血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
医学免疫学：血清免疫球蛋白的纯化
实验原理
• 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水 基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带 有电荷的情况决定的。
• 当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的 亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化 膜层减弱乃至消失;同时，中性盐加入蛋白质溶液 后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大 量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质 分子之间聚集而沉淀,这个过程叫做盐析。
• 边加PBS，边关注核酸蛋白检测仪的数值变化， 当数值到达5时收集核酸蛋白检测仪出水口的液体， 当数值下降到10时，停止收集。
• 将收集到的蛋白质液体用OD280和OD260测蛋 白质浓度。
实验结果
• 用紫外分光光度计测全血清和纯化后蛋白质溶液 的吸光度值，并求出蛋白质浓度。
蛋白质含量(mg/ml)= (1.45×OD280－0.74×OD260) ×稀释倍数
1.45和0.74是常数
注意事项
• 实验步骤中，用红色标出的地方。
实验原理—盐析
• 不同性质的蛋白质可通过加入不同浓度的中性盐 而分阶段从溶液中沉淀出来。
• 分离提纯IgG最常用的中性盐是硫酸铵。 • 30～50%的硫酸铵可以沉淀IgG。
实验原理—分子筛层析
• 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利 用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分 离物质的分子大小不同来进行分离。它的突出优 点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷， 吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温 度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成 分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质 有很好的分离效果。
液。置室温15min，离心3500rpm×10min，弃 上清。 沉淀物用2mlPBS重悬。
IgG的分离、提取与鉴定
IgG 分离、纯化与鉴定操作步骤：1、取2.5ml 血清，加pH7.0PBS 2.5ml，再逐滴加入（NH 4）2SO 4饱和溶液1.25ml，使成20%（NH 4）2SO 4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置20min。
2、3000r/min 离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
3、在上清液中再加（NH 4）2SO 4饱和溶液3.75ml，使成50%（NH 4）2SO 4溶液，充分混合，静置20min。
4、3000r/min 离心20min，弃上清，以除去白蛋白。
5、于沉淀中加5ml PBS ，使之溶解，再加（NH 4）2SO 4饱和溶液3.2ml，使成33%（NH 4）2SO 4溶液，充分混合后，静置20min。
6、3000r/min 离心20min，弃上清，以除去其它球蛋白。
7、用1ml PBS 溶解沉淀，装入透析袋。
8、透析除盐，在蒸馏水中透析过夜，再在pH6.7的磷酸盐缓冲液中于4℃透析24h，中间换液数次。
8、SephadexG50除盐：用蒸馏水浸泡5小时或在沸水浴中溶胀2小时，倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液（0.0175mol/L，pH6.7）搅拌成悬浮液，按下述方法装柱。
9、DEAE-纤维素的活化：称取1g DEAE32或52，放入5ml 量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE 的体积。
根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE 的用量，称取所需DEAE 用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。
抽干，改用0.5mol/L NaOH 溶液浸泡1h 以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH 至8左右（用pH 试纸检查）。
再改用0.5mol/L HCl 溶液浸泡1h 以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。
本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。
10、装柱用0.0175mol/L,pH6.7,磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE-纤维素，并更换1～2次。
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第24页
DEAE－纤维素离子交换层析纯化γ－球蛋白
血清α、β、γ－球蛋白、清蛋白等电点为：
清蛋白pI=4.64，
α2球蛋白 pI=5.06， β球蛋白pI=5.12，
γ球蛋白pI=7.3
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
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五、γ－球蛋白判定
用醋酸纤维素薄膜电泳方法，以血 清电泳图谱为对照，判定所分离蛋白质 种类和纯度（参见血清蛋白质醋酸纤维 素薄膜电泳）。
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
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蛋白质电离示意图
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
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基本原理
1、以醋酸纤维薄膜作为支持体一个电泳方法。 2、在pH8.6巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第35页
操作步骤：
1、装置电泳箱。区分电泳箱正负极 。
2、点样：浸于巴比妥溶液中薄膜，滤纸轻轻吸
干 — 半干燥态。
快
铅笔标识；点样器沾适量新鲜血清，垂直点样。
3、放入电泳槽，使膜保持水平。
4、通电：110伏，1小时。断电后，取膜。
5、染色：氨基黑10B染色5min。
6、漂洗：漂洗液浸洗3次，每次5-10min。
沉淀即为初步纯 化γ－球蛋白
倾弃上清液（主要含 α、β球蛋白）
加入0.0175mol/L磷酸缓冲液 （pH=6.3)1ml溶解
γ－球蛋白 粗提液
第9页
二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐
欲去除盐析法分离得到球蛋白粗提液中大量盐， 通常有两种方法：
凝胶层析法、透析
本试验采取葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方法 除去球蛋白粗提液中盐硫酸铵，方便下一步用离子交 换层析方法深入提纯球蛋白。
血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定
清蛋白及α 清蛋白及α、β球蛋白 被层析柱吸附, 被层析柱吸附 γ-球蛋白被洗脱 球蛋白被洗脱
0.06mol/LNH4Ac pH6.5 DEAE带正电荷
清蛋白pI 清蛋白 4.9，带负电荷多 ， α、β球蛋白pI 5.0～5.2， 球蛋白 ～ ， 带负电荷少
α、β球蛋白被洗脱, 球蛋白被洗脱 清蛋白仍被吸附
血清清蛋白、γ-球蛋白的 分离、提纯与鉴定
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内
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容
实验目的 实验原理 实验材料 实验过程 注意事项
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一、实验目的
（一）掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 （二）掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 （三）掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本 方法 （四）掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 （五）了解柱层析技术
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蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法
蛋白质的理化性质 常用的纯化方法
分子质量 透析、 透析、超滤 凝胶层析 离心 溶解度 调整pH 调整 调整离子强度 降低介电常数 电荷 电泳 等电聚焦 离子交换层析 特异结合部位 其他性质 亲和层析 吸附层析 液相层析 气相层析
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3. 染色和漂洗 电泳完毕后，关闭电源，将膜取出， 电泳完毕后，关闭电源，将膜取出， 直接浸于染色液中5min。 直接浸于染色液中 。 取出膜，尽量沥净染色液， 取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗 液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景颜 液中浸洗脱色（一般更换 次），至背景颜 色脱净为止。 色脱净为止。 取出膜，用滤纸吸干即可。 取出膜，用滤纸吸干即可。
实验层析技术血清球蛋白的分离纯化与鉴定正式版ppt
G-75 G-100
40～120 40～120
12～15 15～20
3×103 ～ 8×104 4和个性
共性： *生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析 *蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷→盐析/
有机溶剂沉淀 *两性电解质和等电点：pH> pI，蛋白质带负电；反之带正 电→电泳、离子交换层析 *有一定的功能：抗原性→ 免疫沉淀
交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数
凝胶型号 颗粒大小（μm) 溶胀体积(ml/g) 分离范围（Mr）
G-10 G-15 G-25 G-50
40～120 50～150 50～150 40～120
2～3 2.5～3.5 4～6 9～11
＜7×102 ＜1.5×103 1×103 ～5×103 1.5×103 ～ 3×104
*洗脱液：溶解待分离物质，不变性
阳离子交换剂 带负电荷，与混合物中带正电的组分结合 阳离子交换层析
交联葡聚糖凝胶
➢多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构珠状颗 粒，商品名为Sephadex G系列 ➢G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型 号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100， G-150，和G-200八种，具体含义为凝胶得水值的10 倍或吸水量（g）/10g干胶 ➢交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小， 吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此， “G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
异—吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子 ③浓缩：sephadex G-25吸水，利用高分子性质。
01M磷酸盐缓冲液（0. 分离依据：蛋白质理化性质的和个性
极性、分子亲和力以及分配系数。 蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构
IgG的分离与提纯
IgG的分离与提纯：硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。
但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。
通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。
因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。
γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。
纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。
之前根据载量估计一下需要的柱子体积。
实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。
下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。
一、材料与试剂配制1、动物血清2、硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。
如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3、0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至1000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。
4、1%BaCl2溶液5、纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。
6、0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液7、洗脱液0.03Mol/L的NaCl液。
血清IgG的分离
血清IgG的分离
引言
血清IgG的分离是一种常见的实验操作，用于从血清样品中纯化和分离出IgG抗体。
IgG作为一种免疫球蛋白，在研究和诊断中具有重要的应用价值。
本文将介绍一种简单的方法来实现血清IgG 的分离。
实验材料
- 血清样品
- 柱层析试剂盒（例如，Protein A/G柱）
- 洗涤缓冲液
- 结合缓冲液
- 洗脱缓冲液
- 分离缓冲液
操作步骤
1. 准备工作：
- 将柱层析试剂盒按照说明书准备好，确保所有的缓冲液和试剂适当配置。
- 样品处理前，将血清样品离心以去除杂质。
2. 结合IgG抗体：
- 将血清样品加入结合缓冲液中，根据比例稀释适量的样品。
- 在离心前，静置样品与结合缓冲液的混合物反应一段时间（例如，30分钟）。
3. 柱层析操作：
- 将混合物通过装有填充物的柱层析柱。
- 打开流量，并在结合完毕后关闭。
- 使用洗涤缓冲液进行洗脱，以去除非特异性结合物。
4. 洗脱和收集：
- 使用洗脱缓冲液进行洗脱，以从柱层析柱上洗脱结合的IgG 抗体。
- 收集洗脱液中的纯化的IgG抗体。
5. 质量检测：
- 通过测量IgG抗体的浓度或使用其他质量检测方法来确认分离的IgG抗体的纯度和活性。
结论
血清IgG的分离是一种简单且常用的实验方法，可以用于纯化和分离血清样品中的IgG抗体。
通过选择适当的柱层析试剂盒和正确操作步骤，可以高效地获得纯化的IgG抗体。
分离的IgG抗体可以用于各种研究和诊断应用中。
第五组血清IgG的分离纯化及鉴定
Байду номын сангаас样缓冲液
甘油：蛋白质沉到样品孔底部，不漂浮 β-巯基乙醇：切断二硫键，是蛋白质分 为两单条链 SDS:是蛋白质带负电荷并呈棒状
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（四）SDS-PAGE测IgG分子量结果
猪血清、纯化的IgG样品经SDS-PAGE电泳结果如下：
1标准蛋白
2 血清
3 纯化的IgG样品
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活性鉴定
琼脂扩散
开展讨论的过程中，同学们互相学习，对实验的
设计流程有了深刻的认识。实验其间，对于细节
上的问题我们更加耐心，为将来毕业论文的开展 提供了有力的基础。
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Contents
材料与方法 结果与讨论
总结与感想
2
一、材料与方法
（一）试验材料 1、试剂和材料
血清、饱和硫酸铵、0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PH=7)、 吸管、高速冷冻离心机
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方法及步骤
方法 通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中 的各个成分分步盐析出来，达到目的蛋白质。 不同饱和度硫酸铵浓度：V=V0（C2-C1)/(1-C2) V 应加入饱和硫酸铵溶液的体积 V0 蛋白质溶液的原始浓度 C1 原来溶液的硫酸铵饱和度 C2 所要达到硫酸铵饱和度
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步骤
1、取5mL血清和5mL0.01mol/L磷酸盐缓冲 液于小烧杯中，混匀，滴加饱和硫酸铵 溶液，使溶液浓度达到20%，4℃静置 15min 2、4℃ 3000r/min离心10min,弃沉淀（沉淀 为纤维蛋白原） 3、向上清中滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液 浓度达到50%，4℃静置15min
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4、4℃ 3000r/min离心10min,弃上清液（上 清为清蛋白，沉淀为球蛋白） 5、向沉淀中加5mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲 液，重悬沉淀，滴加饱和硫酸铵溶液， 使溶液浓度达到35%，4℃静置20min 6、4℃ 3000r/min离心15min,弃上清液（上 清为α、β球蛋白）沉淀为IgG
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实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。
血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。
分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。
在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。
其原理及操作如下：
㈠硫酸铵盐析
1.试剂
饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）
溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。
磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。
2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。
静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。
②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
③倾去上清液，将沉淀溶于5ml磷酸缓冲液（0.01mol/L pH7.0），再加饱和硫酸铵
3.2ml，此时溶液硫酸铵的饱和度约为33%，静置20min，以3000r/min离心15min，除去上清液，沉淀即为γ-球蛋白。
㈡凝胶过滤脱盐
1.试剂①Sephadex G-25：用前以蒸馏水浸泡5h或在沸水浴中溶胀2h；②磷酸盐缓冲液（pH6.7，0.0175mol/L）：见前；③磷酸盐缓冲液（pH7.0，0.01mil/L）见前；④奈氏试剂；
⑤20%磺酰水杨酸。
2.操作①取层析柱一根（1.5cm×20cm），垂直于固定架上，夹住流出口。
加10ml磷酸缓冲液（0.0175mol/L, pH6.7）于柱中。
将已溶胀好的Sephadex G-25倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液并搅拌成悬浮液，慢慢装入柱中，打开流出口，继续加入Sephadex G-25使自然沉降至15cm高，关闭出口。
②打开出口，使柱中多余的磷酸缓冲液流出凝胶柱床面（切勿低于柱床面）。
用吸管吸取盐析所得的蛋白质溶液2ml，沿管壁加入凝胶面上，打开流出口，让样品进入凝胶柱，再用滴管小心加入磷酸盐缓冲液至离凝胶面2～3cm高，编号，按顺序放在试管架上。
③在收集的同时，检查蛋白质是否流出。
于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中（按编号顺序），再分别加入1滴20%磺酰水杨酸，如出现白色沉淀即表示蛋白质已流出凝胶柱，如此直检查到蛋白质全流出为止。
与此同时，再从含蛋白质的管中取出1滴于白色比色板中，加入奈氏试剂1滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋白质中的硫酸铵已除去，合并无硫酸铵的蛋白质管，待用。
㈢DEAE-纤维素纯化免疫球蛋白G
1.试剂①DEAE-纤维素：DE-11、DE-22、DE-32、DE-52均可；②0.5mol/L HCl溶液；③0.5mol/L NaOH溶液；④pH6.7，0.0175mol/L磷酸盐缓冲液。
2.操作
（1）DEAE-纤维素的活化处理称取20gDEAE-纤维素，浸泡过夜。
次日倾去水，加0.5mol/L NaOH溶液100ml，轻轻搅拌。
静置，沉降后倒出NaOH溶液，用蒸馏水洗至pH为8左右，倒出上清液。
加0.5mol/L HCl溶液100ml，轻轻搅拌，静置10min，小心倒出HCl溶液，用蒸馏水洗至pH为6，待用。
（2）装柱取层析柱一根（1.5cm×20cm），按照安装Sephadex G-25柱的方法装柱。
待纤维素自然沉降后接通洗脱瓶让磷酸缓冲液（pH6.7，0.0175mol/L）流经柱床，待流出液的pH为6.7为止（充分平衡）。
（3）加样与洗脱关闭洗脱瓶，让柱内缓冲液流出至纤维素柱面，关闭流出口，用吸管将已脱盐的γ-球蛋白沿柱壁缓缓加入柱内，打开流出口，让样品进入柱床（勿使空气进入）。
立即用滴管向柱内沿管壁加入磷酸缓冲液至高出柱面2cm，接通洗脱瓶，调整流速至1.5ml/min，按每管1.5ml连续收集，出现白色沉淀者，即含有纯的IgG，继续收集，直至不发生白色沉淀反应时为止，合并蛋白管，置冰箱保存。
㈣免疫球蛋白G纯度的鉴定
免疫球蛋白G纯度的鉴定办法很多，最常用的是电泳。
免疫电泳、凝胶电泳等都可。
注：
[1]如在柱层析时连接核酸蛋白检验仪，则免去用磺酰水杨酸检测的步骤。
[2]50%饱和的硫酸铵使血清中球蛋白沉淀，33%饱和的硫酸铵使γ-球蛋白沉淀。
[3]在粗提的γ-球蛋白溶液中，当pH为6.7时，除IgG外，其他杂质蛋白均带不同数量的
负电荷。
因此，当粗提的γ-球蛋白在pH为6.7的溶液中经DEAE-纤维素柱时，IgG不发生交换而直接流出，其余蛋白质则发生交换而吸附，从而能得到较纯的IgG。