抗生素微生物检定法讲解学习
抗生素微生物检定管碟法
抗生素微生物检定管碟法抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。
各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。
抗生素微生物检定法讲解学习
结果计算及判断
结果计算及判断
▪ 抑菌圈的测量以及结 果的可靠性检验及效 价测定
多功能微生物自动测量分析仪
结果可靠性分析
▪ 试品间（F1）：供试品的估计效价是 否合适。P＞0.05
▪ 回归（F2）：剂量反应关系是否成立。 P＜0.01
▪ 偏离平行（F3）：量反应直线的斜率 是否有显著差异。P＞0.05
▪ 剂间（F6）：不同浓度间的差异是否 显著。P＜0.01
▪ 碟间（F7）：同一浓度间差异是否显 著。 P＞0.05
结果计算及判断
▪ 重试判定
▪ 抑菌圈大小的要求
▪ 可靠性检验：符合可靠性检验的各项规定
▪ 可信限率：供试品效价测定结果（PT）的 可信限率除特殊规定外，不得大于5%。
▪ 实测效价与估计效价：应在90~110%之间， 否则结果仅作为初试，应予以重试。
▪ 效价测定结果不符合规定时，需换人加倍 复试。
二剂量法计算
P=log1T T2 2 T S12ST21 S S1 1I100%
结果计算及判断
检定的影响因素
▪ 标准品与供试品的同质性 ▪ 抑菌圈质量的控制 ▪ 直线斜率的控制 ▪ 直线截距的控制
抑菌圈的形状
试验中抑菌圈常有破裂、不远、甚 至无圈的现象： ▪ 在滴加抗生素溶液时药液溅出、碰到 钢管壁引起漏液，导致不圆 ▪ 双碟、钢管等残留抗生素或清洁液 ▪ 试验菌菌龄过老、检定菌被烫死等 ▪ 缓冲盐的Ph值和盐浓度影响扩散
试验准备
试验准备
管碟法的操作步骤
▪ 培养基的制备
管碟法的操作步骤
▪ 底层的制备： 每碟加底层培养基20ml，
待培养基凝固后，盖上 陶瓦盖，置35~37℃培 养箱中，待用。 ▪ 菌层的制备： 加入约含1%浓度菌悬液的 培养基5ml作为菌层
抗生素微生物检定法的增修订内容及操作要点
该方程奠定了管碟法量－反应直线公式 的基础。
将上述公式简化、移行，并将自然对数 转换为常用对数得：
lg M 1 r 2 lg C'4DTH
9.21DT
上述公式表明，抗生素总量的对数(lgM) 与所形成的抑菌圈半径的平方(r2)呈直 线关系，即通过抑菌圈的大小来测定抗 生素抗菌活性物质的量。
抗生素微生物检定法的增修订 内容及操作要点
抗生素微生物检定法
1．抗生素微生物检定法的概况 2．微生物效价测定法国内外药典的比较 3．微生物效价测定法的操作要点 4．微生物效价检定法的建立和方法学验 证
1．抗生素微生物检定法的概 况
1．1．定义 抗生素圈边缘清晰度是影响测定结果的重要因素之一， 导致抑菌圈边缘不清晰的原因如下：
➢ 在抑菌圈形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均 一，不符合动力学公式中各项之间的关系或各扩散 系统交叉所致。
（4）化学稳定性较差的抗生素，由于降解导致供 试品与标准品不同质。
（5）操作上可能引入的误差。
3.1.2.2．抑菌圈质量的控制
（1） 抑菌圈的形状：
实验中抑菌圈常有圈破裂、不圆、甚至无圈的现 象，其原因是多方面的:
➢ 在滴加抗生素溶液时药液溅出、毛细滴管碰到钢 管壁使抗生素溶液漏出，出现不圆等；
➢ 操作中若各钢管中加液时间不同，可影响抑菌 圈的大小，所以一组双碟加样时，应尽量缩短 加样间隔时间，并保持加样速度的均匀性，以 减少误差。
➢ 抑菌圈的大小还受抗生素扩散系数的影响，若 在缓冲液中加入0.3%的氯化钠或在培养基中加 一定量的盐或吐温，可增加抗生素的扩散能力， 使抑菌圈增大。
（3） 抑菌圈边缘清晰度的控制
抗生素微生物检定法
抗生素微生物检定法work Information Technology Company.2020YEAR抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验（标准曲线法除外）。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
（一）基本设备、用具、试验材料及标准品1. 基本设备（1）抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。
该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
（2）超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。
（3）抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2. 用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16~17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。
新购的双碟应按上述要求进行检查。
检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140~160 ℃干热灭菌2小时后备用。
（2）陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
（3）不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
（4）小钢管放置器：四孔和六孔各一台。
（5）游标卡尺：精密度0.02mm。
（6）滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。
抗生素效价的测定
微生物发的分类
• 稀释法 • 浊度法 • 双碟法
• 2、浊度法系利用抗生素在液体培养基中对 试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后 细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品 对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品 效价的种方法。
3、管碟法：是利用抗生 素在含敏 感试验菌的 琼脂培养 基中的球面 扩散渗透 作用，从而 形成一定的抑菌圈。 通 过 琼 脂培 养 基 ，可 观 察并测量 出抑菌圈的 大小。
管碟法测定操作
• 1. 试验用菌液 • 金黄色葡萄球菌悬液：取金黄色葡萄球菌 的营养斜面培养物，接种于营养琼脂斜面 上，在35~37℃培养20h到22h，；临用前用 水或者灭菌生理盐水溶液将菌苔洗下，备 用
2 供试品及标准品的配制
• 标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。供 试品应放于干燥器内至少30min方可称取。称量 最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取， 取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。 • 标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平， 样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。天平 中的干燥加入剂应保持经常注意更换。 • 称量结束后，超声波处理后的磷酸缓冲液， 定容至刻度，过滤并稀释。
（二）抑菌圈的形成
• 在平板底部四边，分别 对角注明“SH”、 “SL” 和“UH”、 “UL”标记 • 将不锈钢小管(俗称为牛 津杯)放置在含敏感试验 菌的琼脂培养基上。
th sl
uh
• 以无菌滴管分别在每个 牛津杯内加入相应的抗 生素溶液至满但不溢出 管外 • 且四杯内液面高度相同， 盖上平皿盖，静置30分 钟。
• 将培养基置入适宜试 验菌生长的培养箱中， 琼脂培养基中的试验 菌开始生长。
• 抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关； • 比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小， 可计算出抗生素的效价。
【抗生素精品课件】抗生素微生物检定法
悬液 的制
方法
备
⑤供试品溶 液的制备
④标准品溶 液的制备
学习目标 复习提问
类别 实验菌 培养基 PH
链、卡 枯草芽胞杆 Ⅰ
7.8-
庆、红 菌
8.0
新课大纲 新课内容 本课小结
四、土 滕黄八叠球 Ⅱ 氯、林 菌
6.56.6
课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容
牛肉浸 酵母浸 出粉 1.5g 出粉3g 胨5g
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
三、管碟法
T2
S1
S2
T1
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
1.理论依据：
• 扩散现象：由球面扩散动力学公式表 示
• 相当于直线方程：y=bX+c • 抗生素总量的对数值与所形成抑菌圈
直径的大小呈直线关系，来测定抗生 素抗菌活性。
2.影响因素?
学习目标
Ⅰ超净工作台
复习提问 Ⅱ抑菌圈测量仪
新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
Ⅲ双碟 Ⅳ陶瓦盖 Ⅴ钢管
Ⅻ试验菌
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
• 管碟法分为三种方法 一剂量法又称 标准曲线法，常用于原料生产的过程 监控、中间体或半成品检验；二剂量 法是抗生素质量检验的常规方法；三 剂量法主要用于标准品的标定。中国 兽药典（2005年版）收载了二剂量法 和三剂量法。
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
抗生素微生物检定法
抗生素微生物检定法来源：中国药典2000年版二部附录2006-12-10 00:30标题抗生素微生物检定法附录序号附录Ⅺ内容全文A. 抗生素微生物检定法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。
培养基及其制备方法培养基Ｉ胨5g琼脂15～20g牛肉浸出粉3g水1000ml磷酸氢二钾3g除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅱ胨6g葡萄糖1g牛肉浸出粉 1.5g琼脂15～20g酵母浸出粉6g水1000ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过,加葡萄糖溶解后,摇匀,调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6,在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅲ胨5g磷酸氢二钾 3.68g牛肉浸出粉 1.5g磷酸二氢钾 1.32g酵母浸出粉3g葡萄糖1g氯化钠 3.5g水1000ml除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅳ胨10g葡萄糖10g氯化钠10g琼脂20～30g枸橼酸钠10g水1000ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅴ胨10g琼脂15～20g麦芽糖40g水1000ml除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，按需要分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
抗生素效价测定技术—抗生素效价微生物检定法
知识点3：浊度法
四、检定操作方法
（一）线性试验
除另有规定外，取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各试验
管内精密加入含试验菌的液体培养基9. 0ml，再分别精密加入各浓
度的标准品溶液1.0ml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定
条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4小时）。
知识点3：浊度法
（三）空白试验
线关系，可采用t检验。
4．测定结果的计算及可信限率估计。
5．实验计算所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的1 10%，则检验
结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。
知识点3：浊度法
6．原料药效价测定一般需双份样品，平行实验以便核对。对不符
合规定的样品应至少有2次符合规定的结果，才能发出报告。
供试品低剂量溶液
（即SH→TH→SL→TL）
6.测量抑菌圈 双碟透明度好，无破损和不透明现象；抑菌圈应圆满，无破
圈或圈不完整现象，否则应弃去该双碟。
技能点1：二剂量法操作规程
技能点1：二剂量法操作规程
技能点1：二剂量法操作规程
在恒温培养箱中培养至规定时间
技能点1：二剂量法操作规程
• 测量抑制圈
的污染，放双碟的台面应用水平仪调水平。
玻璃/塑料
平皿(d=90mm
h=16-17mm)
菌层
5ml
含菌培养基
底层
20ml
灭菌培养基
技能点1：二剂量法操作规程
制备底层
制备菌层
技能点1：二剂量法操作规程
4.放置钢管
5.滴碟、培养
毛细滴管（或滴管）滴碟
滴加顺序：按标准品高剂量溶液→供试品高剂量溶液→标准品低剂量溶液→
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试验准备
试验准备
管碟法的操作底层的制备： 每碟加底层培养基20ml，
待培养基凝固后，盖上 陶瓦盖，置35~37℃培 养箱中，待用。 ▪ 菌层的制备： 加入约含1%浓度菌悬液的 培养基5ml作为菌层
管碟法的操作步骤
▪ 加钢圈 ▪ 滴加抗生素溶液
培养
▪ 温度：一般为 36~37℃
▪ 对复方制剂产品的检验，微生物检定法选 择性差，效价测定受其他成分的影响。
▪ 如：妥布霉素滴眼液，配方中含苯扎溴胺 作为防腐剂，苯扎溴胺具有抑菌作用，使 样品的抑菌圈增大，导致标准品和样品的 剂量反应曲线偏离，无法测准妥布霉素的 含量。
抗生素微生物检定法分类
▪ 1.稀释法 ▪ 2.浊度法 ▪ 3.琼脂扩散法（管碟法和打孔法） ▪ 2010版药典采用管碟法和浊度法来测定抗
测定不同浓度的抗生 素溶液在固体培养基 表面产生的抑菌圈的 大小
目的 抗生素最低抑菌浓 抗生素抑菌效力的测定 度（MIC）的测定
应用 用于新药研制及临 抗生素效力的测定方法 床药敏试验等方面
抗生素微生物检定法 包括管碟法和浊度法
▪ 管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的 固体培养基内成球面形扩散，形成含一定 浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖 而呈现出透明的抑菌圈。根据抗生素在一 定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径 （面积）呈直线关系而设计，通过检测抗 生素对微生物的抑制作用，比较标准品与 供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品 的效价。
会影响抗生素效价的测定
管碟法
▪ 利用抗生素在固体培 养基中的平面扩散作 用，依据量反应平行 原理并采用交叉实验 设计方法。在相同的 试验条件下通过比较 标准品（已知效价） 和供试品两者对所接 种试验菌产生的抑菌 圈（直径或面积）的 大小来测定供试品效 价的一种方法
管碟法
▪ 管碟法的操作步骤
预试验
试验准备
底层的制
备
供试品、标准品溶液的制备
菌层的制备
加钢圈
滴加抗生
素溶液 培养 抑菌圈的测量
结果的可靠性检验及效价测定
管碟法的操作步骤
▪ 预试验 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、
使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑 菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的 抑菌圈直径应在16~17.5cm，二剂量法高 剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在 18~22cm，三剂量法中间剂量浓度标准品 溶液所致的抑菌圈直径在15~18cm。
结果 ▪ 易于操作，比浊仪在线培养和测定，具有
客观、精密便于自动化操作的优点 ▪ 采用液体培养基，无扩散因素的影响，试
验的灵敏度高，结果的精密度和正确度都 较扩散法好
浊度法
▪ 缺点： ▪ 对试验仪器的性能及试验器具的要求较高，
如培养温度要求一致，比色管的清洁等 ▪ 任何影响液体培养基内微生物生长的因素都
抗生素微生物检定法
抗生素药品的特点
▪ 纯度一般较化学药品低 ▪ 发酵类产品通常为多组分且活性组分易发
生变异 ▪ 稳定性一般较化学药品差 ▪ 结构较一般化学药品复杂
抗生素检测技术与方法
▪ 高效液相色谱法 ▪ 高效毛细管电泳法 ▪ 气相色谱法 ▪ 高分子杂质测定法 ▪ 抗生素微生物检定法 ▪ 溶出度 ▪ 不溶性微粒 ▪ 澄清度 ▪ 溶液颜色
抗生素微生物检定法
定义：抗生素微生物检定法是利用抗生素在 低微浓度下有选择地抑制或杀死微生物的 特点，以微生物的抗菌活性为指标，来衡 量抗生素中的有效成分效力的方法。
方法：本法是在适宜的条件下，根据量反应 平行原理设计，通过检测抗生素对微生物 的一直作用，计算抗生素活性（效价）的 方法。
量反应平行原理
等量试验菌菌液在不同浓度的抗 不同浓度的抗生素在含有试验 生素液体培养基中的生长情况 菌固体培养基中的扩散情况
用光度法测定不同浓度的抗生素 测定不同浓度的抗生素溶液在
的液体培养基的浊度
固体培养基表面产生的抑菌圈
的大小
不
速度快，试验过程3-4小时，可在 速度慢，试验过程16-20小时，
同
当天获得结果
第二天才能获取结果
▪ 2.多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的 差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、 寒冷和活性的关系；
▪ 3.许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当 的分析方法测定其效价；
▪ 4.同时微生物法所需仪器设备简单，成本较低。
微生物检定法的局限性
▪ 本法测定的是有抑菌作用物质的总效价， 测定结果不能反映药品的纯度，不能排除 其他组分或活性杂质的干扰。
▪ 琼脂球面扩散动力学 公式：
▪ 奠定了管碟法量反应 直线公式的基础
r2 = 4 D T ln M /H ln C ln 4D T
lgM= 1 r2lgC4DTH
9.21DT
抗生素微生物检定法的概况
▪ 微生物检定法的特点 ▪ 1.微生物检定法可直观、特异性地反映出抗生
素药品的抗菌活性，显示临床的特点；
点
易于操作，比浊仪在线培养和测 操作繁琐，多为手工操作，不
定，具有客观、精密便于自动化 易掌握
操作的优点
采用液体培养基，无扩散因素的 管碟法应用范围广，培养条件 影响，试验的灵敏度高，结果的 要求较宽，但实验过程长，试 精密度和正确度都较扩散法好 验结果易受琼脂扩散性的影响
浊度法
▪ 优点： ▪ 速度快，试验过程3-4小时，可在当天获得
▪ 时间：一般为16~18h
结果计算及判断
结果计算及判断
▪ 抑菌圈的测量以及结 果的可靠性检验及效 价测定
多功能微生物自动测量分析仪
抗生素微生物检定法 包括管碟法和浊度法
▪ 比浊法：通过监测等量的试验菌菌液在不 同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况， 利用分光光度法测定含不同浓度的抗生素 的液体培养基的浊度，从而衡量抗生素抑 菌效力的发疯，可用于抗生素药物的含量 （效价）测定。
浊度法与管碟法方法比较
比浊法
管碟法
相同点 标准品、供试品抗菌效力的比较
生素的效价
抗生素微生物检定方法比较
稀释法
浊度法
琼脂扩散法
相同点 标准品、供试品抗菌效力的比较
不同点 等量的试验菌菌液在不同浓度的抗 不同浓度的抗生素溶
生素液体培养基中的生长情况
液在含有试验菌固体
培养基中的扩散情况
含不同浓度抗生素 用光度法测定
的液体培养基中有 含不同浓度的
无细菌生长
抗生素的液体
培养基的浊度