫荧光染色通过免疫荧光染色方法对Hes1、BrdU、Doublecortin （DCX）、NeuN染色并进行细胞计数。
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。
海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。
海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。
1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。
海马细胞培养与鉴定
非特异性对照:用正常羊血清代替兔抗特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体,其它实验步骤上。
阴性对照:用PBS代替兔抗特异性烯醇化酶( NSE )多克隆抗体,其它实验步骤同上。
纯度计算：高倍镜视野下，随机选取计数视野，计数100个细胞中阳性神经元的数目，重复5次后，计算均值。
吸去培养液用PBS液冲洗3遍
↓
质量分数为4%的多聚甲醛固定15 m in;
↓
0.01mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
↓
质量分数为0.4%的Triton X-100湿盒反应40 m in;
↓
0.01mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
↓
3%H2O2孵育15min,消除内源性的过氧化物酶
搅拌。
↓
(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
↓
(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
↓
(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
↓
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
↓
(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于
或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。另一方面，请注意选购经过适当吸附的二抗，以减小二抗的非特异性吸附。
b.在免疫组化时如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。可以在4体积甲醇中加入1体积3%过氧化氢，混匀后用于内源性过氧化氢酶的灭活。
c.可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。另外，选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间也会有所帮助。
步骤：
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海马神经元细胞免疫荧光检验
神经元鉴定：
一、烯醇化酶鉴定：
培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS 漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min 以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。
二、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）荧光显示：
培养细胞用预冷PBS液轻柔漂洗3次，4%多聚甲醛固定，1h，4℃---吸去多余甲醛---PBS漂洗5min×3次---0.25%triton，室温，15min---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------弃血清，加入β-tubulinⅢ抗体（1:100稀释），4℃，过夜---PBS漂洗5min×3次---滴加FITC 标记的山羊抗小鼠lgG（体积比1:200稀释），37℃，1h---DAPI复染10min---抗荧光猝灭封片液封片---荧光显微镜观察---选择10个视野，统计学处理。
一、烯醇化酶鉴定：
培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS 漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，
80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。