双波长薄层色谱扫描法测定甲基红含量(精)
薄层扫描法(TLCS)
1.1 Kubelka—Munk理论
Kubelka—Munk理论说明了固定相的散射参数对斑点中物质的 浓度与吸光度间关系的影响。该理论的基本方程式如下。 （1）薄层色谱斑点的透射率：
上式是Kubelka—Munk理论描述薄层色谱斑点透光率的最基本公 式。式中Sx是薄层板的散射参数，它与固定相的种类、粒度、薄 层厚度及涂布均匀程度有关。其数值大小直接影响薄层色谱斑点 的吸光度—浓度曲线偏离Beer定律的情况。只有已知薄层板准确 的SX值，才能正确地运用曲线校直法进行薄层扫描定量分析。薄 层色谱斑点中物质的含量包含于a及b两个参数中。
不规则斑点，用直线式扫描定量，即使光带长度适宜，定量误差仍然 较大，因为所得峰面积还与扫描方向有关。
综上所述，直线式扫描较适用于规则圆形薄层色谱斑点及条状薄层 色谱斑点的定量分析。所能测定斑点的大小，以仪器的光带长度为上限。 例CS—930薄层扫描仪，出射狭缝最大长度(高度)为6mm，只能测定小 于6mm的斑点。 在作直线式扫描叫，光带的步进距离ΔY也影响蜂面 积。斑点小应选小步进距离，选择适宜，能降低定量误差。有关TLC及 HPTLC板的光带长度及步进距离的具体选择见表。
反射式
2.1 扫描方式选择
(1) 直线扫描 直线式扫描是用一光带先照射在薄层板的一端，而后作直线 运动至另—端。在作直线式扫描时，实际上是光带固定，薄层板相 对于光带作直线运动。
在作直线扫描时，光带的长度对扫描后所得的色诺峰峰面积 影响很大，下图说明了光带越长，所得的色谱蜂面积越小，反之 则峰面积越大。光带太长，检测灵敏度低，光带太短，光带只通 过斑点的一部分，所得的蜂面积，不能真实反砍斑点的吸收情况。 因此，正常扫描时，应使光带长度略大于斑点直径。在多斑点扫 描的，光带长度略大于最大斑点直径。为了降低定量误差，应使 标准品斑点的直径与检品斑点的直径尽量接近。样品斑点为带状 时，光带长度应约为样带的2/3。
薄层色谱法详解
薄层板的活化：硅胶板于105-110℃烘30分钟，氧化铝板于150-160℃烘4小时，可得活性的薄层板。
点样
点样
点样方式：分为手动点样和自动点样。手动点样主要器具为微量毛细管、微量注射器等。自动点样采用半自动点样仪或全自动点样仪，按预设程序自动点样。手动点样灵活方便，常用于各种TCL鉴别中，器具以微量毛细管最常用。仪器的自动点样准确性好，常用于薄层扫描法的含量测定。
影响展开的因素
制备离心色谱仪
A相对湿度的影响
B溶剂蒸汽的影响(a展开室的饱和b预吸附)
C温度的影响
D展距的影响与分离度仅正比与展距的平方根
显色
A光学检出法
a自然光(400~800nm)
b紫外光(254nm或365nm)
c荧光一些化合物吸收了较短波长的光，在瞬间发射出比照射光波长更长的光，而在纸或薄层上显出不同颜色的荧光斑点(灵敏度高、专属性高)
B蒸汽显色法
显色
多数有机化合物吸附碘蒸气后显示不同程度的黄褐色斑点，这种反应有可逆及不可逆两种情况，前者在离开碘蒸气后，黄褐色斑点逐渐消退，并且不会改变化合物的性质，且灵敏度也很高，故是定位时常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸气氧化、脱氢增强了共轭体系，因此在紫外光下可以发出强烈而稳定的荧光，对定性及定量都非常有利，但是制备薄层时要注意被分离的化合物是否改变了原来的性质。
显色方法a喷雾显色：显色剂溶液以气溶胶的形式均匀的喷洒在纸和薄层。b浸渍显色：挥去展开剂的薄层板，垂直的插入盛有展开剂的浸渍槽中，设定浸板及抽出速度和规定在显色剂中浸渍的时间。
薄层色谱法测定标准操作规程
薄层色谱法测定标准操作规程目的：建立薄层色谱法测定标准操作规程。
（《中华人民共和国药典》2010版附录）范围：适用于薄层色谱法的测定。
职责：检验员，QC主管。
内容：1 简述：薄层色谱法，是将适宜的固定相涂布于玻璃板上，成一均匀薄层。
等点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别，杂质检查或含量测定的方法。
2 仪器与材料：2.1 薄层板：2.1.1市售薄层板市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板，按固定相种类又可分为硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、微晶纤维素、硅藻土、氧化铝、聚酰胺薄膜等薄层板。
2.1.2 自制薄层板在保证色谱质量的前提下，如需对薄层板进行特别处理和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制的薄层板，自制薄层板系指手工（或借助涂布器）将固定相涂布于玻璃板或其他适宜载板上使成为有一定厚度的均匀薄层。
常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、微晶纤维素等，其粒径一般为10~40um。
2.2 点样器：采用手动、半自动或全自动点样器材，手动点样时一般采用微量毛细管。
2.3 展开容器：应使用适合薄层板大小的平底或双槽薄层色谱专用展开缸，并配有严密的盖子。
水平展时使用专用水平展开缸。
2.4 显色与显色装置按各品种项下规定。
可采用喷雾显色、浸渍显色或蒸气熏蒸显色，喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸渍显色可用玻璃容器或适宜的展开缸代替；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。
2.5 检视装置为装有可见光或紫外光（254nm及365nm）光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄色谱图用，暗箱内光源应有足够的光照度。
3 操作方法：3.1 薄层板制备：3.1.1 市售薄层板临用前一般应在110℃活化30min，聚酰胺薄膜不需活化。
铝基片薄层板或聚酰胺薄膜均可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的涂层不得有破损，如在储放期间被空气中杂质污染，使用前可用甲醇、二氯甲烷与甲醇的混合溶剂在展开容器中上行展开预洗，取出，晾干，活化后使用。
双波长薄层色谱扫描法测定蒲公英总黄酮含量(精)
【摘要】目的：建立蒲公英中总黄酮的含量测定方法。
方法：应用双波长薄层色谱扫描法，以芦丁为对照品，测定波长λs=278nm，参比波长λR=356nm，测定蒲公英中总黄酮的含量。
结果：回归方程为Y=873851X+80.593，r=0.999，RSD=2.6％，蒲公英总黄酮含量为4.236%。
结论：用该方法测定蒲公英中总黄酮的含量，操作简便，结果可靠，重复性好。
【关键词】双波长薄层色谱扫描法总黄酮芦丁蒲公英属菊科类为植物蒲公英，是常用的中药类抗菌、抗真菌的药物，具有清热解毒、利胆保肝、医治乳痈疔疮等药理作用。
主要成分含有蒲公英甾醇、绿原酸、总黄酮等成份，现已制成注射剂、片剂、糖浆等不同剂型，广泛应用于人与畜各科多种感染性炎症，均有良好疗效。
这种中草药价廉物美，药源丰富，应当进一步开发，做到物尽其用。
针对其总黄酮的含量，我们采用双波长薄层色谱扫描法对其进行测定，现报道如下。
1 仪器与试剂1.1 仪器CS930型双波长飞点式薄层扫描仪（日本岛津）；高硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂生产）；旋转蒸发仪RE52A型（上海亚荣生化仪器厂）；5ul微量进样器（上海医用激光仪器厂）。
1.2 试剂芦丁对照品（中国药品生物制品检定所）；蒲公英（产地为内蒙，由内蒙古成大方圆有限公司饮片分装）；其它试剂均为分析纯。
2 薄层分析与鉴定2.1 对照品溶液的配置［1］精密称取芦丁对照品25mg，置50ml容量瓶中，以85%乙醇溶解并加至刻度，精密吸取10ml置20ml容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，备用。
2.2 供试品溶液的制备精密称取内蒙蒲公英（提前粉碎研磨成细粉）10g，用13倍量药材的85%乙醇加热回流2次，每次1小时［2］，回收蒸发乙醇至干（旋转蒸发仪），残渣加入50ml热水溶解，先用石油醚（50，50，30ml）萃取3次，要下层液（除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素），再用正丁醇（50，50，30ml）萃取3次，要上层液（除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质），合并正丁醇提取液用85%乙醇30ml溶解，过滤至50ml容量瓶中，再用85%乙醇洗涤滤纸至刻度，摇匀。
双波长测定实验报告
一、实验目的1. 掌握双波长分光光度法的原理和应用；2. 学习使用紫外-可见分光光度计进行定量分析；3. 通过实验测定待测物质的含量。
二、实验原理双波长分光光度法是一种基于物质在特定波长处吸光度与浓度成正比关系的定量分析方法。
该方法通过选择两个特定波长，分别测定待测物质在这两个波长下的吸光度，从而消除共存物质对测定结果的干扰。
实验原理如下：A1 = ε1c1λ1A2 = ε2c2λ2式中，A1、A2分别为待测物质在波长λ1、λ2处的吸光度；ε1、ε2分别为待测物质在波长λ1、λ2处的摩尔吸光系数；c1、c2分别为待测物质在波长λ1、λ2处的浓度。
通过联立上述两个方程，可以消去ε1、ε2，得到待测物质的浓度：c = (A1λ2 - A2λ1) / (λ1λ2)三、实验仪器与试剂1. 仪器：紫外-可见分光光度计、移液管、容量瓶、锥形瓶、比色皿、洗耳球等；2. 试剂：待测物质标准溶液、参比溶液、溶剂等。
四、实验步骤1. 准备标准溶液：准确移取一定体积的待测物质标准溶液，加入适量的溶剂，定容至一定体积，配制成一系列浓度梯度的标准溶液；2. 配制参比溶液：准确移取一定体积的参比溶液，加入适量的溶剂，定容至一定体积；3. 测定吸光度：在紫外-可见分光光度计上，选择两个特定波长，分别测定标准溶液和参比溶液的吸光度；4. 数据处理：根据实验数据，绘制吸光度-浓度曲线，通过线性回归得到线性方程，代入待测样品的吸光度，计算待测样品的浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：以标准溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸光度-浓度曲线；2. 线性回归：对吸光度-浓度曲线进行线性回归，得到线性方程；3. 待测样品浓度计算：代入待测样品的吸光度，根据线性方程计算待测样品的浓度。
六、实验讨论1. 实验误差分析：实验误差主要来源于仪器误差、操作误差和试剂误差。
在实验过程中，应尽量减小误差，提高实验结果的准确性；2. 双波长选择：在双波长分光光度法中，选择合适的波长对消除共存物质干扰至关重要。
药品薄层色谱扫描法
药品薄层色谱扫描法一目的：制定薄层扫描检查法，规范薄层扫描测定的操作。
二适用范围：适用于薄层扫描法的测定。
三责任者：品控部。
四正文：1.简述薄层扫描法指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱有吸收紫外光或可见光的斑点或对经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质检查或含量测定。
2.仪器2.1 仪器构成薄层扫描法所用的仪器薄层扫描仪。
该仪器主要同光源、单色器、样品室、薄层板台架、检测器、记录仪及数据处理系统等部分组成。
光源：色括氘灯（200～370nm）、钨灯（370～700nm）或氙灯，有的还加有汞灯，光源的转换通过转动反射镜而完成。
单色器：包括光栅与夹缝。
入口夹缝固定，出口夹缝可根据需要调整其高度与宽度。
由光源发出的复合光，经光源反射镜反射后进入入口夹缝，经光栅色散后由准直镜反射到出口夹缝得到单色光，再经平面镜向下反射到薄层板上。
薄层板台架及驱动装置：仪器中的薄层板台架可完成薄层板的X轴和Y轴方向的移动。
检测器：包括监测用光电倍增管及反射测定用与透射测定用的光电倍增管。
反射测定时，光束照射到薄层板上斑点以前的光，一部分被石英窗板反射由监测光电倍增管接受，另一部分照射到斑点，除部分光被样品吸收后作为吸收度信号。
透射测定时，由透射光电倍增管代替反射光电倍增管，它的输出信号与监测光电倍增管的输出信号之比，经对数转换后得到透射测定的吸收度信号。
数据处理：设定适当参数，采集检测器的吸收度信号进行积分计算，通常仪器上还具有对信号作不同处理的功能。
如背景校正、提高信噪比、工作曲线直线化、平滑基线等，按要求进行数据的再处理，然后送至打印机，打印谱图及报告。
2.2 仪器性能检定2.2.1 仪器波长准确度的检查用低压汞灯在200～700nm波长范围内以荧光方式对空白的硅胶薄层板扫描零吸收图谱，图谱中峰位波长与相应已知波长的差值即为波长准确度，汞灯谱线的已知波长为253.6、313.0、334.2、365.0、404.7、435.8、546.1、578.0nm，有的仪器规定波长准确度应不大于±8nm。
薄层扫描法(TLCS)
理想的空白薄层板(简称空白板)的单位薄层厚度的吸光系数K＝0。 事实上，一般空白板K≠0。为了消除此影响，通常在薄层扫描中都是 以空白板为基准，测定相对透光率及相对反射率来计算薄层色谱斑点的 吸光度。 (a)在透射法中薄层色谱斑点的吸光度：
上式中i及i0分别为透过斑点及空白板的透射光光强，I0为照射光光强。 T与T0分别为斑点及空白板的透射率。
薄层扫描法
一、.双波长薄层色谱扫描仪 1 光学系统
主要包括光源(氘灯与钨订)、单色器(入口狭缝．出口狭缝、光栅等)．以 及检测器(监测光电倍增管、反射和透射测定光电倍增管)组成。
2 主要功能
(1)可进行物质的紫外-可见原位吸收光谱测绘 紫外-可见吸收光谱既可作为物质定但的参考，又可提供待测物质的最 大吸收波长，以便进行色谱测定。 仪器在记录吸收光谱时，可提供两种方式。一种为标准方式(NORMAL)， 这种方式记录光谱进行波长扫描时，所测得光谱数据，一方面存入文件中， 同时也输出到记录器上。另一种方式为差示方式(DIFFERENCE)．它可将 测得光谱数据减去文件中存贮的光谱数据，并将其差值只输入到记录器中， 而不存贮在文件里。 要想得到校正过基线的正确光谱，应这样进行：先以标准方式，在巳展 开过的荡层板上无斑点的空白位置上，进行一次波长扫描，将基线光谱(它 反映空白板对各种技长光的吸收情况)存入文件中(亦可输出到记录器去)。 然后再用差示方式对待测斑点进扣波长扫描，就能得到扣除薄层空白板吸 收的待测物质的正确光谱图。 (2) 多通道自动扫描 仪器提供的程序方式(PROGRAM)，可完成冬通道 的自动扫描。程序方式中有七种参数供使用。它们包括波长1和波长2，用 来分别设定测量波长和参比波长，可以进行双波长扫描。
(2)锯齿式扫描 用截面积为正方形的光束照射薄层板，光束的运动轨迹为矩齿形。
薄层色谱扫描法
7、系统适用性试验
（1）检测灵敏度：指用于限量检查时，被测成分能 被检出的最低量。 （2）分离度：用于限量检查或含量测定时，要求定 量峰与相邻峰之间有较好的分离度,应大于1.0。 （3）重复性：指同一薄层板上同一供试品溶液相同 浓度的数个斑点，扫描结果的偏差。不显色直接扫 描，相对标准偏差应不大于3.0%，显色后扫描，相 对标准偏差应不大于5.0%。
3、测量方式
(1)透射法：测定照射光穿透样品斑点后 光的吸收情况。
(2)反射法：样品斑点对照射光的反射情 况进行测定的方法。
4、测光形式
(1)单波长扫描：使用一种波长的光束对薄层进行扫 描。适用于分离度好，背景干扰小的薄层色谱。 (2)双波长扫描：用测定波长和参比波长分别扫描薄 层后，测定样品斑点在两波长下的吸收度之差，可 减少分离度欠佳的组分间的相互干扰，并减少薄层 板的背景干扰，能显著改善基线的平稳性。操作时 应选择待测斑点无吸收或最小吸收的波长作为参比 波长。
6、展距:一般为8-15cm 在这种展距内得不到分离的组分,增加展距并非 解决问题的办法,不仅延长了分离的时间,而且会引 起斑点扩散反而降低分离度,因此,展距内分离不理 想时,不能一味的增加展距,而是可以优化展开剂,以 得到理想的结果。
由此可见,展开时必须控制条件一致，得到重现的 分辨率最佳的色谱，才能得到可靠的定性定量结果。
(三)展开
1、预饱和 薄层各个部分对展开剂蒸气的预吸附程度不同,会影响色 谱分离，因此当用展开剂时，先将薄层及展开缸进行预饱和, 以便得到重现的色谱图。 2、相对湿度：50%-60%较适宜 相对湿度过大影响薄层活度,吸附剂吸附能力下降,分离 效果不理想。 3、温度:一般18-25℃较适宜 温度变化会影响组分在两相间的分配,被分离物质的Rf值 应在0.2-0.8较适合,Rf值太大,斑点易扩散,扫描重现差,Rf 值太小,斑点没有完全展开,扫描结果不能代表真实浓度。
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四、实验步骤
（1）点样：取一块硅胶板（10 × 20 cm），用定量毛细管
吸取甲基红、甲基橙、甲基黄及试样各 1 µ L，分别点在
硅胶板上，点样间距为 1 ~ 1.5 cm。 （2）展开：将点好的薄层板放置在密闭的展开槽中，用展 开剂进行展开（一般需 30 min左右），斑点间隔 2 cm左 右即可。然后取出薄层板将展开剂挥发至干。
三、仪器与试剂
• 仪器：
• 岛津 CS-930 型薄层色谱扫描仪具有多功能、自动化程度较 高的特点，它包括主机及 DR-2 数据处理机两部分。CS-930 型薄层色谱扫描仪与常见光密度法仪器不同之处在于它具有 双波长、锯齿扫描、校正曲线线性化器和背景校正的功能。 • （1）双波长法：试样斑点最大吸收波长定为样品波长λ1 ， 试样斑点不吸收的波长定为参考波长λ2 。选用双波长法可以 提高灵敏度、平滑基线和增强校正曲线的线性。 • （2）锯齿扫描法：用以消除因斑点形状不规则、大小不等 以及浓度分布不均匀带来的测量误差。 • （3）校正曲线线性化：校正曲线线性化器校正光束被薄层 板上的吸附剂所分散，致使测定的吸光度不与物质含量成正 比偏离线性的影响。 • （4）背景补偿：补偿背景吸收光的影响。
到薄层斑点上，对整个斑点进行扫描，用仪器测量通过斑
点或被斑点反射的光束强度的变化达到定量分析的目的。 • 本实验根据试样中甲基红、甲基橙、甲基黄有不同的 极性，在硅胶板上用混合展开剂展开，可将它们分开。然 后采用岛津 CS-930 型双波长薄层色谱扫描仪，可直接在 薄层板上对甲基红斑点进行定量分析。
（3）测量：
A. 将薄层板固定于平台，接通电源开启主机，主机系
统自检后进入 CSLeabharlann 930 型薄层色谱扫描仪分析系统。
B. 对欲测斑点进行原位光谱扫描，根据斑点的吸收光谱选择 最大吸收峰波长作为λ1；选择斑点吸收光谱的基线部分，
既该化合物无吸收处的波长为样品的参考波长λ2。
C. 选择测试分析参数。 D. 确定光斑起始位置，进行色谱扫描。 E. 对色谱峰进行查找编辑。 F. 做工作曲线。 G. 执行定量，测得试样中甲基红的含量。 H. 确定要输出的内容与格式，打印分析实验报告。
五、思考题
• 1. 解释甲基红、甲基橙及甲基黄在硅胶板上以正丁
醇、无水乙醇和环己烷混合物为展开剂时，各组份
的位置，并说明各Rf 值不同的原因。 • 2. 本实验的误差来源主要在哪里？实验过程应注意 哪些？
双波长薄层色谱扫描法测 定甲基红含量
一、实验目的
学习利用岛津 CS-930 型薄层色谱扫描仪测定 甲基红含量的原理与方法，初步了解 CS-930 型 薄层色谱扫描仪的结构与使用。
二、实验原理
• 用于定量的薄层色谱仪称为薄层色谱扫描仪或薄层
色谱光密度计，用此种仪器对薄层上被分离的物质进行直
接定量分析的方法称为薄层色谱扫描法。其分析的基本原 理是用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光照射
• 试剂：
• 甲基红 分析纯 0.1%（60% 乙醇溶液）
• 甲基橙 • 甲基黄 • 试 样 指示剂规格 0.06%（水溶液） 指示剂规格 0.06%（95% 乙醇溶液） 内含甲基红0.1%，甲基橙 0.06% 和甲基黄0.06%
• 无水乙醇 分析纯 • 展开剂 无水正丁醇﹕无水乙醇﹕无水环己烷 = 3﹕1﹕4