抗生素微生物检定标准操作规程(doc 22页)
药品微生物限度检验方法标准操作规程.(DOC)
标准操作规程目的：建立一个药品微生物限度检验标准操作规程。
范围：适用于本企业生产的所有品种，本企业所有洁净生产区域，QC微生物限度检查室，洁净工作室等。
责任者：QC主任、化验员。
规程：本规程引至《中国药典》2000年版。
1. 概述：微生物限度检查系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。
我公司QC设无菌操作室，用于微生物限度检查。
无菌操作室的管理及使用制度见本文附录一。
2. 抽样：供试品应按批号随即抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍。
抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选用疑问的样品，但因机构损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。
3. 供试品的保存：供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。
供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。
4. 检查：4.1. 使用设备：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75％酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。
4.2. 检查的全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。
使用设备、仪器、人员及无菌操作室常用的消毒、灭菌方法见本文附录二。
除另有规定外，供试品制备成供试液后，均在均匀状态取样。
制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。
4.3. 培养：除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30－35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25－28℃，控制菌培养温度为36±1℃，检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。
4.4. 复检4.4.1. 菌数测定不合格者应复检，控制菌检查以一次检出为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。
4.4.2. 以复试项下不合格项目为准，作单项复试。
抗生素微生物检定操作规程
[转载]抗生素微生物检定法（上）(2010-07-30 16:00:26)转载原文标签：转载原文地址：抗生素微生物检定法（上）作者：yingying本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验（标准曲线法除外）。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
（一）基本设备、用具、试验材料及标准品1. 基本设备（1）抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。
该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
（2）超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。
（3）抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2. 用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16~17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。
新购的双碟应按上述要求进行检查。
检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140~160 ℃干热灭菌2小时后备用。
（2）陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
（3）不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
（4）小钢管放置器：四孔和六孔各一台。
（5）游标卡尺：精密度0.02mm。
（6）滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。
抗生素微生物检定标准操作规程
山西振东制药目的：建立抗生素微生物检定标准操作规程范围：抗生素类药依据：《中国药品检验标准操作规程》2010年版责任：化验员严格按操作规程操作班组长对检验人员的操作进行监督和指导中心化验室主任对检验人员进行培训考核，并对检验人员操作进行监督和指导内容：1 术语或定义本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
2 程序2.1 操作前准备2.1.1 抗生素管碟测定法2.1.1.1 仪器与用具操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。
半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为100～10000级）及空调设备，控制室温度在20~25℃之间，达到无菌或半无菌状态。
操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。
注意操作，避免室内抗生素污染。
双碟内径约90mm高16～17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。
碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一张白纸碟内加水2～3ml，再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。
陶瓦盖内径约203mm，外径108mm，平坦，吸水性强，应定期清洗、干燥或干热灭菌。
钢管内径（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm，外径（8.0±0.1）mm或（7.8±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端平坦，管壁厚薄一致。
每次使用后应置1:1000新洁尔灭溶液内，浸泡2h以上，灭菌后再洗涤，先用水洗涤，超声波超声30min 后用沾有去污粉的纱布条串擦内外壁，水冲洗，沥干，再用蒸馏水冲洗3次后，置带盖的容器内，在150～160℃干热灭菌2h，备用。
钢管放置器有6孔和4孔两种。
放置于无菌或半无菌的操作平台上，钢管下落时应垂直平稳、位置正确。
微生物限度检查操作规程
微生物限度检查操作规程微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠1.目的微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠建立一个微生物限度检查（包括细菌、霉菌、酵母菌）标准工作程序，规范QC微生物限度检查人员的微生物限度检查操作。
微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠2.范围微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠适用于本公司的细菌、霉菌、酵母菌的限度检测。
微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠3.责任者微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠QC微生物限度检查人员；质量管理部微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠4.内容微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠4.1检测准备微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠4.1.1 QC人员接到微生物限度检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定微生物限度检查所需的容器具、试液、培养基等的项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行微生物限度检查前的准备工作。
第七章 抗生素微生物检定法
2
管碟琼脂扩散法
抗生素管碟测定法是利用抗生素在摊布特定试 验菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含一定 浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现
透明的抑菌圈。
3
该法根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂 量与抑菌圈的直径或面积呈线性关系，通过比较 标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试 品的效价。
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（2）三剂量法
取双碟六个，在每个双碟内间隔的3个不锈钢管中 分别滴加高、中及低浓度的标准液，其余两个不锈 钢管中分别滴加高、中及低浓度的供试品溶液。三 个浓度的剂距比为1：0.8。35-37℃ 培养14-16h， 用游标卡尺测量抑菌圈直径。
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7、结果判定
实验计算所得效价低于估计效价的90%或高
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无菌检查法
3、随机抽取2份样品，无菌接种后，
分别在30-35℃和20-25℃培养7日。 4、结果判定： 无菌生长为符合规定。
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第七章 抗生素微生物检定法 无菌检查法
第一部分 抗生素微生物检定法 第二部分 无菌检查法
1
第一节 抗生素微生物检定法
本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用， 比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑 菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 依试验设计原理不同，分为稀释法、比浊法、 琼脂扩散法。 中国兽药典采用管碟琼脂扩散法。
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6、检定法
（1）二剂量法 取双碟四个，在每个双碟内对角线2个不锈钢管 中分别滴加高浓度及浓度的标准液，其余两个不 锈钢管中分别滴加高浓度及低浓度的供试品溶液。 高、低浓度的剂距比为2：1或4：1。35-37℃ 培 养14-16h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。滴加抗 生素溶液：滴加溶液至钢管口平满，滴加溶液间 隔时间不可过长 。
微生物限度检查法标准操作规程(参考Word)
1. 目的：建立微生物限度检查法标准操作规程2. 范围：适用于原辅料及成品的微生物限度检查。
3. 责任人：QC负责实施，QC主管负责监督。
4. 程序：4.1 检验依据《中华人民共和国药典》2005年版一部附录P704.2 检验规程4.2.1 微生物限度检查法总则4.2.1.1微生物限度检查法系指检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌的检查。
4.2.1.2微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
4.2.1.3供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。
4.2.1.4除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃，控制菌培养温度为35～37℃。
4.2.1.5检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告。
4.2.2 供试品的检验量：检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。
除另有规定外，一般供试品检验量为10g 或10ml ；中药膜剂为50cm2,贵重药品、微量包装药品检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。
检验时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4 丸，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
4.2.3供试液的制备按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
4.2.3.1液体供试品取供试品10ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。
油剂可加适量无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
抗生素微生物检定法
抗生素微生物检定法——灭菌缓冲液及菌悬液的制备录入时间:2008-10-20 13:28:14 来源：青岛海博一、灭菌缓冲液磷酸盐缓冲液(pH6.0) 取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液(pH7.8) 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液(pH10.5) 取磷酸氢二钾35g，加10mol/L氢氧化钾溶液2ml，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
二、菌悬液的制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液取枯草芽孢杆菌［CMCC（B） 63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日, 用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。
用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）悬液取短小芽孢杆菌［CMCC（B）63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面,用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）悬液取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
抗生素微生物检定法
放置牛津杯时，注意管与管之间不能太靠近，否那么会引起相邻的两个抑菌圈 之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管 与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为 非平面，会影响抑菌圈的形状。可在试验前在双碟的底上用尺测量，作好标记， 试验中可以按照双碟底面标记放置牛津杯，防止放置位置不恰当产生的问题。
7.2 用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下 测量。不宜取去牛津杯再测量，因为牛津杯中剩余的抗生素溶液会流出扩 散，使抑菌圈变得模糊。不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面
玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。记录测量结果后进行效价计算。 8.讨论
试验中，往往会出现异常情况，使得试验结果与预期出现很大差异。因此 抗生素试验的每一步都需要仔细谨慎，严格按照操作标准，才可以得到准 确的检测结果。准确测定抗生素效价，对评价抗生素的治疗效果，指导临
式中：P为供试品效价〔相当于标示量或估计效价的百分数〕 S2为标准品高浓度溶液所致抑菌圈直径〔或面积〕的总和； T2为供试品高浓度溶液所致抑菌圈直径〔或面积〕的总和； S1为标准品低浓度溶液所致抑菌圈直径〔或面积〕的总和； T2为供试品低浓度溶液所致抑菌圈直径〔或面积〕的总和； I为高、低浓度之比的对数值，2：1时，I=0.301；4：1时，I=0.602
管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具 有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结 果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试 验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下 分析及提出解决的方法。
1. 实验器材的准备 1.1 实验器材的选择 试验应该选择底面平整的玻璃双碟，防止底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双 碟放置在水平台上，下垫一层白纸，参加3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否 深浅一致来判断双碟底面平整程度。牛津杯那么应该选择加工精细的同一批产品， 这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得牛津杯在培养基中下陷相同的深度， 抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果牛津杯两端不够平，就应予剔除，否那么会 使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。
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抗生素微生物检定标准操作规程1 简述抗生素微生物检定法系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。
后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。
中国药典也采用这两种方法。
抗生素微生物检定管碟测定法系琼脂扩散法，是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
抗生素微生物比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验菌的液体培养基内，混均后，经培养，测量培养基浊度。
此法系根据抗生素在一定的浓度范围内，其浓度或浓度的数学转换值与试验菌生长产生的浊度（浊度与细菌群体质量及细菌细胞容积的增加之间存在直接关系）之间存在线性关系而设计，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，计算出供试品的效价。
抗生素效价以“单位（u）”或“微克（µg）”表示。
抗生素管碟测定法2 仪器与用具2.1 操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。
半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为100级～10，000级）及空调设备，控制室温在20～25℃之间，达到无菌或半无菌状态。
操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。
注意操作，避免室内抗生素污染。
2.2 双碟内径约90mm，高16～17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。
碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一张白纸，碟内加水2～3ml，再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。
用过的双碟经高压灭菌倒出培养基后，置清洗液中浸泡过夜，冲洗，沥干，至150℃～160℃干热灭菌2小时或高压121℃蒸气灭菌30分钟，备用。
2.3 陶瓦盖内径约103mm，外径108mm，平坦，吸水性强，应定期清洗、干燥或干热灭菌。
2.4 钢管内径（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm；外径（8.0±0.1）mm或（7.8±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光洁平坦，管壁厚薄一致。
每次使用后应置1:1000新洁尔溶液内，浸泡2小时以上，灭菌后再洗涤，先用水洗涤，超声波超声30分钟或用沾有去污粉的纱布条串擦内外壁，水冲洗，沥干，再用蒸馏水冲洗3次后，置带盖的容器内，在150℃～160℃干热灭菌2小时，备用。
2.5 钢管放置器有6孔和4孔两种。
放置于无菌或半无菌室的操作平台上，钢管下落时应垂直平稳、位置正确。
双碟升降平稳。
应保持清洁，防止抗生素污染。
可定期用75%乙醇棉擦拭落管筒及储管杯。
置钢管的玻璃管应定期干烤灭菌。
2.6 恒温培养箱以隔水式为宜，温度平稳，波动小。
设置漂移温度为35～37℃或24～26℃，依各品种要求而定，箱内网状隔板上放置带孔的玻璃板并调整水平。
2.7 灭菌刻度吸管用于吸取菌液及培养基。
使用后应立即置5%石炭酸或1:1000新洁尔溶液中消毒后，再按玻璃容器的常规洗涤法洗涤。
洗涤沥干后在吸口处塞入脱脂棉（松动，透气），置适宜容器中，在120℃以上干热灭菌2小时或121℃蒸气灭菌30分钟，烘干备用。
2.8 玻璃容器包括定量移液管、刻度吸管、容量瓶等，均应符合“常用玻璃量器国家计量检定规程”的规定。
每次使用前用清洁液浸泡，水冲洗，并用蒸馏水或去离子说冲洗3次，沥干。
2.9 称量瓶重量在10g以下。
用毕先用水冲洗、沥干，置清洁液浸泡2小时以上，然后分别用水、蒸馏水或去离子说冲洗3次，置洁净平皿中，在120℃干热灭菌3小时，待冷至60～70℃时，取出置于干燥中备用。
2.10 滴管用玻璃管拉制，管口光滑。
使用前在清洁液浸泡，分别用水、蒸馏水后去离子水冲洗3次，置适宜容器中，在120℃干燥3小时后备用。
2.11 天平分析天平，精密度0.1mg，经计量检定。
2.12 抑菌圈直径（面积）测量仪应符合“抑菌圈测量仪检定规程”的规定。
2.13 游标卡尺精度0.05mm，长度125mm。
2.14 超净工作台有效工作面局部洁净度100级。
用于试验菌的接种传代或菌悬液制备。
超净工作台须置洁净工作室或半无菌室内。
3 试液3.1 灭菌缓冲液制备缓冲液的试剂应为分析纯，配制后的缓冲液应澄明，分装于玻璃容器内，经121℃蒸气灭菌30分钟备用。
3.1.1 磷酸盐缓冲液（pH6.0）取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过。
3.1.2 磷酸盐缓冲液（pH7.0）取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）9.39g 与磷酸二氢钾3.5g，加水使成1000ml，滤过。
3.1.3 磷酸盐缓冲液（pH7.8）取磷酸氢二钾 5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过。
3.1.4磷酸盐缓冲液（pH10.5）取磷酸氢二钾35g，加氢氧化钾液，加水使成1000ml，滤过。
4 培养基配制培养基的各成分原料质量对抑菌圈边缘清晰度及试验结果影响较大，因此应对原材料进行预试验，挑选适当的品牌使用。
制成的培养基不应有沉淀，如产生沉淀，可在配制培养基后，于115℃加热20分钟溶化，趁热用纸浆减压或适宜方法过滤，调整pH 值，分装灭菌备用。
中国药典2005年版二部附录的抗生素生物检定法中收载了13种不同处方的培养基及制备方法。
目前，已有市售干燥培养基，使用方便。
临用时按照使用说明进行配制，但应注意核对培养基的pH，必要时需调节pH，使其符合规定。
另外，市售干燥培养基的质量也存在差异，注意选择合适的产品。
5 试验菌5.1 菌种的复苏检定用标准菌种为冷冻干燥品，由中国药品生物制品检定所提供。
5.1.1 取冻干菌种管、灭菌1ml毛细滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面，移入接种室操作台或超净工作台。
5.1.2 将冻干菌种管外壁用碘酒（碘状）擦拭消毒，稍干，用75%乙醇棉球擦净，放在灭菌双碟内，待干。
点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基，滴在上述灼热的菌种管封口端，使其骤冷炸裂。
5.1.3 取灭菌镊子，在酒精灯火焰上方，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动是其溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将毛细滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养琼脂斜面置35～37℃培养22～24小时。
5.1.4 取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌，涂片并进行革兰氏染色镜检，如呈典型菌落，则转种3代即可使用。
菌落不典型时，可进行平板分离单菌落。
5.2 菌种的接种与保存5.2.1 准备需用的培养基，培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。
在标签上注明菌名及接种日期。
从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
5.2.2 点燃酒精灯或煤气灯等，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒种，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。
右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰上方。
塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折蛇形移动，使细菌接种在斜面的表面上。
5.2.3 取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。
5.2.4 将已接种的细菌管置35～37℃培养22～24小时，霉菌管一般置24～25℃霉菌培养箱内培养7天。
培养后放入4℃冷藏箱内保存，一般1～3个月转种一次。
5.3 菌悬液的制备5.3.1 枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis CMCC（B）63 501]悬液取枯草芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，加灭菌水1～2ml将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬液接种至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶内，均匀摊布，在35～37℃培养7天。
取菌苔少许涂片，革兰氏染色镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水10ml将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，在65℃水浴中加热30分钟将菌体杀死，待冷后置4℃冷藏箱贮藏。
此菌液为浓菌液。
日常试验用菌液取上述浓溶液，用灭菌水1:3稀释至灭菌试管中，冷藏箱保存备用。
5.3.2 短小芽孢杆菌[Bacillus subtilis CMCC（B）63 202]悬液取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备芽孢悬液。
5.3.3 金黄色葡萄球菌[Staphylococus aureusCMCC（B）26 003]悬液取金黄色葡萄球菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种至营养琼脂斜面上，在35～37℃培养22～24小时，临用时，用灭菌水将菌苔洗下，制成悬液。
置4℃冷藏箱保存，可使用3天。
5.3.4 藤黄微球菌[Micrococcus luteus CMCC（B）28 001]悬液取藤黄微球菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，用1ml培养基Ⅲ将菌苔洗下，用吸管移至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶中，均匀摊布，将培养瓶倒置于培养箱中26～27℃培养24小时取出，用吸管吸取培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液5ml至培养瓶中，将菌苔洗下，合并菌液至灭菌大试管中备用。
置4℃冰箱中保存，可使用1～2个月。
5.3.5 大肠杆菌[Eschehchia coli CMCC（B）44 103]悬液取大肠杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照金黄色葡萄球菌菌悬液项下的方法制备菌悬液，供当日使用。
5.3.6 肺炎克雷伯氏菌[Klebosiella pneumoniae CMCC（B）46 117]悬液取肺炎克雷伯氏菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照金黄色葡萄球菌菌悬液项下的方法制备菌悬液，供当日使用。
5.3.7 啤酒酵母菌[Saccharomyces cerevisiae9736]悬液取啤酒酵母菌的V号培养基琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种于Ⅳ号培养基斜面上，在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下，放至含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，以当日使用为宜。
试验菌的菌龄对抑菌圈边缘清晰度有一定影响，应保持菌种新鲜。