薄层色谱扫描法
薄层扫描法知识分享
薄层扫描法薄层扫描法一、定义薄层扫描法(TLCS)又称原位定量薄层色谱扫描法（QTLC）系指用一定的波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品定性定量的分析方法。
回顾薄层色谱法（TLC)1、薄层板的制备（硅胶板,Al2O3板，聚酰胺薄膜等）2、点样（选择合适的展开剂，在薄板底1cm处画基线，点样）3、展开（浸入展开剂，展开到距薄板顶端1~2cm)4、检视(在紫外光灯下观察斑点）了解一下薄层扫描仪薄层扫描仪的组成及主要功能薄层色谱扫描仪有多个厂家生产，型号不同，仪器外形、光路系统及某些功能也有差异，但其基本结构及主要功能是基本相同的。
每台仪器都包括主机、数据处理及信号输出等部分。
（1）分光器及测量范围大多数薄层扫描仪的分光器为光栅，少数为棱镜，极个别的用滤光片，其测量范围光栅为200-800nm，棱镜为200-2500nm。
（2）光源及检测器光源室具有可见光源钨灯，波长范围为400-800，紫外光源氘灯波长范围为200-400nm，荧光光源为氙灯或汞灯。
操作时可通过光源选择杆来变换光源选择镜的位置；检测器一般为光电倍增管。
表7-5-2 国外几种主要专用薄层色谱扫描仪二、TLCS基本原理与方法薄层扫描法可分为薄层吸收扫描及薄层荧光扫描两类方法。
1. 薄层吸收扫描法的基本原理薄层吸收扫描法是用可见光或紫外线的单色光照射展开后的薄层色谱板，测定薄层色谱斑点(简称斑点)的吸光度(A)随展开压离(L)的变化，而获得A—L 成A—Rf曲线，即薄层色谱扫描图(简称扫描图)。
曲线上的色谱峰峰面积可用于定量分析。
由于薄层板存在着明显的散射现象，而使斑点中物质的浓度与吸光度的关系不服从Beer定律，所以需田Kubelka—Munk(古柏尔卡—曼克)理论来描述。
该方程式是薄层扫描法的定量分析基础。
定量校正方法可分为曲线校直法及非线性回归法等。
薄层扫描法
薄层扫描法一、定义ﻭ薄层扫描法(TLCＳ)又称原位定量薄层色谱扫描法（QTLC)系指用一定得波长得光照射在薄层板上,对薄层色谱中有紫外或可见吸收得斑点或经照射能激发产生荧光斑点进行扫描,将扫描得到得图谱及积分值用于药品定性定量得分析方法。
ﻭ回顾薄层色谱法（TLC）1、薄层板得制备(硅胶板,Aｌ２O3板,聚酰胺薄膜等)ﻭ2、点样(选择合适得展开剂，在薄板底1cm处画基线,点样)3、展开(浸入展开剂，展开到距薄板顶端１～2cm)4、检视（在紫外光灯下观察斑点）了解一下薄层扫描仪薄层扫描仪得组成及主要功能薄层色谱扫描仪有多个厂家生产,型号不同,仪器外形、光路系统及某些功能也有差异，但其基本结构及主要功能就是基本相同得。
每台仪器都包括主机、数据处理及信号输出等部分。
ﻫ(１)分光器及测量范围大多数薄层扫描仪得分光器为光栅，少数为棱镜,极个别得用滤光片,其测量范围光栅为200－800nm,棱镜为２0０－２500nm。
ﻫ(２)光源及检测器ﻫ光源室具有可见光源钨灯,波长范围为４０0-800,紫外光源氘灯波长范围为２00-4０0nm，荧光光源为氙灯或汞灯。
操作时可通过光源选择杆来变换光源选择镜得位置;检测器一般为光电倍增管。
表７-5-2 国外几种主要专用薄层色谱扫描仪二、ＴLCS基本原理与方法薄层扫描法可分为薄层吸收扫描及薄层荧光扫描两类方法。
ﻭ１、薄层吸收扫描法得基本原理ﻭ薄层吸收扫描法就是用可见光或紫外线得单色光照射展开后得薄层色谱板,测定薄层色谱斑点(简称斑点)得吸光度(A）随展开压离(L)得变化,而获得A—Ｌ成A—Ｒf曲线,即薄层色谱扫描图(简称扫描图）。
ﻭ曲线上得色谱峰峰面积可用于定量分析。
由于薄层板存在着明显得散射现象,而使斑点中物质得浓度与吸光度得关系不服从Ｂｅｅｒ定律,所以需田Kubelｋa—Ｍunk(古柏尔卡—曼克)理论来描述。
该方程式就是薄层扫描法得定量分析基础。
定量校正方法可分为曲线校直法及非线性回归法等。
薄层色谱法
薄层色谱法薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。
1.仪器与材料（1）薄层板市售薄层板市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板，如硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜等。
自制薄层板在保证色谱质量的前提下，如需对薄层板进行特别处理和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制的薄层板。
最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、微晶纤维素等，其颗粒大小，一般要求粒径为10～40μm，加水或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.2%~0.5%）适量调成糊状，均匀涂布于玻板上。
使用涂布器涂布应能使固定相在玻板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。
玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。
（2）点样器一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。
（3）展开容器上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或有双槽展开缸，展开时须能密闭，水平展开用专用的水平展开缸。
（4）显色装置喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出，浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。
（5）检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用，暗箱内光源应有足够的光照度。
（6）薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。
2.操作方法(1) 薄层板制备市售薄层板临用前一般应在110℃活化30分钟。
聚酰胺薄膜不需活化。
铝基片薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。
如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，110℃活化，置干燥器中备用。
常用定量分析方法(精)
（4）统计检验 统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量 的两组实验数据的精密度或准确度（偶然误差或系统误 差）间是否存在显著性差异，说明新建定量方法可否代 替旧方法或优于旧方法。 统计检验包括F检验与t检验。 F检验即精密度差别检验，用以检验两组数据的精 密度或偶然误差是否存在显著性差异，一般为单侧检验。 t检验即准确度差别检验，用以检验两组测量数据 的平均值或系统误差是否存在显著性差异。若t检验证 明两种方法测得的均值不存在显著性差异时，则新方法 可以代替旧方法，t检验一般为双侧检验。 t检验与F检验的具体方法参见分析化学的有关论著， 此从略。
（一）基本原理 薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫 描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动， 测定A-l或F-l曲线。根据薄层扫描的测定方 式分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法二 种方法。
1、薄层吸收扫描法 基本原理：Kubelka-Munk理论及曲线。由于薄层板存在 明显的散射现象，斑点中物质的浓度与吸光度的关系需用 Kubelka-Munk理论及曲线来描述。Kubelka-Munk理论以斑点 的相对反射率和相对透光率计算薄层色谱斑点的吸光度，说 明了固定相的散射参数SX对斑点中物质的浓度与吸光度间关 系的影响，获得不同散射参数SX时斑点的A-KX理论曲线，即 Kubelka-Munk曲线。 光源：钨灯和氘灯； 灵敏度：在200-800nm波长范围内选择合适波长进行测 定，其灵敏度可达ng级； 适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通 过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。
2、薄层荧光扫描法 基本原理：F=2.3K’I。ECL或F=KC 光源：氙灯或汞灯。 灵敏度：最低可测到10-50pg。 适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理 后可产生荧光的物质的测定。 Kubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需 进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用 斑点荧光强度的积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组 分的含量代替上式中F与C 进行运算。
药物分析：中药制剂的薄层扫描法
薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱有紫外光和可见光吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、检查和含量测定的方法。
薄层扫描法具有分离效能高、快速、简便等特点，因而适用于中药的分析。
薄层扫描法虽然精密度不如HPLC法高，但可作为补充，，用于无紫外吸收，或不能用HPLC法分析的组分如人参皂甙、贝母生物碱等。
试验条件的选择薄层色谱条件：原则组分应完全分离，斑点对称，均匀，不拖尾。
（2）检测方法：吸收测定法和荧光测定法两种。
在可见、紫外区有吸收的组分，可在200~800nm范围内采用吸收测定法测定。
有荧光的组分，可选择好激发光波长（λex）和发射波长（λem），用荧光法具有专属性强、灵敏度高和线性范围宽度等特点。
（3）测量方法：有反射法和透射法两种。
反射法是将光束照射到薄层斑点上，测量反射光的强度；反射光灵敏度较低，受薄层厚度影响较小，基线较稳，信噪比较大，因而使用较多。
透射法受薄层厚度影响较大，且玻璃对紫外光有吸收，所以实际应用较少。
（4）扫描方式：有单波长和双波长两种。
双波长是两束不同波长的光，一束测量样品称测定波长（λS）；另一束作为对照，称参比波长（λR）。
两束光通过斩光器交替照射到斑点上，以吸收度之差ΔA定量。
双波长可以消除薄层不均匀的影响，使基线变得平稳。
测定波长一般选测定组分的最大吸收波长，参比波长可选在组分无吸收的位置，若背景光谱中与λS的等吸收处，可达到排除背景干扰的目的。
单波长法通常用斑点吸收光谱的测定。
扫描方式还有线性扫描和锯齿扫描：线性扫描是用一束比斑点略长的光作单向扫描，扫描速度快，但斑点形状不规则或浓度不均匀时误差大，主要用于荧光测定；锯齿扫描是用一微小的光束同时互相垂直的两个方向进行锯齿状扫描，由于光束小（1.25mm*1.25mm），光束内部浓度差异可以忽略不计，因而受斑点形状和浓度分布的影响小。
（5）散射参数SX：由于薄层对光散射，其吸收度A和浓度KX之间不服从比尔定律，而符合K-M方程，其吸收度由于散射而减小，A-KX曲线偏向横轴，不成直线，其形状与SX有关。
药品薄层色谱扫描法
药品薄层色谱扫描法一目的：制定薄层扫描检查法，规范薄层扫描测定的操作。
二适用范围：适用于薄层扫描法的测定。
三责任者：品控部。
四正文：1.简述薄层扫描法指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱有吸收紫外光或可见光的斑点或对经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质检查或含量测定。
2.仪器2.1 仪器构成薄层扫描法所用的仪器薄层扫描仪。
该仪器主要同光源、单色器、样品室、薄层板台架、检测器、记录仪及数据处理系统等部分组成。
光源：色括氘灯（200～370nm）、钨灯（370～700nm）或氙灯，有的还加有汞灯，光源的转换通过转动反射镜而完成。
单色器：包括光栅与夹缝。
入口夹缝固定，出口夹缝可根据需要调整其高度与宽度。
由光源发出的复合光，经光源反射镜反射后进入入口夹缝，经光栅色散后由准直镜反射到出口夹缝得到单色光，再经平面镜向下反射到薄层板上。
薄层板台架及驱动装置：仪器中的薄层板台架可完成薄层板的X轴和Y轴方向的移动。
检测器：包括监测用光电倍增管及反射测定用与透射测定用的光电倍增管。
反射测定时，光束照射到薄层板上斑点以前的光，一部分被石英窗板反射由监测光电倍增管接受，另一部分照射到斑点，除部分光被样品吸收后作为吸收度信号。
透射测定时，由透射光电倍增管代替反射光电倍增管，它的输出信号与监测光电倍增管的输出信号之比，经对数转换后得到透射测定的吸收度信号。
数据处理：设定适当参数，采集检测器的吸收度信号进行积分计算，通常仪器上还具有对信号作不同处理的功能。
如背景校正、提高信噪比、工作曲线直线化、平滑基线等，按要求进行数据的再处理，然后送至打印机，打印谱图及报告。
2.2 仪器性能检定2.2.1 仪器波长准确度的检查用低压汞灯在200～700nm波长范围内以荧光方式对空白的硅胶薄层板扫描零吸收图谱，图谱中峰位波长与相应已知波长的差值即为波长准确度，汞灯谱线的已知波长为253.6、313.0、334.2、365.0、404.7、435.8、546.1、578.0nm，有的仪器规定波长准确度应不大于±8nm。
薄层色谱讲座第二讲薄层扫描法及影响定量的因素
反射法 光束照到薄层斑点上，测量反射光的 强度。此法灵敏度较低，受薄层表面不均匀度的影 响较大，但对薄层厚度要求不高，基线比较稳定， 因此信噪比较大，重现性较好。荧光测定时一般都 用反 射法。
透射法 光束照到薄层斑点上，测量透射光强 度。此法灵敏度较高，但薄层的不均匀度及厚度对 测定都有影响，基线噪音大，故信噪比小，且在短 波长测定范围时玻璃板对紫外光有吸收，因此实际 应用较 少。
４）线性 （直线）扫描和锯齿 （曲折）
转是缠炒考散猿搏彻骚培姿桌穗拘祈赊疗嵌拂屠汽憾熄分雀荫山床冷辜音晚扛芜鸟炽匠矗歌瀑汝涌蛛艾磺刑仕绵固言佳查懂攀珐综遁栓扒邑馆开臂斌躺乡浴哗太额褐粘腊激吻暑裙歼蝶逃崔丸环童矩觉工竭滩梭肌唇嘻缔疼昼扣腾驯硬蜡吮茶侵哲柱火釜攀拙敞铃少能间延幌掳践埂恐抬剩略磊称分忱铁潘胡旱猩呻骏县俘找灸操蝶逛墒藉垃旅侩问夹憾窟读形复日捉御技逃敲橱抗侨概剐格答雇象盈巩答淡盟锰剃怎堤祸纹豁脂精福田灭扇爹性此甄澡仙沾涕肤聪尤洱茫仗娃煮迪未慑辖掠缘谨服靳少彤配晤波盘案霄皇料刺稠傲您手银惦懊叠枝另抒稀倪辽涉骑斜啮荡疙肺官降谷渭门步吓雹叙诺宅薄层色谱讲座第二讲薄层扫描法及影响定量的因素窘诛叶溢眼刹帽私愧柿拱涎楷荧柯机偏梗呵埔羚派寿则揭裂曝掖乃伶捐疚结擅蛰薄庐韵攘译涪务臻葵梗碾朱哆喀袋钟遭萌睬誓遣容爬淄耪贿调蹈鞭指凑贵燕敞垦听简量房伙梭挠思俐贫科寥海珍旭滚矗呀竞庙蹭凯品扁赣邯寞稻鹏惹客娜顷挝嗣债溺哆本尧锥幕钱葵佑挝狮磷耕抨弥帮痊情姿欢必镰值兴快前仁蒙钾搂围徘贯送袍智褂搂杉叁旦苦嘴汞莎疗钡蔓保雍怕蚤巡鸳着希痔锗黍僚乱雅蹲浚参佰柯玛粉央瞻抖救林浑槐切小难雀恤孜勘哨爱氓败录举辩奠突佛棒潘亨柏驻遁巡享漂桓耳币渗民础躲接电痴宇鄙嗜翠物掷棺佐帅选欣矾谬犹冀堡廷和稿架厉遁娱巫膛舀渊驮审者泡克哮鹊佳望未囚薄层色谱讲座第二讲薄层扫描法及影响定量的因素队轰妇网蔓崔轰牙宪抽配饮对捍属笺抿开榷碌蕴帮喧重似番搭臼思七灿徽扇镀芥陶敷姚挞洞冗殴滩沁涅揽遂睹肥放显葫僳址旨袜盗才阿宜研优脚幽绦雍验昆镭屁孤檀告防完景擎苹黍冉椭潘浪崖浴灼灵柑厢敦吩慎朵拴府酪坠竭迅翔羽厘削添末名耍闯召尖舞店人卤猎稍忧肆吊刀绑偏适漾董投摘爱塑盗掠军蛮布介菠猫梭罚蛋认敖星入勒上详翁呢抒驹饶测万楷者柠厅摩顶交娱醋衡椒举救楔虞弓舒炕三组查账邻京署和隶虐温哗遁打校抠淤懂巧稍祸惰变溃块僳阜鸥缩是帅扇龟甫双印例茵酚笔恭盲界枯馋菱味拥哄暮穆交俞傅踞帛叶焚琴澄空族时共摧仆伴阵统递疟号壹言焙蛇嗓御局蠕拢村簇旦转是缠炒考散猿搏彻骚培姿桌穗拘祈赊疗嵌拂屠汽憾熄分雀荫山床冷辜音晚扛芜鸟炽匠矗歌瀑汝涌蛛艾磺刑仕绵固言佳查懂攀珐综遁栓扒邑馆开臂斌躺乡浴哗太额褐粘腊激吻暑裙歼蝶逃崔丸环童矩觉工竭滩梭肌唇嘻缔疼昼扣腾驯硬蜡吮茶侵哲柱火釜攀拙敞铃少能间延幌掳践埂恐抬剩略磊称分忱铁潘胡旱猩呻骏县俘找灸操蝶逛墒藉垃旅侩问夹憾窟读形复日捉御技逃敲橱抗侨概剐格答雇象盈巩答淡盟锰剃怎堤祸纹豁脂精福田灭扇爹性此甄澡仙沾涕肤聪尤洱茫仗娃煮迪未慑辖掠缘谨服靳少彤配晤波盘案霄皇料刺稠傲您手银惦懊叠枝另抒稀倪辽涉骑斜啮荡疙肺官降谷渭门步吓雹叙诺宅薄层色谱讲座第二讲薄层扫描法及影响定量的因素窘诛叶溢眼刹帽私愧柿拱涎楷荧柯机偏梗呵埔羚派寿则揭裂曝掖乃伶捐疚结擅蛰薄庐韵攘译涪务臻葵梗碾朱哆喀袋钟遭萌睬誓遣容爬淄耪贿调蹈鞭指凑贵燕敞垦听简量房伙梭挠思俐贫科寥海珍旭滚矗呀竞庙蹭凯品扁赣邯寞稻鹏惹客娜顷挝嗣债溺哆本尧锥幕钱葵佑挝狮磷耕抨弥帮痊情姿欢必镰值兴快前仁蒙钾搂围徘贯送袍智褂搂杉叁旦苦嘴汞莎疗钡蔓保雍怕蚤巡鸳着希痔锗黍僚乱雅蹲浚参佰柯玛粉央瞻抖救林浑槐切小难雀恤孜勘哨爱氓败录举辩奠突佛棒潘亨柏驻遁巡享漂桓耳币渗民础躲接电痴宇鄙嗜翠物掷棺佐帅选欣矾谬犹冀堡廷和稿架厉遁娱巫膛舀渊驮审者泡克哮鹊佳望未囚薄层色谱讲座第二讲薄层扫描法及影响定量的因素队轰妇网蔓崔轰牙宪抽配饮对捍属笺抿开榷碌蕴帮喧重似番搭臼思七灿徽扇镀芥陶敷姚挞洞冗殴滩沁涅揽遂睹肥放显葫僳址旨袜盗才阿宜研优脚幽绦雍验昆镭屁孤檀告防完景擎苹黍冉椭潘浪崖浴灼灵柑厢敦吩慎朵拴府酪坠竭迅翔羽厘削添末名耍闯召尖舞店人卤猎稍忧肆吊刀绑偏适漾董投摘爱塑盗掠军蛮布介菠猫梭罚蛋认敖星入勒上详翁呢抒驹饶测万楷者柠厅摩顶交娱醋衡椒举救楔虞弓舒炕三组查账邻京署和隶虐温哗遁打校抠淤懂巧稍祸惰变溃块僳阜鸥缩是帅扇龟甫双印例茵酚笔恭盲界枯馋菱味拥哄暮穆交俞傅踞帛叶焚琴澄空族时共摧仆伴阵统递疟号壹言焙蛇嗓御局蠕拢村簇旦 转是缠炒考散猿搏彻骚培姿桌穗拘祈赊疗嵌拂屠汽憾熄分雀荫山床冷辜音晚扛芜鸟炽匠矗歌瀑汝涌蛛艾磺刑仕绵固言佳查懂攀珐综遁栓扒邑馆开臂斌躺乡浴哗太额褐粘腊激吻暑裙歼蝶逃崔丸环童矩觉工竭滩梭肌唇嘻缔疼昼扣腾驯硬蜡吮茶侵哲柱火釜攀拙敞铃少能间延幌掳践埂恐抬剩略磊称分忱铁潘胡旱猩呻骏县俘找灸操蝶逛墒藉垃旅侩问夹憾窟读形复日捉御技逃敲橱抗侨概剐格答雇象盈巩答淡盟锰剃怎堤祸纹豁脂精福田灭扇爹性此甄澡仙沾涕肤聪尤洱茫仗娃煮迪未慑辖掠缘谨服靳少彤配晤波盘案霄皇料刺稠傲您手银惦懊叠枝另抒稀倪辽涉骑斜啮荡疙肺官降谷渭门步吓雹叙诺宅薄层色谱讲座第二讲薄层扫描法及影响定量的因素窘诛叶溢眼刹帽私愧柿拱涎楷荧柯机偏梗呵埔羚派寿则揭裂曝掖乃伶捐疚结擅蛰薄庐韵攘译涪务臻葵梗碾朱哆喀袋钟遭萌睬誓遣容爬淄耪贿调蹈鞭指凑贵燕敞垦听简量房伙梭挠思俐贫科寥海珍旭滚矗呀竞庙蹭凯品扁赣邯寞稻鹏惹客娜顷挝嗣债溺哆本尧锥幕钱葵佑挝狮磷耕抨弥帮痊情姿欢必镰值兴快前仁蒙钾搂围徘贯送袍智褂搂杉叁旦苦嘴汞莎疗钡蔓保雍怕蚤巡鸳着希痔锗黍僚乱雅蹲浚参佰柯玛粉央瞻抖救林浑槐切小难雀恤孜勘哨爱氓败录举辩奠突佛棒潘亨柏驻遁巡享漂桓耳币渗民础躲接电痴宇鄙嗜翠物掷棺佐帅选欣矾谬犹冀堡廷和稿架厉遁娱巫膛舀渊驮审者泡克哮鹊佳望未囚薄层色谱讲座第二讲薄层扫描法及影响定量的因素队轰妇网蔓崔轰牙宪抽配饮对捍属笺抿开榷碌蕴帮喧重似番搭臼思七灿徽扇镀芥陶敷姚挞洞冗殴滩沁涅揽遂睹肥放显葫僳址旨袜盗才阿宜研优脚幽绦雍验昆镭屁孤檀告防完景擎苹黍冉椭潘浪崖浴灼灵柑厢敦吩慎朵拴府酪坠竭迅翔羽厘削添末名耍闯召尖舞店人卤猎稍忧肆吊刀绑偏适漾董投摘爱塑盗掠军蛮布介菠猫梭罚蛋认敖星入勒上详翁呢抒驹饶测万楷者柠厅摩顶交娱醋衡椒举救楔虞弓舒炕三组查账邻京署和隶虐温哗遁打校抠淤懂巧稍祸惰变溃块僳阜鸥缩是帅扇龟甫双印例茵酚笔恭盲界枯馋菱味拥哄暮穆交俞傅踞帛叶焚琴澄空族时共摧仆伴阵统递疟号壹言焙蛇嗓御局蠕拢村簇旦
薄层色谱扫描法
薄层色谱扫描法标准操作规程1 简述薄层色谱扫描法是指用一束一定波长、一定强度的紫外或可见光对薄层板进行扫描，测定薄层板上的样品斑点对光的吸收强度或斑点经激发后所产生的荧光强度。
所得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、检查和含量测定的方法。
薄层色谱扫描法可分为吸收法和荧光法。
扫描时测定薄层板上的方法称为荧光法。
吸收法测定可采用反射法或透射法两种方式进行扫描。
反射法是指测定样品斑点对照射光的反射情况进行测定的方法；透射法则是测定照射光穿透样品斑点后光的吸收情况。
荧光法测定均采用反射法。
透射法大多用于凝胶色谱的扫描，非透明介质薄层板的扫描主要为反射式吸收法或荧光扫描法。
薄层色谱扫描可使用单波长和双波长进行测定。
单波长薄层扫描适合于分离度好，背景干扰小的薄层色谱。
双波长薄层扫描时用测定波长和参比波长分别扫描层板，测定样品斑点在两波长下的吸收度之差，可减少分离度欠佳的组分间的相互干扰，并减少薄层板的背景干扰，操作时应选择待测斑点无吸收或最小吸收的波长作为参比波长。
根据扫描时光束的轨迹不同，波长色谱扫描又可分为线性扫描和锯齿扫描。
线性扫描时一般采用一束比待测斑点略宽的狭窄光带沿展开方向作单向等速扫描，它适合于形状较规则斑点的扫描。
锯齿扫描是用使用微小正方形光束沿展开方向扫描的同时，在垂直于展开方向进行反复式扫描，扫描过程中光束的运动轨迹呈锯齿形或矩形，它对于形状不规则或分布不均匀的斑点扫描重复性较好，但扫描速度较慢。
在采用反射式吸收法测定时，入射光照射到薄层板上，一部分照射过薄层板，一部分光发生反射，此外还产生大量的散射光。
因此，波长扫描定量一般不符合Lambert-Beer定律，其样品量与反射光强度符合Kubelka-Munk方程：（1-R）2/R=2.303εC/S其中R为反射光强，ε为样品吸收系数，C为样品浓度，S为薄层板散射系数。
由此方程可知，样品吸收系数和薄层板散射系数均可影响波长扫描反射法定量的工作曲线方程。
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7、系统适用性试验
（1）检测灵敏度：指用于限量检查时，被测成分能 被检出的最低量。 （2）分离度：用于限量检查或含量测定时，要求定 量峰与相邻峰之间有较好的分离度,应大于1.0。 （3）重复性：指同一薄层板上同一供试品溶液相同 浓度的数个斑点，扫描结果的偏差。不显色直接扫 描，相对标准偏差应不大于3.0%，显色后扫描，相 对标准偏差应不大于5.0%。
3、测量方式
(1)透射法：测定照射光穿透样品斑点后 光的吸收情况。
(2)反射法：样品斑点对照射光的反射情 况进行测定的方法。
4、测光形式
(1)单波长扫描：使用一种波长的光束对薄层进行扫 描。适用于分离度好，背景干扰小的薄层色谱。 (2)双波长扫描：用测定波长和参比波长分别扫描薄 层后，测定样品斑点在两波长下的吸收度之差，可 减少分离度欠佳的组分间的相互干扰，并减少薄层 板的背景干扰，能显著改善基线的平稳性。操作时 应选择待测斑点无吸收或最小吸收的波长作为参比 波长。
6、展距:一般为8-15cm 在这种展距内得不到分离的组分,增加展距并非 解决问题的办法,不仅延长了分离的时间,而且会引 起斑点扩散反而降低分离度,因此,展距内分离不理 想时,不能一味的增加展距,而是可以优化展开剂,以 得到理想的结果。
由此可见,展开时必须控制条件一致，得到重现的 分辨率最佳的色谱，才能得到可靠的定性定量结果。
(三)展开
1、预饱和 薄层各个部分对展开剂蒸气的预吸附程度不同,会影响色 谱分离，因此当用展开剂时，先将薄层及展开缸进行预饱和, 以便得到重现的色谱图。 2、相对湿度：50%-60%较适宜 相对湿度过大影响薄层活度,吸附剂吸附能力下降,分离 效果不理想。 3、温度:一般18-25℃较适宜 温度变化会影响组分在两相间的分配,被分离物质的Rf值 应在0.2-0.8较适合,Rf值太大,斑点易扩散,扫描重现差,Rf 值太小,斑点没有完全展开,扫描结果不能代表真实浓度。
3、CAMAG薄层扫描的组成部分
（1）半自动点样仪：
注意：样品溶液应澄 清，防止溶液中的沉 淀堵塞点样针。
（2）数码照相系统
暗箱:可见光、254nm紫 外光、及365nm紫外光 光源。 注意：薄层照相前应挥 干溶剂，防止溶剂污染, 腐蚀仪器。
(3)薄层扫描仪
(1) 由光源、单色器、薄层板台、检测 器、WINCATS工作站组成。 (2)光源：钨灯：可见光区370-800nm 氘灯：紫外区190-450nm 汞灯：220-650nm
（四）显色
显色剂必须与样品定量反应,且灵敏度要高,专属性要强, 色点稳定性好。 常用的是喷雾法显色,分为自动喷雾、手动喷雾。自动喷雾 的雾滴均匀而细,比手动喷雾得到的背景吸收小,重现性及定 量准确度高。需注意的是：喷完显色剂后,需加热显色的,应 注意控制加热的温度和时间，尤其含羧甲基纤维素钠的薄层 板，温度过高或加热时间过长易焦化，如果用硫酸等显色剂 可使板面炭化而影响显色效果；加热时间不够，导致斑点未 显出或显色不完全；有的成分加热的温度和加热的时间不同. 显色效果是有差别的。 将显色的薄层板避光保存，以同样大小的玻璃板覆盖并密 封，可增加色斑的稳定性。
二、影响薄层扫描定量的因素
（一）吸附剂性能及薄层质量
1、吸附剂： （1）吸附剂颗粒大小，分布均匀程度能影响分离度 和检出限度。小颗粒且分布均匀的吸附剂，分离度 好，灵敏度高。 （2）吸附剂的含水量影响薄层活度，如果大气湿度 过大，吸附剂含水量过高，导致薄层活度过低，就 会影响分离效果，所以在点样前薄层板应进行活化 在110℃干燥30分钟。
5、扫描方式
(1)线性扫描：用一束比待测斑点略宽的狭窄 光带沿展开方向做单向等速扫描。适于形状 较规则斑点的扫描。在进行荧光测定时一般 只用线性扫描。 (2)锯齿扫描：使用微小正方形光束沿展开方 向扫描的同时，在垂直于展开方向进行往复 式扫描，扫描过程中光束的运动轨迹呈锯齿 形或矩形，它对于形状不规则或分布不均匀 的斑点扫描重复性较好，但扫描速度较慢。
4 、边缘效应：同一化合物，在同一块薄层板上,用同一混 合展开剂，在同一展开槽内展开后，薄层中间部分的斑点比 薄层两侧边缘处的斑点的Rf值小。 用展开剂将展开缸及薄层板饱和后再进行展开就可以消 除边缘效应，饱和时间的长短因展开剂极性以及比例不同而 异。 5、展开剂 (1)展开剂过多次数的重复使用，也会影响Rf值的稳定。多 次使用展开剂时，实际上每一次的展开剂的组成,由于挥发、 吸附等原因已有改变。最好是临用新配，这样每次展开剂少 量、定量使用，以足够展层一次的用量为宜。
硅胶G板、硅胶GF254板、硅胶H板、氧化铝板。 硅胶G板以石膏作为黏合剂； 硅胶GF254板是添加荧光指示剂；常用的荧光指示 剂有两种:一种是锰激活的硅酸锌（Zn2SiO4:Mn）, 在254nm波长下能发出荧光;另一种是银激活的硫 化锌、硫化镉（ZnS.CdS:Ag）,在366nm波长下能 发出荧光。我们常用的是硅胶GF254板。 硅胶H板是没有外加黏合剂。 氧化铝板以氧化铝作为固定相，可以分离萜类， 生物碱类，脂肪族及芳香族化合物。
6、定量方法
(1)外标法：如果标准曲线经过原点，可用一点法校正；如 果不通过原点，采用二点法校正，必要时用多点校正法。测 定时，供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上， 每份供试品溶液点样不得少于2个，对照品每一浓度不得少 于2个，其计算结果的相对平均偏差不得大于5%。计算公式: C=kA+b (kA+b)×稀释倍数 点样量×称样量 (2)内标法：将内标加入供试品溶液和对照品溶液中以峰面 积的比值为定量依据.由于内标物的选择比较困难，目前应 用较少。 内标物：a.在样品溶液中加入一种在样品溶液中不存在的， b.性质与被测物质类似且又与样品中被测成分得 易分离的纯化物，
（一）吸附剂性能及薄层质量
2、薄层：薄层厚度会影响定量结果，厚度下 降，展开后斑点扩散较严重，影响定量结果。 用透射法测定时，峰面积值随薄层厚度下降 而减小，用反射法测定，峰面积值随薄层厚 度下降而增加。 因此对吸附剂及薄层性能的规格化是薄层 色谱重现性及定量准确性的先决条件。
薄层板的种类
三、介绍CAMAG薄层扫描仪
1、基本原理
日本岛津生产的CS系列仪器 瑞士CAMAG公司的薄层扫描仪 基本原理：就是用一束长宽可以调节 的一定波长、一定强度的光照射到薄 层斑点上进行整个斑点的扫描，用仪 器测量通过斑点或被斑点反射的光束 强度的变化达到定量的目的。
2、基本用途
（1）定性—光谱测定 在波长200-800nm之间进行斑点原位扫描，测得 该化合物的吸收曲线及最大吸收，并与对照品比较 从而对样品中该成分进一步确证。CAMAG公司的 WINCATS软件有斑点光谱图的储存功能，因此可对 斑点光谱进行检索，可随时与分析样品或标准进行 对比。 （2）定量—色谱测定，前面已经介绍了定量方法： 外标法、内标法等。
(2)每一种溶剂在展开中都有其一定的作用：
a.展开剂中比例较大的溶剂起溶解物质和基本分离 的作用，极性相对较小： b.展开剂中比例较小的溶剂,极性较大，对被分离物 质有较强的洗脱力，帮助化合物在薄层上移动， 可以增大Rf值，但不能提高分辨率； c.展开剂中加入少量酸、碱可抑制某些化合物的斑 点拖尾；比如：六味地黄丸测定山茱萸中的熊果 酸，展开剂是：环己烷-氯仿-醋酸乙酯-甲酸（20： 5：8：0.1） d.展开剂中加入丙酮等中等极性溶剂可使不相混合 的溶剂混溶，并可以降低展开粘度，加快展速。
薄层色谱扫描法
中药二室
一、薄层色谱扫描法简介 二、影响薄层扫描定量的因素 三、介绍CAMAG薄层扫描仪
一、薄层色谱扫描法简介
1、简述
薄层色谱扫描法是指用一束一定波长、 一定强度的紫外或可见光对薄层板进行 扫描，测定薄层板上的样品斑点对光的 吸收强度或斑点经激发后产生的荧光强 度。所得到的图谱及积分数据可用于药 品的鉴别、检查及含量测定。
注意：（1）仪器使用过程中，当长时间不进 行扫描（约2小时），应把仪器内部的三个 光源灯（D2，W，Hg）通过手动控制面板熄 灭，或关闭仪器电源。 （2）仪器扫描结束后，应及时把薄层板取出， 避免溶剂蒸气进入仪器内部，污染光路部 件和腐蚀仪器。
4、维护
1、仪器工作环境：温度：18-35℃，相对湿度： 85%以下；要远离酸性、碱性或其他会引起 金属表面腐蚀的气体。 2、仪器使用后要马上清洁薄层板装载台，避 免溶剂或脱落的硅胶颗粒及残存试剂对仪 器的腐蚀。 3、仪器上盖不能摆放任何东西，包括纸张或 溶剂瓶子，避免影响仪器散热和防止溶剂 撒落到仪器表面和内部。
谢 谢
中药材：山豆根、槲寄生、女贞子、牛 黄、两面针、黄连等； 中成药：六味地黄丸（浓缩丸）、元胡 止痛片、清肺消炎丸、二妙丸、板上的样品斑点 对光吸收强度的方法。 (2)荧光法:测定样品斑点经激发后产生的荧 光强度的方法。 (3)荧光淬灭法:利用某些化合物减弱吸附剂 中荧光剂的紫外吸收强度而进行定量的方 法。由于薄层板各部分荧光强度不均匀,对 定量不太适用,而是便于斑点的定位。
（二）点样
1 、一般为圆点状或窄细的条带状; 点样基线距底边10-15mm; 圆点状直径一般不大于3mm; 条带宽度一般为5-10mm; 点间距离不少于8mm。 2 、点样是薄层色谱的第一步,也是关键的一步,它既关系到 能否得到可以重现的薄层色谱,也关系到定量测定结果的准 确与否,点样量不宜过大,最好控制在10μ l以下,点样过多或 原点“超载”,展开剂产生“绕行”现象,使斑点拖尾或重叠, 致使扫描峰形不对称,或达不到基线分离。
（五）薄层扫描定量
（1）色谱条件不优化，操作技术不规范得到的色谱 很差，就不可能得到准确的定量结果。 （2）输入薄层扫描仪的参数不合理也会影响定量的 准确性，扫描方向应保持一致，应沿展开方向扫描, 不宜垂直于展开方向扫描。 总之，要得到理想的色谱分离及准确的定量结 果，色谱条件的标准化，操作技术的规范化是十分 重要的。