基因操作
改变基因的操作方法
改变基因的操作方法
改变基因的操作方法包括以下几种：
1. 基因编辑：利用基因编辑工具，例如CRISPR-Cas9系统，针对目标基因进行定点突变或剪切，实现基因序列的改变。
通过引入修复模板，还可以实现基因的修复或替换。
2. 基因敲除：通过使用RNA干扰或CRISPR-Cas9系统等方法，将目标基因的表达静默或失活，从而观察基因缺失对生物的影响。
3. 基因插入：将外源DNA片段或基因序列插入到目标基因组中，实现基因的增加或改变。
常用的方法有质粒转化、病毒载体介导的基因传递等。
4. 基因突变：通过使用化学诱变剂或辐射等物理或化学手段引起基因突变，从而研究特定基因的功能。
5. 基因组重塑：通过大规模改变基因组结构，例如创造染色体重排、基因倒位等，实现基因组的重塑和改变。
6. 基因克隆：将目标基因从一个物种中克隆出来，然后在另一个物种中进行基因表达，以研究基因的功能。
需要注意的是，进行基因的操作需要严格遵循生命伦理和法律规定，确保安全性
和伦理性。
此外，基因操作应考虑潜在的风险和可能的副作用，并进行充分的实验室研究和安全评估。
基因工程操作的基本步骤
基因工程操作的基本步骤
基因工程是指人为地将外源基因导入到宿主生物体中，并使其在宿主中表达出来的技术。
基因工程的操作一般包括以下基本步骤：
1.确定目标基因：确定想要转入宿主生物体的目标基因，这可能是来自其他生物体的其中一种特定基因。
2.获得目标基因：获得目标基因的DNA序列，通常通过基因重组、合成或从源生物中提取。
3.构建载体：将目标基因插入到一个载体DNA中，以便将其导入宿主生物体。
载体可以是人工合成的质粒或病毒，能够稳定地带有外源DNA。
4.转化宿主生物体：将构建好的载体导入到宿主生物体中，使其接受外源基因。
转化方法可以包括化学方法、电击法、基因枪等。
5.筛选转化体：通过筛选方法，如对转化体进行培养基的筛选、对荧光标记的筛选等，来选出成功转化了外源基因的宿主生物体。
6.验证基因表达：通过PCR、蛋白质表达分析等实验方法验证外源基因是否成功表达。
7.优化表达：根据目的需要，可以通过引入启动子、启动子增强子、终止子等调控元件，优化外源基因的表达。
8.传代培养：将成功表达外源基因的宿主生物体进行传代培养，以使其后代继续表达目标基因。
9.应用研究：将表达目标基因的宿主生物体应用于研究中，如表达重要药物、生产工业化酶、改良农作物等。
基因工程的操作程序
内含子
外显子
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
内含子：
外显子：
真核细胞的 基因结构
编码区
非编码区
外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点（启动子）。
启动子、终止子对于目的基因表达必不可少
目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
注意
三将目的基因导入受体细胞
（一）转化：
（二）方法
将目的基因导入 植物细胞
将目的基因导入 动物细胞
将目的基因导入 微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程（1）.基因（2）.基因的构建方法
通过对受体菌的培养而储存基因 基因组的构建cDNA的构建-----反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。
目的基因的mRNA
单链DNA
1
2
3
6
5
4
双链DNA (目的基因)
① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术
③条件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.前提条件：
基因编辑的操作步骤
基因编辑的操作步骤基因编辑是一种用于改变生物体基因组的技术，可以精确地修改DNA序列，以致使生物体具有特定的特征或特性。
下面将介绍基因编辑的操作步骤。
1. 设计目标基因编辑在进行基因编辑之前，首先需要确定目标基因以及编辑的目的。
可以通过研究相关文献或利用生物信息学工具来确定需要编辑的基因。
2. 选择合适的基因编辑工具目前常用的基因编辑工具有CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等。
根据编辑目标和实验条件的不同，选择合适的基因编辑工具。
3. 获取编辑工具选择合适的基因编辑工具后，需要获取相应的编辑工具。
可以通过购买或合作研究机构等方式获得。
4. 设计和合成编辑工具的核酸序列将选择的基因编辑工具的核酸序列进行设计和合成。
这些核酸序列将用于识别和切割目标基因。
5. 转染编辑工具将编辑工具的核酸序列导入到目标细胞中。
可以通过转染、电穿孔或病毒介导等方式将编辑工具导入到细胞中。
6. 制备和培养细胞在编辑工具转染后，需要制备和培养细胞。
根据实验需要，可以选择不同类型的细胞，如细菌、动物细胞或植物细胞等。
7. 识别和筛选编辑成功的细胞在细胞培养过程中，通过特定的标记或筛选方法，识别和筛选出编辑成功的细胞。
可以利用PCR、测序或荧光显微镜等技术进行识别和筛选。
8. 验证编辑效果对编辑成功的细胞进行验证，确认编辑的效果和准确性。
可以通过PCR、测序、Western blot或细胞功能实验等方法进行验证。
9. 筛选编辑后代对编辑成功的细胞进行繁殖和筛选，选择具有目标基因编辑的后代。
可以根据需要进行多次筛选和鉴定。
10. 分析和应用编辑结果对编辑后的细胞或生物体进行进一步的分析和应用。
可以通过基因表达分析、功能实验或动物模型等方法来验证和应用编辑结果。
基因编辑是一项复杂而重要的技术，可以为研究和应用提供有力的工具。
通过以上步骤，可以实现对生物体基因组的精确编辑，为基因研究和基因治疗等领域带来新的突破和进展。
基因工程的基本操作
基因工程的基本操作
基因工程的基本操作包括以下几个步骤：
1. 取得目标基因：首先需要获得目标基因的DNA序列。
这可以通过多种方法实现，如克隆、PCR扩增、合成等。
2. DNA切割：将目标基因从DNA样本中分离出来，通常需要用到一种特殊的酶——限制性内切酶。
这些酶可以在DNA的特定序列处切割，从而得到目标基因的DNA片段。
3. DNA连接：将目标基因的DNA片段与载体DNA连接在一起。
载体DNA是一种能够自复制的DNA分子，可以在细胞中稳定存在。
连接的过程通常需要使用DNA连接酶。
4. 转化：将连接好的DNA载体导入宿主细胞中。
这可以通过多种方法实现，如电穿孔、热激击等。
5. 克隆和筛选：选择合适的宿主细胞，并用培养基培养细胞，使其增殖。
通过筛选方法，如抗生素筛选、荧光检测等，筛选出带有目标基因的克隆。
6. 验证：对获得的克隆进行验证，确认目标基因已经成功导入宿主细胞，并且在细胞中表达。
7. 基因表达和应用：利用已经导入细胞中的目标基因进行进一步的研究。
可以通过控制基因的表达水平，探究基因的功能和
调控机制。
同时，还可以利用基因工程技术将目标基因导入其他生物体，实现特定性状的改良和应用。
基因操作方法知识
基因操作方法知识
基因操作方法是指通过改变生物体的基因组来改变其性状或特征的方法。
这些方法可以用来研究基因的功能、生物体的生理机制，或者用来改良作物、畜禽、微生物等生物体。
常见的基因操作方法包括基因克隆、基因敲除、基因编辑、基因组测序等。
基因操作方法包括以下几种：
1. 基因克隆：通过将感兴趣的基因从一个生物体中克隆出来，然后将其转移到另一个生物体中，来研究该基因的功能。
2. 基因敲除：通过使用CRISPR/Cas9等基因编辑技术来敲除或静默特定基因，从而研究该基因在生物体中的功能。
3. 基因编辑：利用CRISPR/Cas9、TALEN等基因编辑技术，直接对生物体的基因组进行编辑，实现精准的基因修饰。
4. 基因组测序：通过测序一个生物体的全部基因组来了解其基因组结构和功能，从而深入研究生物体的遗传特性和进化过程。
5. 转基因技术：将外源基因导入到目标生物体中，使其表达新的特性或功能，常用于改良作物、畜禽等经济作物的品质和产量。
基因操作方法在生物学研究、医学治疗、农业生产等领域具有重要的应用价值，同时也引发了一系列的伦理和安全问题，因此在进行基因操作时需遵守相关的法律法规和伦理标准。
基因操作原理名词解释
第一章1. Gene manipulation基因操作。
将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。
2. Interrupted genes间断基因。
序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。
我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。
3 .Promotor启动子。
DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。
4. Subcloning亚克隆。
当初始克隆中的外源DNA 片段较长，含有许多目的基因以外的DNA 片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。
第二章1.Restriction and modification限制和修饰。
宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。
2. Matched ends匹配末端。
识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。
3. Blunt ends平末端。
在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。
4. Isoschizomer ：同裂酶。
识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
5. Isocaudiners ：同尾酶。
来源不同、识别序列不同，•但产生相同粘性末端的酶。
6.Site preferences ：位点偏爱。
某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。
7.Star activity 星星活性。
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
8. Nicking enzyme 切口酶。
基因操作和基因转移技术
基因操作和基因转移技术基因操作和基因转移技术是现代生物科学领域的重要研究方向。
通过这些技术，科学家们可以对生物体的基因进行精确的编辑和调控，以实现对遗传特征的掌控和改变。
本文将介绍基因操作和基因转移技术的原理、应用和潜在风险。
一、基因操作技术基因操作技术是指通过对生物体的基因进行精确的修改和改造，来改变其遗传特征的方法。
其中最常用的技术是CRISPR-Cas9系统。
该技术利用CRISPR序列及Cas9酶的特异性识别与切割功能，实现对基因组的精确编辑。
基因操作技术可以带来广泛的应用。
例如，它可以用于农业领域，使作物具有抗虫、耐旱、耐盐等优良特性，提高农作物产量和质量。
此外，基因操作技术还可以用于治疗遗传性疾病，包括癌症、遗传性肌萎缩性侧索硬化症等。
通过将健康基因导入患者体内，可以修复遗传缺陷，达到治疗目的。
然而，基因操作技术也存在一些潜在的风险和伦理问题。
首先，技术操作不当可能导致出现意外的突变，引发未知的安全性问题。
其次，基因操作可能涉及到人类胚胎和生殖细胞的基因编辑，引发伦理争议和道德困境。
因此，在推广基因操作技术的过程中，需要制定严格的伦理道德规范和安全监管制度，确保技术的安全性和道德性。
二、基因转移技术基因转移技术是指将一个生物体的基因转移到另一个生物体中，以实现目标基因的表达。
这种技术被广泛应用于基础研究、农业改良和生物制药等领域。
常见的基因转移技术包括基因注射、基因枪和细菌介导的基因转移等。
基因转移技术的应用非常广泛。
在研究领域，科学家们可以将目标基因导入模式生物中，以研究其功能和调控机制。
在农业领域，基因转移技术可以用于培育转基因作物，使其具有抗虫、耐逆等优良特性，提高农作物产量和品质。
此外，基因转移技术还用于生物制药领域，例如将人类基因导入细菌中，通过其产生的蛋白质来生产药物。
与基因操作技术一样，基因转移技术也存在一些潜在的风险。
首先，基因转移可能导致转基因生物与野生生物发生杂交，引起生态系统的破坏。
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衔接子连接法
平末端的另一种处理方式是利用衔接子 （adaptor）进行处理，人工加上粘性末端。衔接 物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核 苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的 酶切位点的回文结构。如：
BamH I 或Sau3A
CCGGATCCGG GGCCTAGGCC
Hpa II Hpa II
+合成起步信号
缬 氨 酸
G
缬 氨 酸 缬 氨 酸 缬 氨 酸
中 心 法 则
（四）基因克隆的特点和技术路线
• 特点：分子水平上操作，细胞水平上表达 • 技术路线： 1 分离制备目的DNA片段和载体 2 目的DNA与载体的剪切 3 目的DNA与载体的连接 4 重组DNA分子转化宿主细胞 5 筛选阳性克隆，大量扩增
① 产生：同聚物加尾法 • 衔接子(adaptor) • 接头(linker) ② 优点：解决平末端连接效率低的缺点 ③ 缺点：载体自身环化 双向插入 多拷贝插入
用5’ 末端特异的核酸外切酶处理DNA片断 在A和B分别中加入dATP、dTTP和 末端脱氧核苷酸转移酶
同聚物尾巴10~40个碱基
同聚物加尾法
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的 粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割 位点的选择余地更大。
BamHⅠ G GATC C
C CTAG G
BclⅠ T GATC A
A CTAG T
杂种位点（hybrid site） 由一对同尾酶分别 产生的粘性末端共价结合形成的位点。
一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。 BamHⅠ G GATC C
材料;小鼠.R型球菌(无毒).S型球菌(有毒) 1.将活的R型菌注入小鼠体内,结果:小鼠活 2.将活的S型菌注入小鼠体内,结果;小鼠死 3.将死的S型菌注入小鼠体内,结果;小鼠活 4.将活的R型菌和死的S型菌同时注入小鼠体 内,结果;小鼠死 表明:无毒的R型菌与被杀死的有毒的S型菌 混合后转化为有毒的S型活菌. 这是格里菲思的实验.说明S菌体内有一种" 转化因子"!为了弄清这种"转化因子"是DNA, 多糖,还是蛋白质.艾弗里有做了以下实验; 1.将R型菌与S菌的DNA共同培养,得到活的R 型菌和活的S型菌,注入小鼠体内:小鼠死 2.将R型菌与S型菌的多糖或蛋白质培养,只 能得到活的R型菌,注入小鼠体内;小鼠活 3.将R型菌与S型菌的DNA和DNA水解酶共同培 养.也只得到活的R型菌,注入小鼠体内;小鼠 活 发现;只有完整的S型仅DNA才能使R型菌转化
C CTAG G
BclⅠ T GATC A
A CTAG T
杂种位点 ：
G GATC A
C CTAG T
限制片断的末端连接作用 分子间的连接：不同的DNA片断通过互补 的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起 来。 分子内的连接：由同一片断的两个互补末 端之间的碱基配对而形成的环形分子。
2. 聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶） 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 大片段 Klenow T4噬菌体DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶） AMV（禽源性） MMLV（鼠源性）
5‘
5‘
OH
3‘
3‘ 5‘
SmaⅠ
Vector
连接效率低
缺点
没有方向性
② 在平末端加一个黏端接头
Gene
GGGGGG
GGGGGG CCCCCC
Vector
CCCCCC
BamHⅠ
Gene
BamHⅠ EcoRⅠ
Vector
EcoRⅠ
效率高，且有方向性
4. 目的基因与载体的连接
（1）同源粘末端连接 ① 形成：同一种酶 同尾酶 ② 优点：效率高 一种酶，易找到 ③ 缺点：载体自身环化 双向插入 多拷贝插入 ④ 对策：载体DNA片断的脱磷酸化处理，或者 提高片段的浓度 限制酶鉴定 降低DNA片段的浓度
5’ 3’DNA聚合酶活性
反转录酶还具有RNaseH活性
3. 连接酶
能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（ OH ） 和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的 作用下，形成磷酸二酯键。 只能连接缺口（nick），不能连接裂口 （gap）。而且被连接的DNA链必须是双链。
连接酶的来源
DNA克隆/ 基因克隆/ 分子克 隆
• 将重组的DNA通过一定方式导入宿主细胞 内，并且在宿主细胞中进行复制扩增，形 成大量与亲代分子完全相同的子代DNA分 子的过程。
（二）DNA重组与克隆的应用
1、获得大量DNA拷贝
2、体外生产蛋白质
3、基因治疗
（三）历史
1944 肺炎双球菌转化实验，证实DNA是遗传物质 1953 DNA双螺旋模型 1960’s 遗传密码 中心法则 1970 发现反转录酶，丰富了中心法则 1946- 发现质粒，为重组DNA提供了载体 1968-70 发现限制性内切酶，使DNA克隆成为可能 1972 成功切割DNA，并与载体相连 1973 成功转化宿主细胞，DNA克隆成功
基因克隆技术路线
分
切
接
转
筛
（五） 工具酶
1. 限制性内切核酸酶 定义 内切：在DNA内部切割 限制性：识别特异序列，在特异位点切割 ------GAATTC-----------CTTAAG-----EcoRⅠ酶切位点
分类
Ⅰ Ⅱ
双链DNA
Mg2+
Ⅲ
双链DNA
Mg2+ ATP
DNA底物 双链DNA 辅因子 Mg ATP SAM 识别序列 特异 切割位点 非特定
组织或细胞染色体DNA
限制性内切酶 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 受体菌载体所携带的所
有基因组DNA的集合。
组织或培养细胞
mRNA cDNA
载体
cDNA与载体连接导入大肠杆菌 鉴定cDNA的克隆数与特征组织或细胞RNA
逆转录 cDNA
衔接物连接法
双衔接物：可以实现定向克隆，防止发 生自连，同时对克隆片段的再删除也比 较方便。
DNA接头连接法
（4） 定向克隆（最常用）
① 定义：目的基因的片段定向插入到载体分子中的 方案。 ② 方法：双酶切 ,由平末端改造（双衔接物法） ③ 优点：防止载体自身环化 正向插入 单拷贝插入 连接效率高
（2）宿主细胞
• 原核：大肠杆菌（DH5α、JM系列、HB101、SSD） • 枯草杆菌 • 真核：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞 要求： 1 对重组子的复制和扩增没有严格的限制 2 含酶较少，尤其是不含降解外源DNA的酶 3 在重组子扩增过程中，不对重组DNA进行修饰 4 不会产生重组DNA的体内重组 5 容易导入重组子 6 符合“重组DNA操作规则”的安全标准
Pst 1
3’
Pst 1
EcoR1
5’
EcoR1
5’ Pst 1 HindⅢ
Pst 1
3’
HindⅢ
正向
反向 酶切鉴定DNA片断的插入方向
（2） 平末端连接
① 产生：酶切 补齐法 削平法 ② 优点：无法解决黏末端问题时 ③ 缺点：载体自身环化 双向插入 多拷贝插入 效率低，酶用量高
（3） 接头连接
指来源不同但识别相同靶序列的核酸内 切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的 末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性 不同。 Example: 限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 (CCGG) ， 当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行 切割，而MspⅠ可以。
同尾酶（isocaudamer）
Genbank
获得homo Ⅷ因子全长序列
Ⅷ因子引物
大量Ⅷ因子基因 电泳 收集1500bp的片断 获得的是外显子
2. 载体 定义：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩 增和表达的一类DNA分子 条件： 1 复制起点 (ori) 2 多克隆位点：多种限制酶的单一切割位点 3 筛选标志 Amp+ Kan+ Neo+ 4 分子量不宜过大 否则易断裂、转化效率低 5 表达载体还要有P、E、前导序列、加尾信号、 信号肽、核定位序列等
终止密码
色 氨 酸 精 氨 酸 精 氨 酸 精 氨 酸 精 氨 酸 丝 氨 酸 丝 氨 酸
C
亮 氨 酸 亮 氨 酸 异亮氨酸 异亮氨酸
A
异亮氨酸
甲硫氨酸
*
苏氨酸
苏氨酸 丙氨酸 丙氨酸 丙氨酸 丙氨酸
赖 氨 酸
赖 氨 酸 天冬氨酸 天冬氨酸 谷 氨 酸 谷 氨 酸
精 氨 酸
精 氨 酸 甘 氨 酸 甘 氨 酸 甘 氨 酸 甘 氨 酸
载体种类
功能 克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断 表达载体: 用于一个基因的蛋白表达 整合载体: 把一个基因插入到染色体组中
载 体种类
来源：
质粒载体
噬菌体载体
病毒载体
质粒（plasmid）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA
分子。大小约为
数千碱基对（3－10kb)。
常有1 ~ 3个抗药
性基因，以利于 筛选。
双酶切
HindⅢ EcoRⅠ
HindⅢ
EcoRⅠ
在获得DNA片段时，通过PCR加入所需位点 EcoRⅠ
HindⅢ
5.重组DNA的转化
（1）定义
转化作用(transformation)： 质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入 细菌的过程。 转染 (transfection)：重组噬菌体或病毒导入宿 主细胞的过程。 转导作用(transduction)：以噬菌体为媒介，将 外源DNA导入细胞的过程。
1. DNA连接酶： 大肠杆菌染色体编码的，粘末端连接，NAD+供 能 2. T4 DNA连接酶： T4噬菌体DNA编码的，粘末端、平末端连接， 已知唯一平末端连接酶，ATP供能