含酚废水处理系统中苯酚降解菌的分离及分离物多样性分析
苯酚降解细菌实验报告
苯酚降解细菌实验报告引言苯酚是一种有机溶剂和消毒剂，在工业生产和日常生活中广泛使用。
然而，由于其具有较强的毒性和对环境的潜在危害，苯酚的降解成为了一个重要的研究领域。
本实验旨在从自然环境中分离得到能够降解苯酚的细菌，并对其降解效果进行评估。
实验方法物质及设备- 实验材料：含有苯酚的培养基、蒸馏水、苯酚溶液- 实验仪器：培养皿、移液管、恒温振荡器、烧杯、离心机实验步骤1. 从自然环境中采集土壤、水样品。
2. 将土壤、水样品分别加入含有苯酚的培养基中。
3. 分别在不同温度下（比如25、37）进行恒温振荡培养，培养时间根据实验需求确定。
4. 取样品进行稀释，并分别接种在含有苯酚的琼脂培养基上。
5. 利用平板计数法，计算出细菌的菌落数目。
6. 采用高效液相色谱法检测苯酚的含量。
7. 进一步筛选表现出较强降解能力的细菌，进行进一步鉴定。
实验结果细菌菌落数目在实验过程中，我们成功分离到了一株对苯酚具有较强降解能力的细菌。
经过平板计数法的计算，其细菌菌落数目为1.2x10^6 CFU/ml。
苯酚的降解效果我们利用高效液相色谱法对苯酚的降解情况进行了检测。
实验结果表明，在细菌作用下，苯酚的降解速率较快。
在48小时内，苯酚的浓度从初始浓度的100 mg/L 降至5 mg/L，降解率达到了95%以上。
数据分析与讨论细菌的降解机制细菌通过代谢苯酚的酶系将苯酚降解为无机化合物，并利用其作为碳源和能源。
该细菌可能通过以下途径降解苯酚：1. 将苯酚通过羟化作用转化为苯酚羟化物；2. 苯酚羟化物经进一步代谢，生成苯甲酸、邻苯酚等化合物；3. 经过一系列代谢反应，最终生成无机化合物，如水和二氧化碳。
细菌的应用前景本实验分离得到的对苯酚具有降解能力的细菌，拥有较高的降解效率和广泛的适应性。
这些细菌可应用于苯酚的处理和环境修复，对于解决苯酚污染问题具有良好的应用前景。
结论通过本次实验，我们成功地分离出具有苯酚降解能力的细菌，并对其降解效果进行了评估。
苯酚降解菌的分离和鉴定
目录目录 (1)摘要 (2)Abstract (3)第一章绪论 (4)1.1 苯酚降解菌的定义及分类 (4)1.2苯酚降解菌的性质及其用途 (4)1.3苯酚降解的研究现状 (5)1.4苯酚降解菌生产菌的筛选 (6)1.5本课题的研究思路及意义 (6)第二章材料与方法 (7)2.1试验材料 (7)2.2试验方法 (8)2.2.2苯酚降解菌的驯化 (8)2.2.3菌种在不同条件下的降解能力 (9)2.2.4最优菌种的鉴定 (9)3.1苯酚降解菌筛选结果及性状初步研究 (11)3.11筛选结果 (11)3.1.1.1初步筛选的结果 (11)3.1.1.2 菌种驯化中的结果 (11)3.1.2 H-1菌株的性状初步结果 (13)3.2 H-1菌株分类鉴定结果 (13)第四章结论 (14)4.1菌种的筛选结果 (14)4.2菌种的鉴定 (14)参考文献 (15)致谢.......................................................................................... 错误!未定义书签。
一株苯酚降解菌的分离和鉴定摘要为了寻找能高效降解苯酚的微生物, 从土壤中筛选得到了一株苯酚降解菌,通过逐渐增加苯酚的浓度,然后驯化出一株高效降解苯酚的细菌H-1. 当在30 ℃培养48h 时其降解率高达92.11%. 经理化特征测定及外观鉴定,将其初步鉴定为假单胞菌属.再经过对比实验测各种因素(碳源、温度、pH、通气) 对该菌生长及降解苯酚能力的影响,得知该菌能以苯酚作为唯一碳源,最适生长温度为32 ℃,最适pH 为7.0. 该菌为好氧菌,在空气充足的条件下可提高降解能力.该菌菌落较小，菌落呈微黄色。
菌体呈直或微弯的杆装，没有菌柄也没有鞘。
不产芽孢。
对该菌做生化鉴定，可知该菌革兰氏染色为阴性，可水解苯酚，生长温度为32℃，生长pH为pH 6.5～7.5。
一株酚降解菌株的分离鉴定及特性研究
一株酚降解菌株的分离鉴定及特性研究
含酚废水是一类危害大、污染范围广的工业废水，主要含有各种酚类化合物，如苯酚、对硝基苯酚、二甲酚等，其中苯酚是主要的污染物质。
苯酚毒性较大，对皮肤黏膜有腐蚀作用，并破坏微生物质膜，我国以及世界发达国家都将苯酚列为优先监测环境污染物。
酚类物质对生物活体均能产生毒害，如可使蛋白质凝固，可引起中枢神经痉挛，水溶液中的苯酚可被皮肤吸收而引起中毒川。
人们长期饮用受酚类化合物污染的水会引起头昏、贫血及各种神经系统疾病；当水中酚类含量大于10 mR／L时，鱼类等水生生物不能生存。
含酚浓度高的废水如用于灌溉，将导致农作物的减产和枯死。
含酚废水在我国被列为重点解决的有害废水之一。
某种苯酚降解细菌的分离,纯化,鉴定
某种苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定一、引言近年来，环境污染问题日益突出，其中有机污染物的排放成为了一个备受关注的话题。
苯酚作为一种有机化合物，其在工业生产和生活中被广泛使用，但是其排放也给环境造成了不小的压力。
寻找一种能够高效降解苯酚的细菌成为了当下研究的热点之一。
本文将围绕某种苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定展开讨论。
二、苯酚降解细菌的分离1. 采样地点选择在开始分离苯酚降解细菌之前，首先需要明确采样地点的选择。
一般来说，苯酚的排放源比较集中，因此我们可以选择一些工业废水排放口、化工厂周围土壤和水体等地点进行采样。
2. 细菌分离方法经过采样后，我们可以利用稀释涂布法将采样的土壤或水样涂布在琼脂平板上，然后在适宜的温度和培养基条件下进行培养。
通过分离光圈和纯化培养，我们可以获得一系列有苯酚降解能力的细菌菌落。
三、苯酚降解细菌的纯化1. 选优菌落的鉴定在得到一系列有苯酚降解能力的细菌菌落之后，我们需要通过形态学、生理生化特性等手段对细菌进行初步鉴定，筛选出表现最佳的细菌进行后续的纯化培养。
2. 纯化培养方法对选优细菌进行纯化培养可以采用多次转接法，即将单一细菌菌落进行二次以上的转接，以获得单一细菌培养物。
四、苯酚降解细菌的鉴定1. 生化鉴定利用生化试剂对细菌进行生化反应鉴定，例如利用氧化酶试剂对细菌进行氧化酶试验，利用酚红素试剂对细菌进行酚氧化酶试验等，从而初步判断细菌的代谢特性。
2. 分子生物学鉴定通过16S rRNA基因测序鉴定细菌的亲缘关系，确定其属种级别的分类位置。
五、个人观点和总结苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定是一项具有挑战性的工作，需要从多个角度进行综合分析和判断。
通过本文的探讨，我们不仅仅了解了苯酚降解细菌的基本分离和纯化方法，还深入了解了细菌鉴定和分类的相关技术。
希望通过这些工作，能够为环境污染治理和资源开发提供一些有益的参考和借鉴。
苯酚是一种常见的工业化合物，在工业生产和生活中被广泛使用。
含酚焦化废水降解酚菌的分离、纯化与筛选实验报告
含酚焦化废水降解酚菌的分离、纯化与筛选学院环境与资源学院专业环境工程年级 2009级姓名秦江涛学号 2009333026含酚焦化废水降解酚菌的分离、纯化与筛选[摘要]经过适当采样，采用一定的技术分离、筛选出多种优良的脱酚菌，然后观察记录其平板菌落特征，并通过革兰氏染色确定菌种为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
[关键词]焦化废水降解酚菌分离纯化筛选我国80%的焦化废水因含多环芳烃及杂环芳烃，经生物处理后，二沉池出水难以达到排放标准。
这类物质对常规生物处理系统中的微生物具有生物陌生性及毒性，很少在短时间内被活性污泥中的微生物利用而进入生物循环，有时还会使处理系统出现事故，造成微生物活性降低或大量中毒死亡，导致活性污泥处理系统出水水质恶化。
我小组从含酚焦化废水、活性污泥中筛选酚降解菌，并对酚降解菌进行初步观察，记录菌种形态。
以期将筛选菌与活性污泥混合，用于处理含酚焦化废水。
1 实验材料1.1.微生物来源试验所用菌种来源于某焦化厂废水处理系统曝气池中的活性污泥和含酚废水，装于无菌塑料瓶中，带回实验室。
置于冰箱中保存备用。
1.2 培养基分离纯化用普通牛肉膏蛋白胨培养基。
筛选、驯化培养基选用液体培养液，见表1。
1.3试剂苯酚，草酸铵结晶紫染液，碘液，95％的酒精，番红复染液，表1试剂等。
1.4 其他物品无菌水、无菌培养皿、无菌移液管、显微镜等。
2 实验方案2.1倒平板法分离纯化一般微生物在含苯酚培养基上不能生长，苯酚耐受菌株的筛选，可采用含不同浓度梯度的苯酚培养基倒平板。
使大量菌种中的少数耐酚菌在平板的一定浓度苯酚的培养基上生成菌落，从而分离出耐酚菌种。
（1）采集的泥样，用无菌移液管取10ml接入事先已灭菌且内装90ml无菌水的三角瓶中振荡20分钟，目的是打散胶团，使细菌成单细胞状态分散于水中。
（2）用无菌移液管分别移取一定量苯酚，与15ml牛肉膏蛋白胨培养基倒平板。
制成含酚浓度为200 mg/L ，300 mg/L ，400 mg/L， 500 mg/L ，600 mg/L，700 mg/L的培养基。
苯酚降解菌处理含苯酚废水研究现状
苯酚降解菌处理含苯酚废水研究现状摘要：苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、农药和医药合成等行业生产的重要原料，却对生态环境和人体健康构成巨大威胁，因此应对含酚废水进行处理使其达到国家排放标准。
本文从苯酚的危害出发，对含酚废水的无害化处理方法进行简单介绍。
针对生物治理方法中的活性污泥法，对苯酚降解菌处理含酚废水进行综述，分别介绍了苯酚降解菌的分离鉴定方法、种类及功能研究、相关酶基因、代谢途径这四个方面。
并对苯酚降解菌处理含苯酚废水进行了展望。
关键词：苯酚降解菌含酚废水无害化处理方法分离鉴定相关酶基因1 苯酚的结构及危害1.1苯酚的结构在苯酚分子中，酚羟基上的氧原子处于sp2杂化状态，氧上两对孤对电子，一对占据sp2杂化轨道，另一对占据未参与杂化的p轨道，p电子云正好能与苯的大π键电子云发生侧面重叠，形成p-π共轭体系，从而增加了苯环上的电子云密度，增强了羟基上氢的解离能力。
1.2苯酚的危害苯酚是有机合成的重要原料，是造纸、炼焦、炼油、塑料、农药和医药合成等行业生产的原料或中间体，大量用于制造酚醛树脂以及其他高分子材料、药物、燃料和炸药等。
随着树脂、化工和高分子材料等企业对苯酚需求量的日益增加，各企业所排放的含苯酚废水量也日益增加。
由于苯酚是一种原型质毒物，具有很强的毒性，对生态环境和人体健康构成巨大威胁。
在许多国家，苯酚已被环保部门列入优先控制污染物的黑名单之中。
1.3对生态环境的危害苯酚排放到环境中不仅毒害水生生物，而且进一步与水中的氯作用产生一种毒性更强的有机污染物氯代酚，从而破坏水生生态系统。
水中含酚量>10mg/L,鱼类等水生生物不能生存；含酚量>100mg/L，若用于灌溉,将导致农作物减产和枯死。
1.4对人体健康的危害苯酚对人体任何组织都有显著腐蚀作用，可通过黏膜、皮肤的接触、吸入和误服而侵入人体内部。
接触眼后，能引起角膜严重损害，甚至失明；接触皮肤后，不引起疼痛，但在暴露部位最初呈现白色，如不迅速冲洗清除，能引起严重灼伤和全身性中毒；吸入后，可致头痛、头晕、乏力，视物模糊，肺水肿等，但较少见；误服后，引起消化道灼伤，出现烧灼痛，呼吸气带酚气味，呕吐物或大便可带血液，有胃肠穿孔的可能。
高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究
高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究引言石油、化工、煤气、焦化及酚类等生产厂排放的废水当中含有大量的苯酚[1]。
未经净化的含酚废水可导致水源被污染，致使鱼类死亡，危害农作物，最终威胁人类的健康。
许多国家将苯酚列为重要的污染物之一。
目前，国内外处理含酚废水的方法主要有物理法、化学法、微生物法及各种结合法[2]。
其中微生物法主要利用微生物的代谢活动去除废水中的有毒物，处理方法无2次污染且安全、经济。
目前，已鉴定具有降解苯酚能力的微生物主要有假单胞菌（Pseudonomonas.sp）[3]、芽孢杆菌（Bacillus.sp）[4]、酵母菌（Yeast trichosporon）[5]、根瘤菌（Rhizobia）[6]、醋酸钙不动杆菌（A. calcoaceticus）[7]等，降酚菌株多存在于酚类污染物企业排放的废水、污泥和被废水污染的土壤中[8]。
本课题拟从被苯酚废水污染的污泥中进行菌株筛选，得到耐酚菌后在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养上筛选降酚菌株，进一步测定苯酚降解的影响因素。
对特定菌株降解含酚废水的应用价值进行研究。
1 实验材料和方法1.1 菌株来源采集原黑龙江省佳木斯东郊黑龙农药化工集团废弃排污口处污泥进行菌株筛选。
1.2 培养基基础培养基：NaCl 5.0g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15～20g/L，酵母浸膏5.0g/L，调节pH为7.0。
以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基：CaCl2 0.1 g/L ，FeSO4.7H2O 0.01 g/L，K2HPO4 0.5g/L，MnSO4.7H2O 0.05 g/L，NaCl 0.2 g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4.H2O 0.01 g/L，NH4NO3 1.0 g/L苯酚按实验需要量添加，调节pH为7.0 [8]。
富集培养基：葡萄糖10.0g/L，营养琼脂33.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，调节pH为7.5。
1.3 研究内容与方法1.3.1 菌株和的驯化和分离在超净工作台中，将10mL含0.1g/L苯酚的基础培养基倒入培养皿，取10 g污泥加90mL蒸馏水搅拌15min，静置5min后取上层清液为菌原液[8]。
高效苯酚降解菌的分离与降解特性
基金项 目：佳木斯大学学 生创新课题 （课题编号 ：Ｄｚ２０１１—０２１） ＊为通讯作者
· ２５· ２０１１年 ８月
农 业 与 技 术
Ｖｏ１．３１ Ｎｏ．４
荫 种 的甯 集 与驯 化 采用 一 次性 加入 大 剂昂 化 号 】、２、３、４、５、６、７。
合 物 的方法 ［８］。将菌 种在 无菌条 件 下接 种到 ２０ｍＬ
３．１ 结 果
大面积 农 作 物种 植 区 ，利 用 松 花 江 水 进 行 灌 溉 ，
３．１．１ 筛选 出 ７株降解能力强的菌株对苯酚都有 而含酚废水直接排入江中则将对农作物造成毒害 一 定 的点适应 性 ，且对苯 酚有很强的降解能力 ， 作用 ，同时人们适用后有毒物质 在人体 内富集 ，
达 ２５％，血酚浓度为 ０．７４ｍｍｏｌ／Ｌ，１０分钟死亡。 将浓度 为 ｌ０～，１０～，１０～，１０一，ｌ０一 的土样
酚类会对人类的身心健康造成危害，毒害其他生 溶液接种到富集培养基上 ，培养 ４８ｈ后观察。
物 ，破坏了生态系统 的稳定性 ，故我国及其他国
（２）选 择 培 养基［ ］：ＫＮｏ３４．０ｇ，ＮａＣ１ ５．０ｇ，
ｓｏｒｂｅｎｔｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ８Ｏｌ￣ Ｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｔｏｗａｎｔｓ ｐｈｅｎｏｌ ａｎｄｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ［Ｊ］．ＲＰ￣ｌｃｔｉｖｅ ａｎｄ ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＰｏｌｙｍｅｒｓ，２００１，４６ （３）：
２５９—２７１
高 浓度 含 酚污 水 的研 究 仍 有 深 度 可挖 ，因此 必 须 ［８］任源 ，吴超 飞，等 ．苯胺分离菌 的驯化筛选研究 ［Ｊ］．环 境
及不 同苯酚浓度下的生长和苯酚降解情况的考察 ，
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种 ,富集培养法得到的分离物占 4 种 . 将直接涂平板得到的分离物 , 与来自不同种属苯酚降解菌的 LmPH ( the largest subunit of multi2component
第 29 卷第 5 期
2009 年 5 月
环 境 科 学 学 报 Acta Scientiae Circum stantiae
Vol . 29, No. 5 M ay, 2009
陈敏 ,方序 . 2009. 含酚废水处理系统中苯酚降解菌的分离及分离物多样性分析 [ J ]. 环境科学学报 , 29 ( 5) : 934 - 938
g ・ L - 1范围内 ,其苯酚降解效率达到了 70% ～100%.
关键词 : 苯酚降解菌 ; 遗传多样性 ; 分离培养 文章编号 : 0253 2 2468 ( 2009) 05 2934 205 中图分类号 : X172 文献标识码 : A
Isola tion and d iversity ana lysis of phenol2degrad in g bacter ia in a wa stewa ter trea tm en t plan t
1 引言 ( Introduction )
苯酚及其衍生物是含酚工业废水中的主要污 染物 , 属于高毒物质 , 具有三致 (致畸 、 致癌 、 致突
基金项目 : 浙江省自然科学基金 (No. Y307452)
Supported by the Natural Science Foundation of Zhejiang (No. Y307452)
5期
陈敏等 : 含酚废水处理系统中苯酚降解菌的分离及分离物多样性分析
935
降解作用的优良菌株 . 目前 , 国内外已经分离出许 多能 够 降 解 苯 酚 的 菌 株 ( A rutchelvan, 2006; Hun, 2003 ) ,而富集培养技术仍是分离苯酚降解菌最常 用的手段 . 但是 ,有研究者发现 , 在自然群落中可同 时存在具相同表型的生长快速和生长慢速的细菌 ; 而富集培养通常采用高营养浓度的选择性培养基 , 使低速生长的细菌不能与较高速率生长的细菌相 竞争 ,此过程中各种群生长竞争的结果往往是具最 高生长 速 率 的 一 个 或 少 数 种 群 占 优 势 ( Dunbar,
1997 ) . W atanabe ( 2002 ) 的研究小组最先用多组分
直接涂平板法 : 将污泥样品充分振荡 , 用磷酸 盐缓冲液作 10 倍稀释 . 取 0. 1 mL 各稀释度样品分 别涂布于平板分离培养基上 , 然后将平板倒置 , 在 30 ℃ 恒温培养箱内培养 1 ～2 周 . 将平板上所有单菌 落分别转接至 5 mL 的纯化培养液中 ,经培养后再将 培养液涂布到纯化培养基平板上 , 如此重复数次进 行纯化过程 . 最后挑取单菌落保藏备用 . 富集培养方法 : 取容积为 1L 的锥形瓶 , 内装富 集培养 基 500 mL , 接 入污泥 样品 10 g, 30 ℃、 100
Chen M , Fang X. 2009. Isolation and diversity analysis of phenol2degrading bacteria in a wastewater treatm ent p lant[ J ]. Acta Scientiae Circum stantiae, 29 ( 5) : 934 - 938
变 )效应 . 由于这个原因 ,苯酚的生物降解引起了人 们广泛的关注 ( Futamata, 2001; 徐玉泉 , 2000 ) . 利用 微生物有效降解苯酚等有毒有害难降解污染物的 关键问题之一 ,是要筛选出能在系统中真正起主要
作者简介 : 陈敏 ( 1963 —) ,女 ,副教授 ; E 2 mail: mchen63@163. com; Tel: 0571 - 28868325; 3 通讯作者 (责任作者 )
, NaC l 0. 1
, Fe2 ( SO4 ) 3・ H2 O 0. 01 g・ L
- 1
- 1
, M nSO4・H2 O
0101 g・ L
- 1 - 1
, ( NH4 ) 2 SO4 0. 4 g・ L
- 1 - 1
- 1
, KH2 PO4 0. 1
- 1
, K2 HPO4 0. 4 g・L , 苯酚 0. 5 g ・ L
, NaMoO4・2H2 O 0. 01
,琼脂 15. 0 g ・ L . pH = 6. 8.
PCR 试剂 、 限制性内切酶等购自 Promega公司 . 2. 3 苯酚降解菌的分离培养
统中的生长优势菌 , 而对于那些生长速率较低但可 能有重要功能的菌群却容易被忽略 . 有的研究者建 议 ,采用直接涂布平板的方法或恒化连续培养的方 法来替代富集培养 , 但至今为止 , 有关这几种培养 方法对分离某种特定细菌有效性的评价少见报道 . 苯酚羟化酶是催化苯酚代谢途径第一个反应 步骤的关键酶 , 而且是环境中占优势的酶 ( Peter,
CHEN M in
1, 3
, FANG Xu
2
1. College of L ife and Environment Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036 2. Zhejiang Institute of M icrobiology, Hangzhou 310012 Rece ived 29 July 2008; rece ived in revised form 13 November 2008; accepted 5 March 2009 Abstract: Phenol2degrading bacteria were isolated and purified from wastewater treatm ent sludge samp les . U sing direct p lating methods, 55 isolates were obtained, and by enrichment culture methods, 57 isolates were identified. Fifteen dramatically different patterns were found in the 112 isolates through analysis of the ER I C 2PCR ( enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence PCR) genom ic fingerp rints and thus at least 15 different strains were p resent . Among these 15 different strains, 11 strains were obtained through the direct p lating and 4 strains obtained through the enrichment culture. Southern blot was carried out to compare the metabolic types among the 15 different strains with p robes, which were labeled from the LmPH ( the largest subunit of multi2component phenol hydroxylase) allelic genes of Pseudom onas pu tida H and A cinetobacter ca lcoaceticus NC I B 8250. The result showed that the 11 strains from the direct p lating could be divided into at least 3 LmPH metabolic types, while the 4 strains from the enrichment culture contained only 1 LmPH metabolic type. The phenol degradation rate of the 15 rep resentative strains which had different ER IC 2PCR genom ic fingerp rints was analyzed. Strain F 26 had a phenol degradation rate of 70% ～100% over a phenol concentration range of 0. 4 ～1. 4 g ・ L - 1. Keywords: phenol2degrading bacteria; diversity analysis; isolation
phenol hydroxylase) 等位基因分子进行杂交显示 ,该 11 种分离物可分为 3 种以上不同的 LmPH 代谢类型 ; 而富集培养获得的分离物中只显示 1
种 LmPH 代谢类型 . 对显示不同 ER IC 2PCR 指纹图的 15 个代表菌株的生长和苯酚降解效率进行研究发现 ,其中 F 26 菌株在苯酚浓度 0. 4 ～1. 4
B iography: CHEN M in ( 1963 —) , female, associate p rofessor; E 2 mail: mchen63@163. com; 3 Correspond in g author
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