蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题解析
2024届新高考生物(选考)专题5 生物技术与工程 重点小专题14 基因工程
基因工程
考点一 基因工程 考点二 蛋白质工程 备用习题
网 络 构 建
1.判断有关基因工程和蛋白质工程说法的正误
高 (1)DNA连接酶作用的底物可以是DNA片段,也可以是单个核苷酸。 (×)
频 (2)用限制酶处理目的基因和Ti质粒,涉及氢键和磷酸二酯键的断裂。 ( √ )
易 错
(3)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。( ×)
料仅指四种脱氧核苷酸。
(4)利用PCR扩增目的基因时,不需要知道目的基因的全部碱基序列。 (√ )
(5)PCR过程中,模板DNA和引物能在每一次扩增中重复使用。 (×)
高 频
(6)PCR扩增区域由2个引物来决定。
(×)
易 (7)耐高温的DNA聚合酶只能从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸。 (× )
错 ●
是3'→5',非模板链(也就是a链)是5'→3';DNA复制中子链延伸方向为5'→3',故引物方向为
5'→3',所以F1配对的单链是3'→5'的b链,故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
考点一
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是
否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了J-V5融合蛋白,
错 ●
(3)利用PCR技术扩增抗虫基因时,PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。(√ )
考 前
[解析] (1)PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行,需提供DNA模板、2种引物、
清 四种脱氧核苷酸及耐高温的DNA聚合酶等。
零 (2)PCR过程中不需要解旋酶,DNA解旋是在高温下实现的,并且PCR需要的原
重组质粒的构建经验 [技巧]
![重组质粒的构建经验 [技巧]](https://img.taocdn.com/s3/m/f026746187c24028915fc3fa.png)
重组质粒的构建经验 [技巧]重组质粒的构建经验~~~昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一:本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
重组蛋白表达技术的使用中常见问题
重组蛋白表达技术的使用中常见问题蛋白质是生命体内重要的组成部分，它们参与了几乎所有的生物过程。
为了研究和利用蛋白质的功能，科学家们通过重组蛋白表达技术来大量产生目标蛋白。
然而，在使用重组蛋白表达技术的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将详细探讨重组蛋白表达技术使用中的一些常见问题，并提供相应的解决方法。
1. 表达水平低在使用重组蛋白表达技术时，常常会遇到表达水平低的问题。
低表达水平可能由多种原因引起，包括启动子的活性不足、转录过程中的阻塞或降解、翻译后期的限制以及蛋白质的不稳定性等。
解决方法：- 优化启动子选择：选择活性较高的启动子，如T7、CMV或SP6启动子。
- 优化培养条件：优化培养基组分、培养温度、表达宿主菌的载体拷贝数等，以提高蛋白表达水平。
- 优化转化方法：尝试使用电转化、化学转化或峰值冲击转化等方法来提高表达宿主菌的转化效率。
- 优化培养时间：延长培养时间，以便提高目标蛋白的表达水平。
2. 目标蛋白形成包含体在表达过程中，目标蛋白常常形成包含体（inclusion body），即蛋白质以不溶性的聚集体形式存在。
解决方法：- 优化培养条件：调整培养温度、培养基成分，提高溶解蛋白的折叠效率。
- 引入辅助蛋白质：结合引入辅助蛋白质的策略，帮助目标蛋白的正确折叠和溶解。
- 进行亲和纯化：通过抗标签或亲和层析等技术，将包含体中包含的目标蛋白从非特异性蛋白质中进行纯化。
3. 目标蛋白磷酸化或糖基化不足重组蛋白质常常需要进行修饰，包括磷酸化和糖基化等。
然而，有时目标蛋白表达后，修饰的程度不足，影响功能和稳定性。
解决方法：- 优化培养条件：调整培养基中相关原料的浓度，如添加合适的磷酸盐或糖类物质，促进修饰的进行。
- 引入修饰相关基因：将相关调控基因引入到表达宿主菌中，提高修饰相关酶的表达水平。
- 转化进化系统：构建具有修饰相关基因的酵母或细菌转化进化系统，通过长时间的适应培养，提高修饰效率。
4. 目标蛋白的折叠和稳定性问题有些目标蛋白在表达和纯化过程中容易失去活性或不稳定。
2022届高考生物一轮复习第十一单元现代生物科技专题第37讲基因工程作业含解析苏教版
第37讲基因工程1．下列关于各种酶的叙述，不正确的是( )A．DNA连接酶能将2个具有末端互补的DNA片段连接在一起B．PCR反应体系中的引物可作为DNA聚合酶作用的起点C．限制性内切酶可识别一段特殊的核苷酸序列，并在特定位点切割D．原核细胞RNA聚合酶以RNA为模板合成互补RNA解析：DNA连接酶能将2个具有末端互补的DNA片段连接在一起，形成磷酸二酯键，A正确；在PCR技术中，DNA聚合酶与引物结合后，才能将单个的脱氧核苷酸加到模板链上，因此引物可作为DNA聚合酶作用的起点，B正确；限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，C正确；原核细胞转录时，RNA聚合酶以DNA为模板合成互补RNA，D错误。
答案：D2．2015年诺贝尔化学奖颁给了研究DNA修复细胞基质的两位科学家，细胞通过DNA损伤修复可使DNA(基因)在复制过程中受到损伤的结构大部分得以恢复，如图为其中的一种方式——切除修复过程示意图。
下列有关叙述不正确的是( )A．图示过程的完成，可能需要多种酶的共同作用B．图中二聚体的形成可能是物理化学等因素的作用C．该修复过程遵循碱基互补配对原则D．对DNA(基因)的损伤修复，从生物变异角度看属于基因重组解析：图示过程的完成需要限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等的共同作用，A正确；二聚体的形成可能是受环境因素的影响，如物理、化学等因素，B正确；在两个胸腺嘧啶脱氧核苷酸封闭缺口的过程中利用了碱基互补配对原则，C正确；修复过程的变化不属于生物变异，D错误。
答案：D3．利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如下图所示。
下列说法错误的是( )A．cDNA文库的构建需要用到逆转录酶B．cDNA文库的基因数目比基因组文库的基因数目少C．核酸分子杂交的原理是碱基互补配对D．从该文库中可筛选到胰高血糖素基因解析：cDNA是以mRNA为模板，经逆转录酶催化形成的，故cDNA文库的构建需要用到逆转录酶，A正确；由于cDNA文库中只含有叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因，故两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，B正确；核酸分子杂交的原理是碱基互补配对，C正确；胰岛B细胞内的胰高血糖素基因不表达，所以从胰岛B细胞内提取不到胰高血糖素基因的mRNA，无法逆转录形成胰高血糖素基因的cDNA，故不能从利用人胰岛B细胞构建的cDNA文库中筛选到胰高血糖素基因，D错误。
重组质粒构建注意事项
重组质粒构建注意事项重组质粒构建是现代生物学中常用的技术手段，其能够利用DNA重组技术将感兴趣的基因片段插入到质粒中，从而探究基因的功能、调控及其在生物体中的作用。
下面是重组质粒构建中需要注意的一些关键问题。
1.选择合适的质粒载体：质粒是一种能够自主复制的小型DNA分子，其可以含有多个对基因表达有重要影响的元件，如启动子、终止子、选择性标记基因等。
因此，选择合适的质粒载体对于重组质粒构建至关重要。
一般而言，常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pBluescript等，根据实验需要选择适合的质粒载体。
2.选择合适的限制性内切酶：限制性内切酶是能够识别特定的DNA序列并具有切割作用的酶。
在重组质粒构建中，常需要利用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因片段的DNA，从而产生互补的粘性末端，便于二者连接。
因此，选择适合的限制性内切酶对于重组质粒的构建是非常重要的。
3.设计合适的引物：引物是在PCR扩增反应中用于识别目标DNA序列的短小DNA片段。
在重组质粒构建中，利用引物扩增目标基因片段是必不可少的步骤。
因此，设计合适的引物非常重要。
引物应具有良好的特异性，能够特异性地扩增目标基因片段，并且不会与质粒载体序列发生非特异性扩增。
此外，引物还可以设计一些限制性内切酶切割位点，以便于后续的连接工作。
4.进行寡核苷酸连接反应：连接反应是指将质粒载体和目标基因片段进行连接的步骤。
常用的方法有T4 DNA连接酶的连接反应和PCR引物连接法。
在连接反应中，需要注意合适的反应条件，例如连接反应的时间、反应体系的pH值、温度等，对连接效果有重要影响。
5.转化宿主细胞：转化是指将重组质粒导入宿主细胞中。
在进行转化实验时，需要注意选择合适的宿主细胞，例如大肠杆菌（E. coli）等，以及适当的培养基、适宜的温度和容器。
此外，还需要注意进行适当的筛选压力，如在含有选择性抗生素的培养基中进行培养，筛选能够稳定带有重组质粒的转化子。
重组质粒的构建酶切应注意的问题
（转）重组质粒的构建酶切应注意的问题重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下：1) 克隆基因的酶切位点问题2) 载体酶切的问题3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DN 段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4NdeI 6NheI 3NotI 8PmeI 6SacI 3SalI 3SmaI 3HindIII 3BstI 8SphI 4XhoI 3XbaI 3SmaI 4案例分析一：本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
后查文献得知症结所在，在NdeI序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。
大家引以为戒啊。
现在普通酶我都引入三个保护碱基。
现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。
蛋白质表达与纯化常见问题解答
蛋白质表达与纯化常见问题解答蛋白质表达与纯化是生物科学研究中常见的实验技术，用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用等。
然而，在进行蛋白质表达与纯化实验时，常常会遇到一些问题。
本文将针对蛋白质表达与纯化过程中的常见问题进行解答，帮助读者更好地进行实验和解决实验中可能遇到的困难。
一、蛋白质表达问题解答1. 为什么我的目的蛋白质在大肠杆菌中表达得不好？蛋白质表达的成功与多种因素相关，包括宿主菌的选择、启动子的选择、表达载体的构建等。
首先，确认宿主菌是否合适，某些蛋白质可能需要使用其他细菌或真核细胞进行表达。
其次，选择合适的启动子和表达载体，确保表达水平能够满足需求。
另外，光照条件、温度、培养基的选择等也会对表达效果产生影响。
2. 我应该选择哪种表达载体？选择表达载体应根据实验需求来定。
一般来说，常用的表达载体有质粒和病毒载体。
质粒表达系统适用于小规模表达和纯化，而病毒载体表达系统适用于大规模表达和高效表达。
另外，如果需要对蛋白质进行特定修饰，如标记或融合蛋白表达，可选择相应的表达载体。
3. 如何对表达后的蛋白质进行检测？常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE、Western blot和质谱分析等。
SDS-PAGE能够分析蛋白质的分子量和纯度，Western blot可以检测特定蛋白质的表达水平，质谱则可以确定蛋白质的分子量和结构。
根据实验需求选择合适的方法进行检测。
二、蛋白质纯化问题解答1. 我应该选择哪种纯化方法？选择纯化方法取决于蛋白质的性质和需求。
常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
亲和层析适用于具有特异结合能力的配体，离子交换层析适用于根据蛋白质电荷差异进行分离，凝胶过滤层析适用于根据蛋白质的分子量进行分离。
根据蛋白质的特性选择合适的纯化方法。
2. 如何确定纯化效果？纯化效果可通过测定蛋白质的比活性、比强度和纯度来确定。
比活性和比强度分别指的是单位反应物质的相应活性或强度，纯度则指的是蛋白质在总样品中所占的比例。
原核表达系统蛋白表达问题解析
活性蛋白整体方案原核表达系统蛋白表达问题解析摘要：本文主要对原核蛋白表达纯化体系中的常见问题进行收集整理，并附有解决思路和相应的实际操作。
外源DNA片段成功插到载体里面（PCR鉴定），但无法表达蛋白一般判断目的基因是否表达，首先要进行SDS-PAGE检测。
跑胶的时候一定要设对照：Marker，标准品阳性对照，以及空白载体(诱导)和重组载体(不诱导)2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。
跑SDS-PAGE的话可以用考马斯亮兰染，它灵敏度在100ng左右；但是不能跟着做western blot了。
银染的灵敏度在0.1～1ng；或是Sypro Red，灵敏度高还可以继续做Western blot。
在做过Western Blot仍没有检测到表达带，那么就要先判断载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。
其次要对测序结果进行确定，确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的情况。
最后，也需要注意基因中是否有稀有密码子，可更换表达菌株。
每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。
不同的载体要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。
采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。
例如，使用BL21(DE3)菌株表达不成功可以尝试用Rosetta系列菌株表达，它能够由一种氯霉素抗性的、与pET相容的质粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNA。
所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。
有时不明原因的表达蛋白截短(比预期的分子量要小很多)也可能是由于稀有密码子造成的。
没有发现原则性错误之后，可以从表达条件入手，梯度条件改变表达温度、IPTG浓度，低温、较长时间的表达有利于蛋白稳定、融合表达；低浓度的IPTG可以减少化学物质对细胞的损伤。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pET-32a（+），从
Eco RⅠ和HindⅢ酶切位点插入PCR产物-PrP
435。
但由于单菌落所得载体pET-32a （+）在Eco RⅠ位点突变，由GAATTC突变为GAATTA（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a（+），在4℃连接过夜、TSS法转化E.coli DH5a 未获成功。
而将一周以后在4℃保存的连接液TSS法转化E.coli DH5 a却获成功。
我们利用双引物primer
genome
进行菌落PCR筛选阳性克隆时发现，本应扩增出430 bp的DNA片断，实验结果却扩增出约1300 bp，860 bp，430 bp三个DNA条带。
消除所有污染因素后，结果依然是三个DNA条带。
由此我们怀疑可能是PCR产物串联以后连入pET-32a（+）。
根据以上现象我们对结果作如下探索：疑似串联重组质粒命名为
PrP
X -pET-32a（+），PrP
X
-pET-32a（+）转化E.coli BL21（DE3），进行表达鉴
定；Eco RⅠ单酶切PrP X-pET-32a（+），琼脂糖凝胶回收，重新连接，试图获得
单拷贝阳性克隆；用引物primer
vector 进行菌落PCR鉴定；使用5′primer
genome
单
引物进行菌落PCR筛选鉴定； PrP
X
-pET-32a（+）和pET-32a（+）测序。
试验结
果表明：表达出49 KD蛋白，比单拷贝克隆表达蛋白（35 KD）多15 KD，相当于2倍拷贝串联克隆表达蛋白大小。
由于插入片段已突变出两个终止子，所以我
们认为PrP
435
串联数应在2以上，前一拷贝应为反向插入，而后一拷贝应为正向插入。
使用5′primer
genome
单引物进行菌落PCR，试验结果扩增出约860 bp，420 bp，两个DNA片段，420 bp附近有稍大模糊条带，据此我们认为：串联数应在4以
上。
因为，由图3-5，使用5′primer
genome
单引物进行菌落PCR时，上游因物在
E1-E6处和PrP
X -pET-32a（+）退火，下游引物在H1-H5处和PrP
X
-pET-32a（+）
退火，上游因物带有Eco RⅠ酶切位点可以与载体上E0产生错配。
所以E1和H1之间可扩增出430 bp片段，E1和H5之间可扩增出约1300 bp片段，E1和E4之间可扩增出约860 bp片段。
E1和3之间Taq酶同时往中间扩增，Taq酶要占一定的空间，就会使下游引物所加的HindⅢ酶切位点和三个保护性碱基消失一部分，扩增出约420 bp（比430 bp小）条带。
其他各条带可同理推出。
图3-5串联质粒PrP X-pET-32a（+）多克隆位点
Fig.3-5 The MCS of cascade recombinant PrP X-pET-32a（+）
sense strand ，anti- sense strand ， H HindⅢ，
E Eco RⅠ，vector
本实验早期我们用Eco RⅠ单酶切PrP X-pET-32a（+），琼脂糖凝胶回收，并重新连接，试图获得单拷贝阳性克隆，但重复多次，经表达鉴定，未获成功。
原因是Eco RⅠ位点突变（已测序）。
以后重复该实验所用pET-32a（+）Eco RⅠ位点完好，Eco RⅠ单酶切PrP X-pET-32a（+），琼脂糖凝胶回收，重新连接，实验结果获得单拷贝阳性克隆。
-pET-32a（+）经上海联合基因公司和上海基康基因公司测序均未获成PrP
X
功。
原因可能是串联克隆造成的多个长回文序列，形成DNA的某种二级结构造成测序困难。
虽本实验然重复出了失误实验的结果，表达出了相应的蛋白作，但也只是一次探索。
建议对以下三个方面作进一步得把探索性研究，首先由于测序无法完成，可进一步做Western-Blot鉴定（使用牛朊蛋白单抗做过两次，非特异性较强，未能得到好的照片）；其次，此方法上游第一个连入拷贝为反向反意义链并产生
一个终止子，导致蛋白表达量很低，而且为无用蛋白，若能将引物primer
genome 两个酶切位点作颠倒，使用单酶切两种PCR产物（酶切位点相互颠倒），作连接以后，再做克隆，可克隆入完全正向连接的串联克隆；再次，此方法上游第一个连入拷贝为反向反意义链，可表达出PrP核心片段的反义肽，可做反义肽方面的进一步探索。
有时候实验中出现串连并不是我们所期望的，如何避免串连，提高连接效率?笔者做过这方面的探讨。
具体如下：由于细菌在遗传上的不稳定性，在进行细菌操作时，应挑选多个菌落。
在实验过程中曾经遇到pET-32a（+）Eco RⅠ位点由GAATTC突变为GAATTA（已测序），造成连接以后连接产物的串联，就是由于在操作过程中挑选单个菌落造成的。
重组质粒构建通常使用酶切然后胶回收再连接、转化，最后进行阳性克隆鉴定的方法。
但实验中经常遇到酶切操作困难和胶回收量低、转化效率低、串连等问题。
特别是进行双酶切时，由于两个酶在通用buffer中的效率不一致，琼脂糖凝胶电泳无法区分单酶切和双酶切，连接产物中可能混有大量的空载体，这样就会给阳性克隆筛选带来麻烦。
还有可能由于过多的剧烈条件造成酶切产物个别核苷酸的丢失，还可造成重组质粒的错义突变甚至无义突变。
我们将重组质粒的构建方法略加改进，取得了良好的效果和重复性。
具体操作介绍如下：
pET-32a（+）去RNA，经溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、氯仿、乙醇沉淀。
将pET-32a（+）与PCR产物按1：20的比例混合，Eco RⅠ和Hind Ⅲ双酶切2小时。
酶切产物不进行任何形式的纯化，直接用1/10量连接2小时。
连接产物立即转化E.coli DH5α，在含50 ug/ml AMP 的液体TB培养基中过夜，收集细菌提取质粒、纯化。
用pET-32a（+）多克隆位点上Eco RⅠ和Hind Ⅲ之间已被双酶切去除的SalⅠ位点对应酶SalⅠ单酶切（图1－8），使pET-32a（+）空载体线性化。
酶切产物转化E.coli BL-21，涂布含50 ug/ml AMP LB平板，挑单菌落进行菌落PCR，筛选阳性克隆。
转化E.coli BL-21之前也可进行阳性克隆富集。
上述包含阳性克隆和pET-32a（+）空载体混合质粒，用SalⅠ和XholⅠ双酶切，乙醇回收去掉小片段， T4DNA连接酶连接反应体系同上。
TSS缓冲液转化E.coli BL-21（DE3）。
（图1-7， 1-8）
图1-7 一种新的重组质粒构建方法
Fig.1-7 A new method for the contruction of recombinant plasmid
图1-8 pET-32a（+）多克隆位点
Fig. pET-32a（+） MCS
此方法具有很大的跳跃性，不需检测酶切是否完全，SalⅠ单酶切使pET-32a （+）空载体线性化。
E.coli BL-21的转化效率大约是E.coli DH5α的1/10（见《pET System Manual》22页），线性化pET-32a（+）比超螺旋质粒转化率低的多，线性化空载体转入E.coli BL-21的几率很小。
经两次富集阳性克隆，菌落PCR筛选阳性克隆率几乎100%。
传统方法使用胶回收pET-32a（+）的浓度
很低，难于测定OD
值，载体和PCR产物比例不当很容易造成串联，本方法未
260
将载体和PCR产物的酶切小片段去除，各粘性末端都有对应的酶切小片段，串联的几率降低到最小。
所以连接时可以不加限制的增加PCR产物的量，极大的提高了正确连接的效率。
胶回收DNA，可能由于剧烈条件造成酶切产物个别核苷酸的丢失，造成重组质粒的错义突变甚至无义突变。
本方法将胶回收DNA步骤取消，降低质粒的错义突变和无义突变的几率。