细胞免疫荧光步骤
免疫荧光实验步骤大全
免疫荧光实验步骤大全免疫荧光实验是一种常见的实验技术，用于检测特定抗原和抗体的相互作用。
本文将介绍免疫荧光实验的详细步骤，以供参考。
实验材料准备：- 试验样本（包括细胞或组织）- 抗原或抗体- 包含荧光素的二抗- PBS缓冲液- 荧光显微镜- 封片胶实验步骤：1. 样本制备- 如果是细胞样本，在培养皿中培养并观察细胞的形态和生长状态。
- 如果是组织样本，将组织切片并进行固定，然后反复用PBS缓冲液进行洗涤。
2. 抗原或抗体的固定- 将样本固定在载玻片上，可以使用正硫酸盐和乙醇来进行固定。
- 固定后用PBS缓冲液进行洗涤，以去除多余的固定试剂。
3. 孵育抗原或抗体- 在固定后的样本上加入适量的抗原、抗体或荧光素标记的二抗。
- 在室温下或4摄氏度下孵育一定的时间，以实现抗原和抗体的特异结合。
4. 洗涤- 使用PBS缓冲液洗涤固定后的样本，可多次洗涤以去除非特异性结合。
5. 荧光显微镜观察- 将载玻片放置在荧光显微镜上，调整荧光滤镜组合以观察荧光信号。
- 使用合适的放大倍率观察细胞或组织中特定的抗原或抗体信号。
6. 影像采集与分析- 使用相机或图像采集系统记录荧光显微镜观察到的图像。
- 使用图像分析软件对图像进行处理和分析，如测量荧光强度、定量特定抗原或抗体的表达水平等。
7. 结果和讨论- 分析实验结果，比较不同样本之间的差异。
- 讨论实验结果与研究假设的一致性，并可进行进一步的实验验证。
8. 结论- 总结实验结果，并得出相应的结论。
- 可以进一步讨论实验结果在相关领域的应用和意义。
9. 实验清理- 定期清洗和消毒实验室工作区域和仪器设备，以确保实验环境的卫生和安全。
以上是免疫荧光实验的基本步骤，每一步都需要仔细操作和控制实验条件。
在实验过程中，要注意遵守实验室安全操作规范，确保自己和他人的安全。
希望本文对您的科研工作有所帮助！。
细胞免疫荧光标记实验步骤
细胞免疫荧光标记实验步骤细胞免疫荧光标记实验是用来观察和分析细胞中的特定分子或结构的一种常用方法。
下面是一些常见的细胞免疫荧光标记实验步骤：1. 细胞培养准备:- 在无菌条件下准备所需培养基和培养器具。
- 将待标记细胞接种在培养皿中，以适当的细胞密度使其在培养基中生长。
2. 固定细胞:- 将细胞培养皿中的培养基倒掉。
- 用生理盐水或磷酸缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除未附着的细胞和培养基残留。
- 加入适当的固定液，例如4%的乙醛，固定细胞并封存其内部结构。
3. 渗透化处理:- 使用适当的渗透剂，如0.1%的Triton X-100，以打破细胞膜，使抗体能够渗透到细胞内部。
- 进行渗透化处理的时间应根据实验要求而定。
4. 抗体标记:- 制备适当的抗体和荧光染料稀释液。
- 将抗体稀释液加入到细胞上，使其与目标分子结合。
- 按照实验要求，在适当的温度和时长下孵育细胞，促使抗体与目标分子充分结合。
5. 洗涤和染色:- 用洗涤缓冲液充分洗涤细胞，以去除未结合的抗体和荧光染料。
- 使用适当的荧光染料对细胞进行染色。
如需防褪色，可以添加适当的抑制剂。
6. 显微镜观察和图像捕获:- 用适当的显微镜观察细胞，并捕获荧光图像。
- 根据需要，使用图像处理软件对图像进行分析和量化。
注意事项：- 实验前确保实验室和设备都是清洁的，并遵守实验安全操作规范。
- 涉及有害物质时，戴好个人防护用品，如实验手套和护目镜。
- 每个实验步骤的时间和条件可能因实验要求而异，需根据具体实验方案进行调整。
这些步骤提供了一般的细胞免疫荧光标记实验的大致流程，但具体实验方法还需根据实验目的和材料的特性进行优化和调整。
参考资料：[1] Smith, C. et al. ___. Cold Spring Harb. Protoc. 7, 1052–1055 (2013).[2] Manders, E. M. M. et al. FISH: ___. Cold Spring Harb. Protoc. 2006, db.rot4111 (2006).。
细胞免疫荧光步骤
方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上〔悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片〕2. 然后在 4％ PFA里面室温下固定30 分钟， PBS洗两次， 0.1%TX-100 室温下作用1－ 2 分钟使细胞膜通透。
3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器〔面积大，扁平状的，比方大的培养皿〕里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4.剪一片适宜大小的 parafilm ，在上面滴上稀释在 1％ BSA/TBS中的一抗〔稀释倍数依具体抗体而定〕，每个玻璃片 30ul 足够，把玻璃片盖在上面〔细胞面朝下〕，室温下孵育30 分钟，然后在PBS里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.最后，在载玻片加上 mountingmedium 〔大约每个玻璃片加 10ul 〕，把玻璃片放上去〔细胞面朝下〕，37度 30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7.抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。
8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次〔可以都试一下看看那种方法适宜〕。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于 rabbit 和 rat 的抗体，二抗那么是不同荧光信号标记的，我用的是 donkeyanti-rabbit-FITC〔绿〕和 donkeyanti-rat-Tex-Red〔红〕。
2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗 4 度孵育过夜比拟好，背景比拟清晰。
3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照那么分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常 donkey 血清。
5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
方法三：1. 片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购置公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤
1. 细胞一定要贴在玻片上（最好可以放入24孔板），为后面照像打基础。
细胞密度适中，大约60-75%满片即
可，否则容易脱片。
2. 取出细胞后用4%多聚甲醛固定15分钟，现用现配。
（以下各步骤切毋使玻片干燥）
3. PBS冲洗
4. 0.1%Triton作用20分钟
5. PBS冲洗
6. 10%正常血清封闭10分钟
7. 加入一抗，4度孵育过夜（找个小瓶盖将小玻片支起来，抗体就不容易溢出），还要记住“砸片”，就是抗
体从较高处落到片子上，以分布均匀。
抗体稀释度1：60，较常用！
8. PBS冲洗4次，各5分钟
9加入荧光二抗，室温30分钟。
抗体稀释度1：400，较常用！
10. 同8。
11. 90%甘油封片。
也很关键阿，多封几次才有体会。
12. 避光保存，或到显微镜下观察。
0.1%Triton和山羊血清。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光1、吸干十二孔板中每孔中的培养基，用PBS洗三次，5min/次，注意摇床要缓慢。
2、吸干PBS，每孔加200~300μl固定液，室温固定20分钟。
3、若暂时不做荧光，吸干固定液，不洗，放-30℃保存。
4、需要做时，将十二孔板取出，稍微解冻之后，加适量的PBS，用钩针抠出要PBS洗三次，5min/次。
5、吸干PBS后，每孔加1ml的5‰Triton破膜液，室温下破膜15~20分钟。
6、吸干破膜液，室温下PBS洗3次，5min/次。
7、加BSA封闭液，30~50μl/爬片，室温下封闭30min。
8、吸干BSA封闭液，不洗，加一抗（一抗用PBS稀释比例为：1：50~1:100，浓度视具体情况而定，30~50μl/爬片）4℃过夜。
注意十二孔板保持平整，以免一抗流到爬片外。
9、第二天从4℃冰箱中取出十二孔板，PBST洗3次，3min/次，然后每孔加1:50稀释的FITC，室温下避光孵育1h。
10、PBST洗3次后，DAPI染核6分钟，30μl/爬片。
染核后PBST洗3次，5min/次。
11、载玻片上滴一滴GL YCEROL封片液，即可镜下观察。
说明：①5‰Triton破膜液：例如配20μl的Triton原液用4000μlPBS稀释。
②FTIC现配现用，用PBS稀释，比例为1：50~1:75，具体浓度依据荧光亮度来调整。
耗材：1、十二孔板2块，一块要求无菌（种细胞），另一块洁净（外用漂洗爬片）。
2、外用PBS3、固定液4、细胞爬片5、避光盒6、钩针7、5‰Triton破膜液8、BSA封闭液9、一抗10、PBST11、FITC12、DAPI13、GL YCEROL封片液。
细胞免疫荧光的流程
细胞免疫荧光的流程
一、样本制备
1. 将细胞制成单细胞悬液,调整到适当的密度。
2. 将细胞悬液移到聚赖氨酸预处理的载玻片上,室温自然干燥。
二、固定
1. 用预冷的乙醇固定5分钟,去除固定液。
2. 用洗涤2次,每次5分钟。
三、孵育
1. 加入适量一抗溶液,覆盖样本,避光孵育过夜(4°或者室温)。
2. 洗涤3次,每次5分钟。
3. 加入二抗溶液,避光孵育1小时。
4. 洗涤3次,每次5分钟。
四、封片
1. 在载玻片上滴加少量抗荧光淬灭封装液。
2. 盖上盖玻片,尽量避免生成气泡。
3. 荧光显微镜下观察结果。
以上是细胞免疫荧光的基本流程。
需要根据不同的抗体和样本进行适当调整。
细胞免疫荧光的方法
细胞免疫荧光I、步骤：一、固定：PBS 5min×3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。
固定液覆盖细胞，RT 静置15min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
二、通透化：通透液覆盖细胞，RT 静置30min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
三、封闭：封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。
四、一抗孵育：一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。
4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
五、二抗孵育：FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。
37℃避光孵育<60min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
六、染核：新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
七、封片：在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。
八、镜检，4℃避光保存。
II、注：1、细胞密度要合适，状态较好。
2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。
3、完成后最好及时镜检，照相；分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。
III、试剂配制：1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，（通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。
2、通透液：0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS3、封闭液：正常山羊血清稀释于PBS；或商品化封闭液成品。
4、Hoechst：Hoechst33258即可。
5、封片剂：50%(v/v)甘油/PBS。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤第一步：样本准备1.根据实验需要，选择并培养适当的细胞系或组织样本。
2.将细胞或组织培养在适当的载玻片、孔板或离心管中。
3.使细胞或组织粘附在载玻片等表面上。
第二步：固定和渗透化处理1.使用适当的缓冲液（如甲醛）或有机溶剂（如甲醇）将细胞/组织进行固定处理。
2.在室温或低温下，将缓冲液中的固定液置于载玻片或孔板中，进行固定处理。
3.固定后，用洗涤缓冲液（如PBS）洗涤细胞/组织，去除多余的固定液。
4.在细胞内透明化的同时，保持细胞结构完整。
第三步：抗体染色1.准备合适的一抗和二抗。
一抗是特异性与待检测蛋白结合的抗体，二抗是带有荧光染料的抗体。
2.将一抗稀释到适当的浓度，并加入到载玻片或孔板中，与细胞孵育。
3.将载玻片或孔板中的一抗与细胞孵育30-60分钟，使抗体与待检测的蛋白相结合。
4.在恰当的洗涤缓冲液中洗涤载玻片或孔板，去除多余的一抗。
5.同样的方法，添加二抗到载玻片或孔板中，并孵育30-60分钟，使二抗与一抗结合。
6.再次使用洗涤缓冲液洗涤载玻片或孔板，去除多余的二抗。
第四步：显微镜观察1.利用适当的显微镜镜头，观察载玻片或孔板上的细胞，并选取合适的区域进行观察。
2.使用适当的荧光滤波片，观察细胞中的荧光信号。
3.根据实验设计的需要，进行图像记录和分析。
细胞免疫荧光实验是一种常见的实验技术，可以用于研究细胞中的蛋白质表达和定位，提供有关蛋白质在细胞内的空间分布和功能的信息。
不同的实验目的和需求可能会有一些细微的差异，因此可以根据具体的实验目的进行相应的调整或优化步骤。
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方法一：1. 首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2. 然后在 4％PFA 里面室温下固定 30 分钟， PBS 洗两次， 0.1% TX-100 室温下作用 1－2 分钟使细胞膜通透。
3. 接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4. 剪一片合适大小的parafilm ，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS 中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片 30ul 足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育 30 分钟，然后在 PBS 里洗三次。
5. 接下来二抗孵育步骤同上。
6. 最后，在载玻片加上mounting medium （大约每个玻璃片加10ul）,把玻璃片放上去（细胞面朝下）， 37 度 30 分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7. 抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做 WB 检测一下你的抗体，看看有没有杂带。
8. 双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit 和 rat 的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC （绿）和donkey anti-rat-Tex-Red （红）。
2. 我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗 4 度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4. 封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常 donkey 血清。
5. 其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
方法三：1. 片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well 中直接染色2. 细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3. 细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
4. 其实小的 well 的话，可以直接拿来染色，没问题的。
5•固定：用PBS洗去培养液，用固定液(如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。
)固定细胞。
6. 内源性过氧化物酶处理， 3%过氧化氢处理细胞(选作，二抗连HRP 得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做) 。
7 •通透(胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做) ，一般选用 Triton-X100 来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到 1-2 小时。
8. 封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。
封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。
9. 一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma 。
选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。
时间一般是 4度过夜或者 37度 1小时。
一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。
10. 洗去一抗。
11. 上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。
二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。
二抗的时间一般是37 度半小时。
12. 底物显色(选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做)13. 洗去二抗，染核14. DAPI 或者 Hoechst 染核15. 洗去染核液，加 PBS，上镜观察。
方法四：(1) 细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用 PBS 离心洗涤 (1000rpm， 5min)2 次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
(2) 固定。
根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4C保存3个月。
PBS洗涤3X5 min。
(3) 通透。
使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。
选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。
通透的时间一般在5-15min。
通透后用PBS洗涤3X5 min。
(4) 封闭。
使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为 30min。
(5) 一抗结合。
室温孵育 1h或者4C过夜。
PBST漂洗3次，每次冲洗5min。
（6）二抗结合。
间接免疫荧光需要使用二抗。
室温避光孵育1h°PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
（7）封片及检测。
滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
方法五：1．漂洗血清蛋白 PH7.2-7.4 ， 37度 PBS 2小时.2． -20 度甲醇固定 20 分钟后，自然、干燥 10 分钟3． PBS 洗净： 3min＊34． 1%Triton ：25min-30min. 配成 50ultriton+5mlpBS5． PBS 洗净： 2＊5min6．羊血清封闭： 37 度， 20分钟7．一抗， 4度过夜，一般要大于 1 8小时或者 37度 1-2小时8. 4 度 PBS 洗净，3 min * 5次9．二抗 37 度小于一小时10. 37 度 PBS 洗净， 3* 3min11. 凉干封片（封闭液 PH8.5）细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8 小时烤干备用。
爬片可以在培养皿六孔板或 24 孔板中都可，我选择在培养皿中爬。
一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。
培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。
最后盖上培养皿置于37 度 5％ CO2 的暖箱中培养，根据细胞生长状况， 24小时或更长时间适时取出爬片。
爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4%多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37 度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。
同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。
将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。
注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－ 20 保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。
2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮);3.PBS 漂洗 5min；4.0.5% Trit on穿孔15mi n(丙酮固定法不用透化处理 );5. PBS漂洗2次，每次5min ；6.1%BSA 封闭 30min；7•加入1%BSA稀释的一抗，于 37C杂交2h;8.PBS漂洗2次，每次5min ;9•加入1%BSA稀释的二抗，于 37C杂交1h;10.PBS 漂洗 2 次，每次 5min ；11.5ug/ml DAPI 染色 2min；12. 抗淬灭封片剂封片。
抗淬灭封片剂 :2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10mi n（固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮）]PBS漂洗5min0.5% Triton 穿孔15mi n（丙酮固定法不用透化处理）PBS漂洗2次，每次5min1%BSA 封闭30minJ加入1%BSA稀释的一抗，于37C杂交2hJPBS漂洗2次，每次5minJ加入1%BSA稀释的二抗，于37E杂交1hJPBS漂洗2次，每次5min5ug/ml DAPI 染色2minJ抗淬灭圭寸片剂圭寸片「2.5% DABCO (w/v)抗淬灭封片剂- 50mM Tris(pH8.0)I 90%甘油0.25g DABCO [9ml甘油0.5ml 1M Tris(Ph8.0) f 70C 溶解，-20C 保存0.5ml ddH2O。