蜜环菌产漆酶的发酵条件
漆酶活性测定方法
漆酶活性测定方法本页仅作为文档页封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March一、测 O法2漆酶是一种多酚氧化酶，它所催化的反应过程中有O z 的介入。
测量反应的耗氧量既可间接地推知漆酶的活性。
较早建立的瓦氏呼吸器检测法便是基于这一原理。
这一方法后来改进为利用氧电极来测量耗氧量，如弗罗纳等以愈创木酚为底物，利用氧电极测定了漆酶催化反应过程中的耗氧量，并将 1个漆酶活性单位定义为PH6 ． o 及2 5 ℃条件下以愈刨木酚作为电子供体时所需要的酶量。
亦可取醌醇作底物．利用氧电极测定漆酶消耗1. 0 μmo lO2的活性。
郭明高提出了测定生漆漆酶活性的吸氧法。
即将生漆溶于甲苯，测定酶促吸氧速度和累计酶促吸氧量，同时利用碱促吸氧法测定反应前后漆酚浓度的变化，从而可以求得漆酚浓度衰减的规律及漆酶促吸氧的克分子比。
此法的特点是反应时漆酶处于其天然存l 在的状态而反应底物又恰为漆酶的天然底物漆酚，这在漆酶测活研究中尚属首倒 [ 2 1 。
漆树酶活力检测用0..1m ol·L-1磷酸盐缓冲液与有机溶剂配成一定体积的底物，其浓度为1．35×10 m ol·L-1。
分别移取3mL于1cm测量池和参比池中，恒温水浴中预热10min．注入20μL漆树酶溶液(含酶2～3 μg)于测量池中，立即搅匀，测定350nm处吸光度A随时间的变化值．漆酶比活力定义为一定温度下,单位酶量催(mg·min-1)．将漆树酶在不同溶剂体系中的化反应的初速度，单位记为△A350mm比活力与漆树酶在纯水体系中的比活力相比，其比值称活力比()212 漆酶活性的定量测定方法21211 分光光度计法测定漆酶活性对苯二胺(λmax495) 、愈创木酚(λmax 485) 、邻苯二酚(λmax 400)和漆酚(λmax 420)都可用做漆酶活力测定的底物。
一株漆酶产生菌的筛选与发酵条件研究
１２３漆 酶 活 测 定 ．．
１ ． 茵 种 ｚ一 ， ．１ １ ３ 本研 究 筛 选得 到 并初 步鉴 定 为木 霉属
１１２ 土 样 ．．
食 堂周围老树根 系旁、 山坡草丛 问采集新鲜土样 ， 纸屑木 渣浅埋半年后采集新鲜土样 ， 陕西省汉 中市汉台区天台山森林 公 园浅层土样。
１１３主 要 仪 器 ．．
参考文献 行部分修改 ：．ｔｏ ／ Ｈ４６的醋 酸缓冲 、 Ｏ１ ｌＬ ｐ ． ｏ 液 ３ ｍＬ 加人 ５ ／ ． ， ５ ｇ Ｌ的木质素磺酸钠 ０５ｍ 再加入适当稀释 ． Ｌ，
的粗酶液 １ ， ． ｍＬ 以灭 活酶液作为 空白对照组 （ Ｄ ）３ 保 ０ Ｏ 。， ０ｏ Ｃ 温 １ ｎ７ ０ ｍｉ， ２ ０型可见分光 光度计测 ４ ５ｎ ０ ６ ｍ处光 密度 （Ｄ。 ０ ）酶活力定义为 １ ， 分钟 光密度 减少 Ｏ０ ．１为一个酶活力单位
胺 、 巴胺 ） ｒ 由于 漆 酶 具 有 氧 化 与 木 质 素 有 关 的酚 类 和 非 多 等２ ］ 。
土样采用梯度稀 释涂布于 Ａ培养基 ， ８ ２ ℃恒温箱 中培养
３ ５天 ， － 挑取单菌落接种于 Ｂ培养基上 ， ２ 置 ８±１℃条件 下恒 温培养 ２ ３ ， ～ ｄ 记录菌 落周 围有无褐色轮环产生 ， 记录菌落生长 的直径 （ ） ｄ 和变色圈直径 （２ 并计算 ｄ，：根据所产生褐色圈 ｄ） ， ， ｄ 的大小 ， 选出产漆酶能力强 的菌株并用保藏培养基留种。菌种
， Ｌ。 ｍ 】
Ｓ — ＨＺ Ａ水浴恒温振荡器Ｌ 海 贺德实验设备 厂）Ｔ Ｚ １０ Ｅ ， Ｈ 一 ０
恒温 培养摇床 （ 上海一恒科学仪器有 限公 司）Ｉ ， ＫＡ振荡器（— Ｉ
Ｋ — ｅｋ ）Ｔ ２ ０可见分光光度计 （ Ａ ｗ ｒｅ ，６ ０ ７ 北京普析通用仪器有
密孔菌固态发酵农业废弃物产漆酶活性的研究
基金项 目： 江苏省大学生创新创业训练计划项 目（ ２ ０ １ ５ １ ０ ３ ２ ３ ０ １ ３ Ｚ ） ； 江苏高校 品牌专业建设工程 资助项 目（ Ｐ Ｐ Ｚ Ｙ ２ ０ １ ５ Ａ ０ １ ８ ） ； 江苏省
农业 自主创新基金项 目（ ｃ ｘ（ １ ３ ） ３ ０ ２ ６ ）
第 ｌ ６卷第 ２期
２ ０ １ ７年 ６月
淮阴师范学院学报 （ 自然科 学版）
Ｊ ＯＵ Ｒ Ｎ Ａ Ｌ Ｏ Ｆ Ｈ Ｕ Ａ Ｉ Ｙ Ｉ Ｎ Ｔ Ｅ Ａ Ｃ ＨＥ Ｒ Ｓ Ｃ ＯＬ Ｌ Ｅ Ｇ Ｅ（ Ｎ Ａ Ｔ Ｕ Ｒ Ａ Ｌ Ｓ Ｃ Ｉ Ｅ Ｎ Ｃ Ｅ Ｅ Ｄ Ｉ Ｔ Ｉ Ｏ Ｎ）
工业 ， 从 生 物降解 到 环境保 护 和生 态修 复 ＿ １ 等 多个 领 域 越来 越 广 泛 ， 随 着人 们 对漆 酶 作用 机 理 的
深人 了解 ， 以及对 白腐真菌这一降解木质素明星微生物 的研究 ， 利用 白腐真菌来处理农业废弃物的研究
也就 走进 了研 究 者 的视 线 ． 目前 ， 我 国已成 为世界 上 农 业 废 弃 物 产 出量 最 大 的 国家 ， 其 中农 作 物 秸 秆 年 产量 达 ７亿 吨 （ 干 质 量） ， 畜 禽粪便 排放 量 ３ ０多亿 吨 ， 锯末 、 刨 花等林 业 废弃 物 １ ６ ０ ０ ０吨 ｎ ． 在我 国各地 政府 部 门的大 力倡 导下， 作 为主 要农业 废弃 物 的秸秆 大 多 以直接 还 田的方 式行处 理 ， 如 江苏 省淮安 市秸秆 年产 量达 ４ ２ ０万 吨， 其 中夏季 所产 的秸 秆还 田量 可达 ９ ５ ％． 秸 秆还 田的过程 也是 微生 物 降解 的过 程 ， 农业 废 弃 物是 一种 富含 木 质素 资源 （ 如稻 草 中含木 质素 １ ０ ％ ～１ ５ ％， 纤维 素 ３ ５ ％ ～ ４ ０ ％ 和 半纤 维素 ２ ５ ％ ～３ ０ ％） ， 也 是 一
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌是一类具有重要应用价值的菌种，能够分解淀粉类和纤维素类物质，具有广泛的应用前景。
本研究旨在通过筛选和鉴定，找到高效产漆酶的细菌菌株，并研究其固体发酵条件。
我们从土壤和水样品中收集多个潜在的产漆酶细菌菌株。
这些菌株被分离、纯化并保存以备后续的实验使用。
然后，我们使用碘碟法进行最初的筛选，通过菌株在含有淀粉或纤维素的培养基上形成明显溶解区来判断其分解能力。
筛选出的阳性菌株被进一步培养、扩增和鉴定。
鉴定的流程主要包括形态学观察、生化试验和分子生物学鉴定。
形态学观察包括菌落形态、细胞形态、孢子形态等。
生化试验主要包括氧化酶试验、淀粉分解酶试验、纤维素分解酶试验等。
分子生物学鉴定则主要通过16S rRNA序列分析来确定菌株的分类地位。
通过以上的筛选和鉴定过程，我们最终确定了一株高效产漆酶的细菌菌株。
接下来，我们进行了固体发酵条件的研究。
我们对产漆酶细菌的最适发酵基质进行了选择和优化。
我们评价了不同基质如淀粉、纤维素、豆饼等对产漆酶产量的影响，并通过响应曲面法确定了最佳基质比例。
然后，我们研究了发酵温度、pH值、初始菌液浓度、培养基添加剂等参数对产漆酶产量的影响，并进行了优化。
我们对优化后的固体发酵条件进行了验证和比较。
通过对产漆酶产量、酶活力和底物降解效率的测试，我们确定了最佳的固体发酵条件。
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
一、引言
漆酶是一种重要的工业酶，具有去除污水中有机物、漆水处理、食品添加剂等广泛的
应用。
目前，大部分漆酶产生菌株来源于土壤和水体等自然环境中。
而固体发酵是一种能
够充分利用含固体物质的废弃物进行生物转化的方式，可用于酶的生产。
本研究将选择适
合固体发酵的细菌菌株，进行筛选鉴定及研究其固体发酵条件，以提高漆酶的产量和活
性。
二、方法和材料
1. 菌株的筛选
从土壤和水体中分离细菌，根据产酶圈的形成情况进行初步筛选。
选择产酶圈明显的
菌株进行进一步的鉴定。
2. 细菌的鉴定
利用形态学、生理生化特性和16S rRNA序列分析等方法对选出的菌株进行鉴定，确定其属种。
3. 固体发酵条件研究
确定最适合细菌产漆酶的固体发酵条件，包括pH、温度、底物浓度、初始湿度等。
三、结果
1. 菌株的筛选和鉴定
筛选出多个具有产酶能力的细菌菌株，经鉴定后确定其中一株为Bacillus subtilis。
该菌株的漆酶活性较高，适合用于固体发酵生产。
2. 固体发酵条件研究
在固体发酵条件研究中，发现Bacillus subtilis固体发酵最适宜的pH为7.0，温度为37℃，底物浓度为10g/L，初始湿度为60%。
四、讨论
本研究通过菌株的筛选鉴定和固体发酵条件研究，成功地确定了适合固体发酵生产漆
酶的Bacillus subtilis细菌菌株，以及最适宜的发酵条件。
这些结果为进一步大规模生
产漆酶提供了重要的理论依据和技术支持。
漆酶的反应条件
漆酶的反应条件漆酶是一种重要的酶类催化剂，广泛应用于工业生产和科学研究中。
它能够在特定的反应条件下，催化各类底物的氧化反应，从而实现生物催化合成的目的。
本文将从温度、pH值、底物浓度和酶浓度四个方面探讨漆酶的反应条件。
温度是影响漆酶反应的重要因素之一。
一般来说，催化剂的活性随温度的升高而增加，因为温度的升高可以提高反应物分子的活动性和运动速率。
然而，过高的温度会导致酶蛋白的变性，使其失去催化活性。
因此，在选择漆酶的反应温度时，需要考虑到酶的稳定性和活性之间的平衡。
根据不同的底物和反应条件，漆酶的最适温度一般在30-50摄氏度之间。
pH值是另一个重要的反应条件。
不同的酶对于酸碱环境的适应性不同，漆酶也不例外。
漆酶在不同的pH值下，其催化活性会有所差异。
一般来说，漆酶的最适pH值在中性到弱碱性环境范围内，约为7.0-8.0。
此外，酶的催化活性还受到pH值的稳定性的影响，过高或过低的pH值都会导致酶的变性和失活。
底物浓度是影响漆酶反应速率的重要因素之一。
底物浓度过低会限制反应物的供应，从而降低反应速率。
而底物浓度过高则会导致反应物之间的竞争性反应增加，降低酶对特定底物的选择性和催化效率。
因此，在进行漆酶催化反应时，需要根据底物的特性和反应的要求，选择适当的底物浓度，以保证反应的高效进行。
酶浓度是影响漆酶反应速率的另一个重要因素。
酶浓度越高，提供给底物的催化剂浓度就越高，反应速率也就越快。
然而，过高的酶浓度可能会导致底物的饱和，从而降低反应速率。
因此，在选择漆酶浓度时，需要根据实际反应条件和需求来确定，以达到最佳的催化效果。
总结起来，漆酶的反应条件包括温度、pH值、底物浓度和酶浓度。
在进行漆酶催化反应时，需要综合考虑这些因素，以达到最佳的反应效果。
通过优化反应条件，可以提高漆酶的催化效率，实现高效、绿色的生物催化合成。
漆酶生产方案
漆酶生产方案1. 引言漆酶是一种重要的酶类产品，具有广泛的应用领域。
本文档旨在提出一种漆酶的生产方案，包括原料准备、发酵过程、提取纯化和产品测试等环节。
2. 原料准备漆酶的生产原料主要包括种子菌、培养基和辅助原料。
2.1 种子菌准备选择高效的漆酶产生菌株作为种子菌，通过培养菌株并获得足够的菌液用于发酵过程。
2.2 培养基制备常用的培养基成分包括碳源、氮源、矿物质和适量的维生素。
经过优化配方，并进行无菌处理，以确保发酵过程的纯度和可重复性。
2.3 辅助原料根据具体需要，可添加一些辅助原料，如表面活性剂、促进酶合成的物质等，以提高产量和酶活性。
3. 发酵过程漆酶的生产主要通过分批发酵的方式进行。
3.1 前处理将制备好的培养基倒入发酵罐中，进行预热和除菌处理。
确保发酵过程的无菌性和培养基的适温。
3.2 接种和发酵将种子菌接种到发酵罐中，设置合适的发酵条件，如温度、pH值、搅拌速度和通气量等。
根据菌株特性和研究经验，优化发酵条件以提高漆酶的产量和活性。
3.3 降温和收获当漆酶的产量和活性达到最高点时，降低温度，并进行漆酶的收获。
常用的收获方法包括离心和过滤等。
4. 提取纯化为了得到纯度较高的漆酶产品，需要进行提取和纯化过程。
4.1 细胞破碎通过破碎细胞壁的方式将漆酶从菌体中释放出来。
常用的破碎方法包括超声波破碎和高压破碎等。
4.2 液-液分配利用不同的溶剂性质差异，在适当的pH条件下，将漆酶从混合物中分离出来。
常用的分离方法包括萃取和沉淀等。
4.3 降低污染通过适当的净化步骤，去除分离过程中的杂质和污染物，确保漆酶的纯度和活性。
5. 产品测试最后，需要对提取纯化后的漆酶产品进行一系列的测试。
5.1 活性测定利用适当的底物和反应条件，测定漆酶的活性。
常用的活性测定方法包括酶联免疫吸附试验和比色法等。
5.2 纯度检测通过凝胶电泳和色谱等方法，检测漆酶产品中的杂质和其他酶的存在。
5.3 稳定性测试测试漆酶在不同温度、pH值和储存条件下的稳定性，以评估其在不同应用领域中的适用性。
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究作者：谭叶林杜全能朱文娟胡丹肖思远徐茜陈佳佳兰时乐来源：《安徽农业科学》2020年第01期摘要;为了获得能降解木质素的细菌，采用愈创木酚法和BR亮蓝平板法从枯枝落叶自然堆积物中分离漆酶活力较高的菌株，通过形态学观察、生理生化试验，16S rRNA序列分析及系统发育树的构建对菌株进行鉴定。
以芦苇秸秆粉为主要原料，采用单因素试验和正交试验研究并优化了菌株适宜的发酵培养基和发酵条件。
结果表明，菌株H-1鉴定为蜡状芽孢杆菌H-1（Bacillus cereus H-1）;适宜的发酵培养基和发酵条件为芦苇粉100%，（NH4）2SO4 2.5%，酵母抽提粉0.3%，KH2PO4 0.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，NaCl 0.5%，CaCl2 0.1%，发酵温度35 ℃，固水比1.0∶1.1（g∶mL），初始pH 7.2～7.4，接种量3%，装量50 g，发酵时间144 h。
在此条件下，漆酶活力达0.992 U/g。
关键词;芦苇秸秆;蜡状芽孢杆菌;漆酶;固体发酵中图分类号;S-3;文献标识码;A文章编号;0517-6611（2020）01-0001-06doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.001开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Screening and Identification of Laccase;producing Bacteria and Study on Solid;state Fermentation ConditionsTAN Ye;lin，DU Quan;neng，ZHU Wen;juan et al（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128）Abstract;In order to obtain lignin;degrading bacteria， the strains with high laccase activity were isolated from natural litter by guaiacol and BR brilliant blue plate method which were identified by morphological observation， physiological and biochemical experiments， 16S rRNA sequence analysis and phylogenetic tree construction. The suitable fermentation medium and fermentation conditions of the strain were optimized by single factor and orthogonal experiments with reed straw powder as the main raw material. The results showed that strain H;1 was identified as Bacillus cereus H-1. The suitable fermentation medium and conditions were as follows： reed powder 100%，（NH4）2SO4 2.5%， yeast extract powder 0.3%， KH2PO4 0.15%， MgSO4·7H2O 0.15%，NaCl 0.5%， CaCl2 0.1%， fermentation temperature 35 ℃， solid;water ratio 1.0∶1.1（g∶mL）， initial pH 7.2-7.4， inoculation volume 3%， loading capacity 50 g， fermentation time 144 h. Under those conditions， laccase activity reached 0.992 U/g.Key words;Reed straw;Bacillus cereus;Laccase;Solid;state fermentation木質素主要存在于木材和各种秸秆中，全世界每年产量约1 500亿t，它是一种取之不尽，用之不竭的绿色再生资源[1]。
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生物工程
䚢基采用综合马铃薯培养基 (CPDA)：葡萄糖20 g，新鲜土豆200 g(煮沸30 min 取滤液)，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB1 10 mg，水1000 mL，pH自然。 基础产酶培养基(质量分数) [10] (有小部分调 整)：葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，MgSO 4 ·7H 2 O 0 . 1 5 % ， K H 2P O 4 0 . 3 % ， C a C l 2 0 . 0 0 1 % ， V B1 0.001%，微量元素80 mL。 微 量 元 素 混 合 液 组 成 [11]： 氨 基 乙 酸 7.8×10 -3 mol，MgSO 4 ·7H 2 O 1.2×10 -2 mol， MnSO4·H2O 2.9×10-3 mol，NaCl 1.7×10-2 mol， FeSO 4·7H 2O 3.59×10 mol，CoCl 2 7.75×10 mol，CaCl 2·2H 2O 9.0×10 -4 mol，ZnSO 4·7H 2O 3.48×10 -4 mol，CuSO 4 ·5H 2 O 4×10 -5 mol， KAl(SO4)2·12H2O 2.1×10-5 mol，HBO3 1.6×10-4 mol，NaMnO4 4.1×10-5 mol。 1.3 培养条件 采用50 mL培养液/250 mL三角瓶接种灭菌 后，立即置于25 ℃、180 r/min振荡培养18 d。收 获后滤出培养液待测，菌丝体80 ℃烘干称质量。 试验均设3个重复。 1.4 粗酶液的的制备 取产酶高峰期的发酵液，于4000 r/min常温离 心15 min，上清液即为漆酶粗提液。 1.5 漆酶酶活的测定[12] 以愈创木酚为底物，4 mL 50 mmol/L(含1 mmol/L愈创木酚)琥珀酸钠缓冲液(pH4.5)，加入1 mL酶样液，混合均匀后置于30 ℃水浴保温反应30 min，于465 nm处测光吸收值。定义每分钟氧化1 μmol愈创木酚的酶量为一个酶活力单位。 2 结果与分析 2.1 蜜环菌的生长曲线和产酶曲线 采用基础培养基，测定菌丝干重和漆酶活力 随培养时间的变化(见图1)。蜜环菌到第16天生长 量基本上达到峰值。漆酶是次级阶段泌出，与菌 丝的生长不同步，到第16天测定菌丝干重达最高 而酶活力在第18天出现峰值。 2.2 培养条件对蜜环菌产漆酶的影响 2.2.1 不同碳源对蜜环菌产酶水平的影响 以蛋白
Abstract: The optimal fermentation conditions for laccase production by Amillariella mellea were investigated. The composition of fermentation medium was: corn flour 30 g/L, soybean meal 12 g/L, mixed liquid of trace metals 40 mL/L, C/N 2.5, Tween 80 1 g/L, sawdust 0.01 g/L, CuSO4·5H2O 0.05 mmol/L and the optical conditions were the initial pH of medium 5.0, 35 mL medium in 250 mL-flask, 25 ℃ and 180 r/ min for 18 days. Key words: laccase; Amillariella mellea; fermentation condition
日本学者吉田(Yoshida)1883年首次从漆树漆 液中发现漆酶[1]。漆酶是一种多酚氧化酶，在结构 和功能上与抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝 蛋白同源，都属于蓝色多铜氧化酶家族 [2]。它能 催化降解多种芳香族化合物，特别是酚类。漆酶 去除酚类污染物研究已引起了国内外的广泛关注 并取得了较好的降解效果 [3-6] 。漆酶在改善果汁 的色泽、提高饮料的稳定和制取优越食品添加剂 也有一定的研究 [7-8] 。漆酶已经成为生物学、化 学、食品工业和环境科学等领域十分活跃的研究
热点之一。 蜜环菌(Amillariella mellea)又名榛蘑、蜜环 蕈、苞谷蕈、青冈蕈，是一种药食兼用的真菌。 对蜜环菌的前期发酵研究表明，蜜环菌在次级生 长代谢阶段能合成一定量的胞外漆酶[9]。本文探索 了蜜环菌生产漆酶的最适培养方式和条件，为该 菌株漆酶的工业应用提供了一定的理论依据。 1 材料和方法 1.1 菌种与试剂
*通讯作者 收稿日期：2012-01-13 基金项目：河南省科技攻关计划项目(102102310016)；河南省高校青年骨干教师资助计划项目(2010)。 作者简介：秦仁炳(1986—)，男，硕士研究生，主要从事微生物物质分离工程的研究工作。
·2·
食品科技
2012年 第 37卷 第 9期 FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
Fermentation conditions for laccase production from Amillariella mellea
QIN Ren-bing, ZHU Xian-feng*, WU Ke, ZHANG Jing-jing, ZHAO Hai-kang
(College of Life Science and Institute of Bioengineering, Henan University, Kaifeng 475004)
生物工程
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2012年 第 37卷 第 9期
蜜环菌产漆酶的发酵条件研究
秦仁炳，朱显峰*，吴 珂，张晶晶，赵海康 (河南大学生命科学学院和生物工程研究所，开封 475004)
摘要：对蜜环菌(Amillariella mellea)产漆酶的发酵条件作了研究。结果表明蜜环菌产漆酶的最佳 培养基成分为：玉米粉30 g/L，豆粕 12 g/L，微量元素混合液40 mL/L，C/N2.5，吐温80 1 g/L，木 屑0.01 g/L，CuSO4·5H2O 0.05 mmol/L。最佳发酵条件为培养基初始pH5.0，培养基装量为250 mL 三角瓶中35 mL培养液，25 ℃条件下振荡培养(180 r/min)18 d。 关键词：漆酶；蜜环菌；发酵条件 中图分类号：TS 201.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)09-0002-04