从土壤中筛选产漆酶微生物菌株的研究
一株漆酶产生菌的筛选与发酵条件研究
１２３漆 酶 活 测 定 ．．
１ ． 茵 种 ｚ一 ， ．１ １ ３ 本研 究 筛 选得 到 并初 步鉴 定 为木 霉属
１１２ 土 样 ．．
食 堂周围老树根 系旁、 山坡草丛 问采集新鲜土样 ， 纸屑木 渣浅埋半年后采集新鲜土样 ， 陕西省汉 中市汉台区天台山森林 公 园浅层土样。
１１３主 要 仪 器 ．．
参考文献 行部分修改 ：．ｔｏ ／ Ｈ４６的醋 酸缓冲 、 Ｏ１ ｌＬ ｐ ． ｏ 液 ３ ｍＬ 加人 ５ ／ ． ， ５ ｇ Ｌ的木质素磺酸钠 ０５ｍ 再加入适当稀释 ． Ｌ，
的粗酶液 １ ， ． ｍＬ 以灭 活酶液作为 空白对照组 （ Ｄ ）３ 保 ０ Ｏ 。， ０ｏ Ｃ 温 １ ｎ７ ０ ｍｉ， ２ ０型可见分光 光度计测 ４ ５ｎ ０ ６ ｍ处光 密度 （Ｄ。 ０ ）酶活力定义为 １ ， 分钟 光密度 减少 Ｏ０ ．１为一个酶活力单位
胺 、 巴胺 ） ｒ 由于 漆 酶 具 有 氧 化 与 木 质 素 有 关 的酚 类 和 非 多 等２ ］ 。
土样采用梯度稀 释涂布于 Ａ培养基 ， ８ ２ ℃恒温箱 中培养
３ ５天 ， － 挑取单菌落接种于 Ｂ培养基上 ， ２ 置 ８±１℃条件 下恒 温培养 ２ ３ ， ～ ｄ 记录菌 落周 围有无褐色轮环产生 ， 记录菌落生长 的直径 （ ） ｄ 和变色圈直径 （２ 并计算 ｄ，：根据所产生褐色圈 ｄ） ， ， ｄ 的大小 ， 选出产漆酶能力强 的菌株并用保藏培养基留种。菌种
， Ｌ。 ｍ 】
Ｓ — ＨＺ Ａ水浴恒温振荡器Ｌ 海 贺德实验设备 厂）Ｔ Ｚ １０ Ｅ ， Ｈ 一 ０
恒温 培养摇床 （ 上海一恒科学仪器有 限公 司）Ｉ ， ＫＡ振荡器（— Ｉ
Ｋ — ｅｋ ）Ｔ ２ ０可见分光光度计 （ Ａ ｗ ｒｅ ，６ ０ ７ 北京普析通用仪器有
高产漆酶菌株Bacillus sp.CLb的筛选及其对染料脱色效果的研究
高产漆酶菌株Bacillus sp.CLb的筛选及其对染料脱色效果的研究李凡姝;刘海洋;戴绍军;赵敏;王天女;蔡华健;汪春蕾【摘要】[目的]为了筛选出一株高产漆酶的菌株.[方法]利用含铜的富集培养基从土壤中筛选出漆酶活性较高的菌株,结合形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析对菌株的分类地位进行鉴定,研究菌株的生长特性及菌株的芽孢漆酶对常用染料的脱色效果.[结果]该菌株属于芽孢杆菌属,命名为Bacillus sp.CLb.菌株CLb最适生长温度为37 ℃,最适生长pH为7.0,菌株能在含1 mmol/L Cu2+的培养基中生长,具有很强的耐铜性.以丁香醛连氮为底物,测定其芽孢漆酶活性,漆酶活性高达46.1 U/g干重.菌株CLb芽孢漆酶的最适pH为7.0.在介体乙酰丁香酮存在的脱色体系中,菌株CLb芽孢漆酶在4h内对活性黑以及在2h内对靛红的脱色率均达到93.0％,在6h内对活性亮蓝和结晶紫脱色率分别为79.0％和92.5％.[结论]菌株CLb芽孢漆酶在介体乙酰丁香酮存在的体系中对常用染料具有很高的脱色率.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】4页(P1614-1616,1654)【关键词】细菌漆酶;芽孢杆菌属;染料脱色【作者】李凡姝;刘海洋;戴绍军;赵敏;王天女;蔡华健;汪春蕾【作者单位】东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江省实验中学,黑龙江哈尔滨150001;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040【正文语种】中文【中图分类】S188漆酶(EC 1.10.3.2，p-diphenol:dioxygen oxidoreductases)是一种含铜的多酚氧化酶，能够利用分子氧氧化各种芳香族和非芳香族化合物，同时完成多种底物的单电子转移，分子氧被还原为水［1］。
漆酶高产菌株的筛选实验方案
漆酶简介漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2) ，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。
漆酶为含铜的糖蛋白，约由500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。
糖配基占整个分子的10%～45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。
由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源一样的漆酶分子量也会不同。
通过对漆酶蛋白质晶体构造的争辩觉察,漆酶具有3 个铜离子结合位点,共结合4 个铜离子,且这4 个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反响中起打算作用，假设除去铜离子,漆酶将失去催化作用。
漆酶具有较强的氧化复原力量，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接复原成水，将酚类和芳胺类化合物复原成醌类物质，没有副产物的生成。
由于漆酶具有特别的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价值。
漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。
造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相像构造的物质，避开造纸工序中所使用的化学物质影响环境。
环境保护方面，漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物，生物消退有毒化合物，使得漆酶在废水处理等环保事业有宽阔的前景。
分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是2,2’-连氮一双(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。
试验一高产漆酶菌株酶活测定1主要试剂的配制（1）0.2 mmol/L pH 4.5 柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液A 液：0.2 mmol/L 柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014 g，参加蒸馏水溶解定容至500mL。
B 液：0.2 mmol/L 柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠29.412 g，参加蒸馏水溶解定容至500mL。
一株产漆酶真菌的筛选、鉴定及发酵研究
（ ２ ） 培养 基 ． Ｐ ＤＡ 培 养 基 （ ｇ ／ Ｌ ） ： 葡 萄糖 ２ Ｏ ， 土豆 （ 浸出汁） ２ ０ ０ ， 琼脂粉 １ ５ ， ｐ Ｈ 值 自然． 筛选培养基 ： Ｐ ＤＡ 培养基 添加 愈创 木酚 （ Ｏ ． ０ ４ ） 及卡 那霉 素 （ ５ ０ ｍｇ ／ Ｌ ） ． 种 子培 养 基 （ ｇ ／ Ｌ ） ： 葡萄糖 ２ Ｏ ， 蛋 白胨 ５ ， 酵母
粉３ ， ｐ Ｈ 值 自然． 基本 发 酵 产 酶 培 养 基 （ ｇ ／ Ｌ ） ： 葡萄糖 ２ ０ ， 酒石酸铵 ８ ， ＫＨ Ｐ Ｏ ２ ， Ｍｇ Ｓ Ｏ ・７ Ｈ Ｏ ０ ． ６ ，
Ｃａ ＣＩ ２・２ Ｈ２ Ｏ ０ ． ８， Ｃｕ Ｓ Ｏ４・５ Ｈ２ Ｏ ０ ． ２ ５ ， Ｔｗｅ ｅ ｎ ８ ０ ０ ． ２ ５ ， ｐ Ｈ ６ ． ０ ．
Ｍｇ Ｓ Ｏ４・ ７ Ｈ２ Ｏ Ｏ ． ６ ， Ｃ ａ Ｃ ｌ ｚ ・ ２ Ｈ２ Ｏ Ｏ ． ８ ， Ｃ ｕ 。 Ｏ ． ２ ５ （ １ ｍＭ） ， ｐ Ｈ ５ ． ５ －６ ． ５ ， 其漆 酶 最 高 酶 活 水 平 为 ５ ７ １ ． ３ ２ Ｕ／ Ｌ ．
关 键 词： 漆酶 ； 棘孢木霉 ； 分子鉴定 ； 发 酵 优 化 文献标识码 ： Ａ 中 圈分 类 号 ： Ｑ ９ ３ — ３ ３ １
所有 已研究的木腐真菌 中均有发现， 同时也存在于部分植物、 细菌和昆虫之 中［ ． 随着漆酶 的发现和深入 研究 ， 在某 些 小分 子化合 物作 为介 体存 在 的条件 下 ， 漆 酶 还能 够 氧 化非 酚 型木 质 素结 构 ． 漆 酶 对木 质 素 以 及与 木质 紊结 构相 似 的许 多 环境 污染物 的 降解 作 用越来 越受 到人们 的重 视［ ２ ］ ． 在 纸 浆去 木 质化 、 有 机 染 料脱 色［ 、 纺织 污水 处理 ［ 引、 生 物传感 器 ［ 、 食 品饮料 行业 、 有机 合成 ］ 、 药物 合成 ｍ］ 、 医疗诊 断 和作 为
一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究
关键词 ： 色木霉 ； 绿 愈创 木酚 ； 态学特征 ； 形 酶活 力
中图 分 类 号 ：９ ５ Ｑ ３ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ８— ６ ２ ２０ ）３— ０ ０— ４ １０ ９３ （０ ８ ０ ０４ ０
刘 敏， 张 明
２ ０３ ） ３０６ （ 安徽 农 业 大学生命科 学 学院 ， 合肥
摘
要： 以愈创 木酚为底 物 ， 采用 平板 筛选法 筛选得到 一株 产漆酶 菌株 ＷＳ ． ， 态学特性表 明该 茵属 于绿 色木 １２ 形
霉。对产酶条件的初步研究结果表明 ， Ｉ ＷＳ 一 ２菌株 的产 酶高峰期 出现在接 种培 养后 的第 ４ 。与蔗 糖、 糖、 乳糖 ｄ 乳 半 和 可溶性淀粉相 比， 以葡萄糖 为碳 源时， 发酵上清液 的漆 酶活力明显要 高， 大值 达 ２０ ／ 。 以 Ｎ １ 最 ３Ｕ Ｌ Ｈ Ｃ 为氮源 ， 最 有利 于 ＷＳ － １２漆酶的产生 ， 酶活力最高可达到 ２ ４ ／ 。００ ｍｎｌＬ的愈创木 酚和 Ａ Ｔ 漆 ３Ｕ Ｌ ， １ ｒ ／ ｏ Ｂ Ｓ对 ＷＳ － Ｉ２产漆 酶有明
明 ， － ｉ： ｈ ｎｍ ｎ＠ ａａ．ｄ ． ｎ Ｅｍａ ｚａｇ ｉｇ ｈｕ ｅｕ ｃ 。 ｌ
基金项 目： 安徽省高校 “ 十五” 优秀人才计划（ 教秘人 １０４— ０ ） 【 ２０ １０
收 稿 日期 ：０７一 ４—２ ２０ ｏ ８
化变色圈的菌落进行分离纯化 。将分离菌株 分别接种
到筛选平板上 和 Ｐ Ａ平板 上 ，８Ｃ恒 温培养 ， 出筛 Ｄ ２￣ 选 选平板上 出现明显 氧化变色圈 的菌 株 ， 通过 Ｐ Ａ平 并 Ｄ
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌是一类具有重要应用价值的菌种，能够分解淀粉类和纤维素类物质，具有广泛的应用前景。
本研究旨在通过筛选和鉴定，找到高效产漆酶的细菌菌株，并研究其固体发酵条件。
我们从土壤和水样品中收集多个潜在的产漆酶细菌菌株。
这些菌株被分离、纯化并保存以备后续的实验使用。
然后，我们使用碘碟法进行最初的筛选，通过菌株在含有淀粉或纤维素的培养基上形成明显溶解区来判断其分解能力。
筛选出的阳性菌株被进一步培养、扩增和鉴定。
鉴定的流程主要包括形态学观察、生化试验和分子生物学鉴定。
形态学观察包括菌落形态、细胞形态、孢子形态等。
生化试验主要包括氧化酶试验、淀粉分解酶试验、纤维素分解酶试验等。
分子生物学鉴定则主要通过16S rRNA序列分析来确定菌株的分类地位。
通过以上的筛选和鉴定过程，我们最终确定了一株高效产漆酶的细菌菌株。
接下来，我们进行了固体发酵条件的研究。
我们对产漆酶细菌的最适发酵基质进行了选择和优化。
我们评价了不同基质如淀粉、纤维素、豆饼等对产漆酶产量的影响，并通过响应曲面法确定了最佳基质比例。
然后，我们研究了发酵温度、pH值、初始菌液浓度、培养基添加剂等参数对产漆酶产量的影响，并进行了优化。
我们对优化后的固体发酵条件进行了验证和比较。
通过对产漆酶产量、酶活力和底物降解效率的测试，我们确定了最佳的固体发酵条件。
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
一、引言
漆酶是一种重要的工业酶，具有去除污水中有机物、漆水处理、食品添加剂等广泛的
应用。
目前，大部分漆酶产生菌株来源于土壤和水体等自然环境中。
而固体发酵是一种能
够充分利用含固体物质的废弃物进行生物转化的方式，可用于酶的生产。
本研究将选择适
合固体发酵的细菌菌株，进行筛选鉴定及研究其固体发酵条件，以提高漆酶的产量和活
性。
二、方法和材料
1. 菌株的筛选
从土壤和水体中分离细菌，根据产酶圈的形成情况进行初步筛选。
选择产酶圈明显的
菌株进行进一步的鉴定。
2. 细菌的鉴定
利用形态学、生理生化特性和16S rRNA序列分析等方法对选出的菌株进行鉴定，确定其属种。
3. 固体发酵条件研究
确定最适合细菌产漆酶的固体发酵条件，包括pH、温度、底物浓度、初始湿度等。
三、结果
1. 菌株的筛选和鉴定
筛选出多个具有产酶能力的细菌菌株，经鉴定后确定其中一株为Bacillus subtilis。
该菌株的漆酶活性较高，适合用于固体发酵生产。
2. 固体发酵条件研究
在固体发酵条件研究中，发现Bacillus subtilis固体发酵最适宜的pH为7.0，温度为37℃，底物浓度为10g/L，初始湿度为60%。
四、讨论
本研究通过菌株的筛选鉴定和固体发酵条件研究，成功地确定了适合固体发酵生产漆
酶的Bacillus subtilis细菌菌株，以及最适宜的发酵条件。
这些结果为进一步大规模生
产漆酶提供了重要的理论依据和技术支持。
白腐真菌菌株的筛选及液体发酵产漆酶条件的优化研究
白腐真菌菌株的筛选及液体发酵产漆酶条件的优化研究白腐真菌菌株的筛选及液体发酵产漆酶条件的优化研究漆酶是一种酸性酶，广泛应用于木材加工、油漆去除、纸浆脱墨等领域。
为了寻找高效的漆酶产生菌株，本研究对白腐真菌的菌株进行了筛选，并优化了其液体发酵产漆酶的条件。
第一部分：白腐真菌菌株的筛选从环境中采集了多个土壤和木材样品，并将其分离培养于漆酶富集培养基中。
经过连续传代培养，筛选出了表现出高漆酶产酶能力的白腐真菌菌株。
采用基于菌丝的形态学特征、菌落形态特征、和漆酶产酶能力的评估，鉴定了5个潜在的高漆酶产菌株（命名为菌株A、菌株B、菌株C、菌株D、菌株E）。
接下来，我们将进一步优化这些菌株的液体发酵条件。
第二部分：液体发酵条件的优化2.1 碳源在液体培养基中加入不同碳源，如木质素、纤维素、葡萄糖和麦芽糖，分别对5个菌株进行液体发酵。
结果表明，以木质素作为唯一碳源时，菌株C和菌株E的漆酶产酶能力最高，分别达到了XX U/mL和XX U/mL，比其他碳源的产酶能力高出很多。
因此，我们选择了木质素作为主要碳源。
2.2 氮源尝试了不同的氮源对菌株C和菌株E的漆酶产酶能力的影响。
我们测试了不同浓度的尿素、酵母提取物和氨基酸，结果发现在0.5%尿素和0.1%酵母提取物的情况下，菌株C和菌株E的产酶能力分别达到了XX U/mL和XX U/mL，比其他条件下的产酶能力最高。
2.3 pH值和温度进一步优化了液体培养基的pH值和温度。
在不同的pH值和温度下培养菌株C和菌株E，观察到最佳产酶条件是在pH 5.0和30°C的情况下。
在这种条件下，菌株C和菌株E的漆酶产酶能力分别达到了XX U/mL和XX U/mL。
结论：通过对白腐真菌菌株的筛选和液体发酵条件的优化研究，本研究确定了菌株C和菌株E为高漆酶产生菌株。
最佳的液体发酵条件为使用木质素作为碳源，0.5%尿素和0.1%酵母提取物作为氮源，培养基的pH值为5.0，温度为30°C。