细胞免疫荧光步骤

方法一：

1. 首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）

2. 然后在 4％PFA 里面室温下固定 30 分钟， PBS 洗两次， 0.1% TX-100 室温下作用 1－2 分钟使细

胞膜通透。

3. 接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一

张用水打湿的滤纸，以保持湿度。

4. 剪一片合适大小的parafilm ，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS 中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），

每个玻璃片 30ul 足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育 30 分钟，然后在 PBS 里洗三次。

5. 接下来二抗孵育步骤同上。

6. 最后，在载玻片加上mounting medium （大约每个玻璃片加10ul）,把玻璃片放上去（细

胞面朝下）， 37 度 30 分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。

7. 抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做 WB 检测一下你的抗体，看看有没有杂带。

8. 双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。如果一

个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。

方法二：

1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit 和 rat 的抗体，二抗则是不

同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC （绿）和donkey anti-rat-Tex-Red （红）。

2. 我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉

一抗 4 度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对

照是PBS+荧光标记物。

4. 封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常 donkey 血清。

5. 其余步骤同一般免疫荧光单标操作。

方法三：

1. 片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well 中直接染色

2. 细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌

的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片

3. 细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。

4. 其实小的 well 的话，可以直接拿来染色，没问题的。

5•固定：用PBS洗去培养液，用固定液(如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。。。)固定细胞。

6. 内源性过氧化物酶处理， 3%过氧化氢处理细胞(选作，二抗连HRP 得必做，其他的如做

免疫荧光染色不用做) 。

7 •通透(胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做) ，一般选用 Triton-X100 来做

细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要

到 1-2 小时。

8. 封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用

5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。

9. 一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma 。选取具体

的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺

好的。时间一般是 4度过夜或者 37度 1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。

10. 洗去一抗。

11. 上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也

行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的，

抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37 度半小时。

12. 底物显色(选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，

以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做)

13. 洗去二抗，染核

14. DAPI 或者 Hoechst 染核

15. 洗去染核液，加 PBS，上镜观察。

方法四：

(1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的

培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生

长细胞，用 PBS 离心洗涤 (1000rpm， 5min)2 次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂

片。

(2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS

中4C保存3个月。PBS洗涤3X5 min。

(3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，

以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。

通透后用PBS洗涤3X5 min。

(4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为 30min。

(5) 一抗结合。室温孵育 1h或者4C过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。

（6）二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h°PBST漂洗3次，每次冲洗5min

后，再用蒸馏水漂洗一次。

（7）封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

方法五：

1．漂洗血清蛋白 PH7.2-7.4 ， 37度 PBS 2小时.

2． -20 度甲醇固定 20 分钟后，自然、干燥 10 分钟

3． PBS 洗净： 3min＊3

4． 1%Triton ：25min-30min. 配成 50ultriton+5mlpBS

5． PBS 洗净： 2＊5min

6．羊血清封闭： 37 度， 20分钟

7．一抗， 4度过夜，一般要大于 1 8小时或者 37度 1-2小时

8. 4 度 PBS 洗净，3 min * 5次

9．二抗 37 度小于一小时

10. 37 度 PBS 洗净， 3* 3min

11. 凉干封片（封闭液 PH8.5）

细胞免疫荧光步骤：

1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，

用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约

8 小时烤干备用。

爬片可以在培养皿六孔板或 24 孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子

具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）

取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37 度 5％ CO2 的暖箱中培养，根据细胞生长状况， 24小时或更长时间适时取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4%多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37 度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。

将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底

干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了

做好的细胞爬片可以放在－ 20 保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮);