兔瘟组织灭活苗的制作
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猪瘟兔化组织灭活疫苗的研制
苗 在 ２ ８℃存 放 ｌ ～ ２个 月 ， 温存 放 ６个 月 ， 苗 效 力 不 变 。 室 疫
关键词 ： 瘟 ； 活疫苗 ； 胶 ； 猪 灭 蜂 免疫 效 力 ； 体 抗
中 图分 类 号 ：８ ９７ ７ ￥５． ９ 文 献 标 识 码 ： Ａ 文 章顺 序 编 号 ： ６ ２ ５ ９ （０ ０ ０ — １ ２ ０ １７ — １０ ２ １ ）５ ０ ４ — ２
为 当地 规 模 猪 场 的 猪 瘟 预 防 起 到 了 良好 的 效 果 。
１ 材 料 与 方 法 １１ 材 料 ．
１ ． 疫 苗 的 安 全 性 检 测 ．１ ２
１ ．． 小 白鼠安检 ：取试制的 ０ ０ ４６ ３ ．１ ２ １ ６ １ ）０ 批猪瘟兔化组织灭活 疫苗 ， 皮下接种 １～ ２ｇ小 白鼠 ｌ ８ ２ Ｏ只 ， 每只０５ｍＬ 观察 １ 。 ． ， ０ｄ １２１２ 猪 安检 ： ．．． 取试 制 的 ０ ０ ～ ６ ３批 猪瘟 兔化组 织 灭活 ６ １ ００ 疫苗 ， 每头 颈 部肌 肉接 种 ２ ７日龄 的仔 猪 ｌ ０头 ， 每头 ４ｍＬ ，
猪 瘟
（ｌｓｉａ ｗｎ ｆｖｒ Ｓ ） 是 由 猪 瘟 病 毒 ｃａｓ ｌ ｉｅ ｅｅ， Ｆ ｃ ｓ Ｃ
９ ％食用 酒精 ， ８ ５ 置 ５℃水浴 溶解 ， 制成备 用 。 １１６ 种毒 的制 备 ： 猪瘟 毒 株 Ｃ株毒 种做 适 当稀 释 ， 种 ．． 将 接 大 白兔 ． 种 后 每天 间 隔 ４ｈ测 １次 体 温 ， 择 定 型热 反 应 接 选 兔 ， 杀 ， 菌收 取脾 脏及 淋 巴结 。按一 定 比例加 入灭 菌 生 剖 无 理盐 水 ， 制备 脾 、 淋毒 ， 过滤 ，７ 一 ０℃保存 备用 。 １１ 疫 苗 的制 备 ：将生 产 用 的 毒种用 灭 菌生 理 盐水 适 当 ．． ７ 稀 释 ， 入 双抗 ， ２ ８℃作 用 ２ ４ｈ 然 后 接种 乳兔 两侧 臀 加 置 ～ ～ ， 肌 ， 只 １ ， 天 定 时观 察 乳 兔 ， ４ 每 ｍＬ 每 至 ８ｈ取 出所 有 活兔 ， 置冰 箱快 速冻 死 。无 菌操作 取 心 、 、 、 以及 胴体 ， 脾 肝 肾 研磨 打碎 ， 甲醛 灭 活后 ， 经 与一 定 比例 的蜂胶 溶 液制 成猪 瘟 兔化 弱毒灭 活疫 苗 ， 检 ， 菌 分装 。
关键词 ： 瘟 ； 活疫苗 ； 胶 ； 猪 灭 蜂 免疫 效 力 ； 体 抗
中 图分 类 号 ：８ ９７ ７ ￥５． ９ 文 献 标 识 码 ： Ａ 文 章顺 序 编 号 ： ６ ２ ５ ９ （０ ０ ０ — １ ２ ０ １７ — １０ ２ １ ）５ ０ ４ — ２
为 当地 规 模 猪 场 的 猪 瘟 预 防 起 到 了 良好 的 效 果 。
１ 材 料 与 方 法 １１ 材 料 ．
１ ． 疫 苗 的 安 全 性 检 测 ．１ ２
１ ．． 小 白鼠安检 ：取试制的 ０ ０ ４６ ３ ．１ ２ １ ６ １ ）０ 批猪瘟兔化组织灭活 疫苗 ， 皮下接种 １～ ２ｇ小 白鼠 ｌ ８ ２ Ｏ只 ， 每只０５ｍＬ 观察 １ 。 ． ， ０ｄ １２１２ 猪 安检 ： ．．． 取试 制 的 ０ ０ ～ ６ ３批 猪瘟 兔化组 织 灭活 ６ １ ００ 疫苗 ， 每头 颈 部肌 肉接 种 ２ ７日龄 的仔 猪 ｌ ０头 ， 每头 ４ｍＬ ，
猪 瘟
（ｌｓｉａ ｗｎ ｆｖｒ Ｓ ） 是 由 猪 瘟 病 毒 ｃａｓ ｌ ｉｅ ｅｅ， Ｆ ｃ ｓ Ｃ
９ ％食用 酒精 ， ８ ５ 置 ５℃水浴 溶解 ， 制成备 用 。 １１６ 种毒 的制 备 ： 猪瘟 毒 株 Ｃ株毒 种做 适 当稀 释 ， 种 ．． 将 接 大 白兔 ． 种 后 每天 间 隔 ４ｈ测 １次 体 温 ， 择 定 型热 反 应 接 选 兔 ， 杀 ， 菌收 取脾 脏及 淋 巴结 。按一 定 比例加 入灭 菌 生 剖 无 理盐 水 ， 制备 脾 、 淋毒 ， 过滤 ，７ 一 ０℃保存 备用 。 １１ 疫 苗 的制 备 ：将生 产 用 的 毒种用 灭 菌生 理 盐水 适 当 ．． ７ 稀 释 ， 入 双抗 ， ２ ８℃作 用 ２ ４ｈ 然 后 接种 乳兔 两侧 臀 加 置 ～ ～ ， 肌 ， 只 １ ， 天 定 时观 察 乳 兔 ， ４ 每 ｍＬ 每 至 ８ｈ取 出所 有 活兔 ， 置冰 箱快 速冻 死 。无 菌操作 取 心 、 、 、 以及 胴体 ， 脾 肝 肾 研磨 打碎 ， 甲醛 灭 活后 ， 经 与一 定 比例 的蜂胶 溶 液制 成猪 瘟 兔化 弱毒灭 活疫 苗 ， 检 ， 菌 分装 。
自家组织灭活苗制作
自家组织灭活苗制作鸡组织苗的制作用具及其消毒:手术剪/镊子、饭盒、三角瓶、量杯、纱布等高压消毒。
捣碎机:用温和消毒水浸4-5小时(浓度为正常浓度的2倍)之后用温开水冲洗掉消毒药。
1.采病料:发病死亡鸡的典型脏器，肝、脾、肺、肾、法氏囊、输卵管等典型病变脏器，也可从不同的鸡采取(结合猪的典型病料提取)。
将组织的结缔组织去除。
放在冰箱或冰柜冷冻室反复冻融，冰冻后拿出融化，升至常温再放冰箱冷冻，反复操作最少三次。
这样做的目底是让病毒从内脏组织病料中最大程度的释放。
(也可借此机会逐渐切碎)2. 称重:将采取的组织称重，一般按W:V比加入1:3或1:5的生理盐水稀释，即300克组织加入1000或1500毫升生理盐水。
3. 粉碎:用组织粉碎机粉碎组织，越碎越好，制成组织悬液。
4.过滤:先用2层灭菌纱布粗过滤，边过滤边搅拌组织悬液;滤液再用8层灭菌纱布精过滤;最好用12层纱布过滤。
5.配制1%~2%的甲醛灭活液:99%以上纯的甲醛用灭菌生理盐水配制成1%(或2%)，如果是福尔马林，2.78毫升相当于1毫升甲醛，如配制1000毫升1%的甲醛灭活液需加入27.8毫升。
6.灭活:将甲醛溶液加入滤液中，使甲醛的终浓度为0.1-0.3-0.5%。
在37?(30~40?之间也可)灭活48~72小时，每2小时振摇一次，以充分灭活。
7.进行安全性检测。
无菌检查: 取灭活的组织液0.2ml，各接种血琼脂斜面及肉汤培养基，37培养24--48小时，观察无菌生长; 安全检查: 选择1.5Kg以上健康兔4只，分两组，每组两只，试验组皮下接种灭活组织液5ml/只，对照组接种PBS液5ml/只，观察7天，无不良反应则为合格;效力检验: 选择1.5Kg以上健康兔4只，每只肌注1ml，20天后采集兔的血液并分离血清，进行HI试验，检测血清抗体效价;或取对照兔2只，连同试验兔一起，用兔瘟强毒进行攻毒，结果对照兔2/2死亡，试验验兔3/4保护或对照兔1/2死亡，试验兔4/4保护，说明所制的兔瘟组织灭活疫苗合格。
组织灭活苗的制备过程
组织灭活苗的制备过程
1、病料采集
2、病料处理
3、配苗
4、灭活
一、材料：脾脏、淋巴结等组织、甲醛、硫
柳汞、恒温箱、剪刀、漏斗、镊子、三
角烧瓶、烧杯、移液器、匀浆机、纱布
二、步骤：
1、无菌处理：去除被膜、大血管、脂肪、
筋膜，称重。
剪成1平方厘米大小的小块，匀浆。
2、无菌检验，测定病毒效价
3、生理盐水4-6倍稀释，搅拌均匀
4、过滤。
纱布4-8层进行过滤，取上清液
5、灭活剂配制：计算甲醛用量，使甲醛最
终浓度达到0.5%。
（用甲醛的目的是使蛋白变性）。
6、缓慢加入甲醛，边加边搅拌。
用三角烧
瓶盛装。
7、牛皮纸扎好三角烧瓶，放入恒温箱内，
38摄氏度下放置24小时。
（病毒苗24
小时，细菌苗48小时。
）
8、分装灭菌瓶，每瓶100毫升。
9、成品检验：要求无菌、达到一定的效价、
安全等。
10、保存：4摄氏度冰箱保存，用时摇匀。
注：若长久保存，需加入硫柳汞（防腐剂）。
固体硫柳汞配制成1%浓度的水剂，加入到灭活苗中的终浓度为万分之一；也可加入有治疗作用的双抗（如青链霉素）。
兔瘟组织灭活苗的制作
RHDV可凝集人的O型红细胞，温度对血 凝无显著影响，PH4.4-7.2时血凝稳定，血 凝具有特异性，能被高免血清所抑制。
10%肝悬液4000rpm，10-15分钟离心后取上清， 1%人O型红细胞做HA，放置20-30分钟出结果， 血凝现象的观察时间不超过45分钟。 HA≥1︰160即为阳性 阳性病料无论是自然死亡 还是人工感染致死，其血凝价一般不低于25。
细菌(bacteria)的细胞形态
1、球菌
单独存在时为圆球形，几个细菌联在一起时其 接触面稍为扁平。按其分裂方向和分裂后排列状态， 可以分为：单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、 链球菌、葡萄球菌。
2、杆菌
细胞呈杆状或圆柱状，各种杆菌的长度与直径 比例差异很大，有的粗短，有的细长，短杆菌近似 球状，长杆菌近似丝状。一般来说，同一种杆菌其 粗细比较稳定，而长度则经常因培养时间、培养条 件不同而有较大变化。有的杆菌很直，有的稍弯， 有的两端截平如炭疽芽孢杆菌，有的略尖，有的半 圆。
（三）革兰氏染色 革兰氏染色法于1884年由丹麦医生Gram创立，是延用 至今的经典染色法。 经革兰氏染色后可以把全部细菌分为G+和G-两大类。 染色机制：与细菌细胞壁的结构和组成有很大关系。 G+细菌：肽聚糖层厚，含量多，经乙醇处理后使之发 生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细 胞内而不被脱色，复染后不着色，保持结晶紫的颜色； G-细菌：肽聚糖层很薄，含量少，脂肪含量高，经乙 醇处理后部分细胞壁脂类可能被溶解并改变其组织状态， 细胞壁孔径变大或通透性增加，不能阻止溶剂透入，酒精 将结晶紫与碘的复合物洗脱，细菌被脱色，经复染后染成 红色。
外膜
肽聚糖 脂蛋白
染色操作步骤—涂片固定
干燥
取菌液一环 涂片 干燥
兔瘟组织灭活苗的制作课件
疫苗的副作用和注意事项
副作用
少数家兔可能会出现过敏反应，如呼吸急促、皮肤瘙痒等， 应立即就医处理。
注意事项
接种前应检查疫苗的生产日期和质量，确保疫苗未过期或未 受污染；接种时应严格遵守操作规程，避免交叉感染；接种 后应观察家兔的反应，如有异常应及时处理。
兔瘟的预防和控制
04
兔瘟的预防措施
01
02
加强协作和信息共享
养殖场应与当地兽医部门加强协作，及时交流疫情信息和防控经验 ，共同做好兔瘟的防控工作。
结论与展望
05
当前研究的局限性和不足之处
实验样本量不足
缺乏长期追踪数据
由于实验资源有限，目前的研究主要基于 小样本量，可能影响结果的普遍性和可靠 性。
关于兔瘟组织灭活苗的长期效果，目前的 数据还不够充分，需要进一步追踪和观察 。
03
使用和效果
疫苗的接种对象和接种方法
接种对象
适用于兔瘟易感家兔，包括各年龄段 的家兔。
接种方法
皮下或肌肉注射，根据家兔的体重和 年龄选择适当的接种剂量。
疫苗的保护效果和免疫期
保护效果
兔瘟组织灭活苗对兔瘟具有很好的预防效果，免疫后家兔的发病率和死亡率显著 降低。
免疫期
接种后，家兔的免疫期一般为3-5年，但建议每年进行一次加强免疫，以保证家 兔的健康。
03
定期接种兔瘟疫苗
按照疫苗接种计划，定期 为兔子接种兔瘟疫苗，提 高兔子的免疫力。
严格检疫和隔离
对新引进的兔子进行严格 的检疫和隔离，防止携带 病毒的兔子进入养殖场。
加强养殖管理
保持养殖场的环境卫生， 定期清理和消毒养殖设施 ，提高养殖兔子的健康水 平。
兔瘟的控制策略
兔病毒性出血症组织灭活苗的研制
血平 皿 、 肉基 及 肉汤培养基 ，７ 熟 ３ ℃培养 ４ ｈ 观察有 无细菌 ８， １ ． 红 细胞凝集抑制试验 （ ） 根据薛华平微量血凝试 ．６ ２ ＨＩ 验， 于微量血凝反应板 的第 １ １ ， ｆ ／ 生理盐 水 ００５ ～１ 孔 每－ Ｊ Ｌ￣ ｌ ． ２ ｍ ， １ 加 ００ｍＬ 再 向第 １ Ｌ 第 ２孔 ． ５ ； 孔加 入 已知兔 瘟 阳性 血清 ０ ２ Ｌ， ． ５ ｍ 并倍 比稀 释至第 １ ０ ０孔 ； １ １ 孔各加 ４ 自 １ Ｕ血凝 价的被检抗原 ００ ５ ， ． ｍＬ 在微型混和器上振荡 ｌ ｉ。置 ３ ℃ ２ ｍｎ ７ 温箱 ３ ｍｎ 其 问摇振 ２～３次 。然后每孑 加 １ ０ ｉ， Ｌ ％０型红细胞 ０ ２ｍＬ 在混合 器上振荡 １ ｉ， ４Ｃ冰箱感 作 ３ ｉ ．５ ， ０ ａ ｒｎ置 ￣ ０ ｍ ｎ观 察结果 。以血凝抑制的最高稀释度为判定终点。 １ ． 安 全检验 ．７ ２ 疫苗 经无 菌检查合格后分装 ， 然后抽样做
毒性 出血症 病毒（ＨＤ ） ０ ％甲醛 溶液在 ３ ｃ条件 下能 Ｒ Ｖ经 ． ５ ７ｃ
失去致病性而保持其免疫原性 。目前 ， 对此病没有确实有效
的治疗方法 ，广泛用于本病的预防方法是定期 接种 Ｒ Ｄ组 Ｈ 织灭活疫苗 。 该苗制作方法简单 ， 不须复杂的设备 ， 免疫效果 确实 ， 具有 良好 的保 护性 。经试验证实 ， 该苗的保护效果好 ， 应用方便 ， 在普通冰箱中即可保存 ， 近期保护率为 １０ ０ ％。
１２ 方 ． 法
２ ． １细茵学检验结果 病毒接种死亡兔的肝 、 、 脾 肾于血琼脂
取含毒兔 的肝 、 、 用生理 盐水 制 脾 肾， 平板划线 培养均不见可疑菌落生长 。 ２ ＨＡ试验结 果 ６只接 毒兔 的接种剂量 不 同 ， Ａ结果 ． ２ Ｈ 明 显 不 同 。试 验 证 明 接 种 ｌ Ｌ为 最 适 剂 量 。 因为 ｌ Ｌ中 的 ｍ ｍ
佐剂及灭活疫苗的制作
氢氧化钠合成法。其中，用铝粉加烧碱合成法最为常用，其基本原理为：
2Al(OH)3 十 12H2O 十 3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O。 Al2(SO4)3·18H2O 十 6NaOH→2Al(OH)3 十 2Na2SO4 十 18H2O。 用三氯化铝与氢氧化钠合成，此法合成的铝胶含量低，透明无沉淀，目前广泛用于制备人用生物
二、实验内容
1、配制白油佐剂； 2、配制氢氧化铝胶佐剂； 3、配制蜂胶佐剂。
三、实验原理
油佐剂、氢氧化铝胶和蜂胶常用于兽用灭活疫苗。佐剂活性与质量密切相关，优质佐剂应具备分子
细腻、胶体性良好、稳定和吸附力强等特点。 （一）油佐剂由矿物油和乳化剂组成。矿物油应不含多环芳烃化合物、粘度低、无色、无味和无毒性。
六、注意事项
1、灭活要彻底，以免影响疫苗的安全性。 2、水相制备时，使抗原与 Tween-80 充分混匀。 3、乳化时，注意将油相冷却后再乳化，以防油温过高使抗原性降低。 4、注意先加入油相后再加入水相，充分搅拌。
七、实验结果记录
八、实验总结
——本资料由王印整理，难免错误——
6
《动物生物制品学》实验课程
实验三、兔病毒性出血症组织灭活疫苗的制备
专业：
姓名：
学号：
成绩：
—————————————————————————————————
一、实验目的
1、了解并掌握兔病毒性出血症组织灭活疫苗的制备程序。
二、实验内容
1、兔病毒性出血症病毒增殖和组织灭活疫苗的制备。
三、实验原理
兔病毒性出血症病毒可引起兔严重疾病，病毒培养困难，现仍然没有发现适应病毒体外培养的细胞
六、注意事项
1、硫酸有很强的腐蚀性，应放在耐酸搪瓷缸配置，操作要十分小心，防止爆沸时溅出，造成伤害。 2、氢氧化铝具有较强的吸附力，所以制胶过程中一般用软化水或去离子水洗涤。 3、氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态，故要掌握好化合时的 pH。 4、油相制备时，温度和时间要掌握好，要使 Span-80 和硬脂酸铝充分溶解。
兔瘟组织灭活苗的制备[1]
![兔瘟组织灭活苗的制备[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/9c41df966bec0975f465e202.png)
%+组织灭活 在稀释液中加入试剂
纯 福 尔 马 林 液 ，使 其 最 终 含 量 为 "+/2，充 分 摇 匀 ， 用 玻 塞 盖 口 再 用 溶 蜡 密 封 。 置 于 0$3环 境 中 作 用 !% 小 时 ，每 ! 小 时 振 摇 一 次 ，使 其 充 分 灭 活 ，即 成 疫苗。
)+无菌检验 在无菌操作平台上取自制疫苗 用涂布法接种血琼脂平板 ! 个及厌氧肉肝汤 ! 支 ，0$3培 养 $! 小 时 未 见 细 菌 生 长 。
养水平的差异而造成羊绒自然脱离存在先后顺序，
因 此 抓 绒 不 能 搞 集 中 时 间 打 歼 灭 战 ，而 应 从 四 月 初
开 始 ，按 脱 绒 先 后 顺 序 首 先 从 成 母 羊 抓 起 ，逐 日 检
ห้องสมุดไป่ตู้
查 ，发 现 脱 绒 几 只 就 抓 绒 几 只 ，个 别 体 弱 者 可 延 长
到 夏 至 后 与 育 成 羊 一 并 抓 绒 ，而 对 六 月 龄 左 右 个 体
部羊绒已经部分丢失，倘若羊绒脱
离皮肤达到或超过 ! 公分时，不仅 双侧胸腹部羊绒大部分丢失，而且
其他部位的仅存羊绒也不同程度地
形 成 了 板 结 ，其 经 济 损 失 是 很 大 的 。
可是在现实养殖生产中，不少农村 梁 世
养殖户抓绒却晚于适时抓绒时 间 !" 同
天甚至更长的时间。这是因为他们
唯 恐 抓 绒 “早 ”了 羊 只 受 寒 。笔 者 认
作 者 单 位 ：河 北 大 午 农 牧 集 团 公 司
0#
灭 赵 凝 试 验 ，测 其 毒 价 为 !/。
志
活良
0+材料稀释 先将病料加入等量生
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（三）革兰氏染色 革兰氏染色法于1884年由丹麦医生Gram创立，是延用 至今的经典染色法。 经革兰氏染色后可以把全部细菌分为G+和G-两大类。 染色机制：与细菌细胞壁的结构和组成有很大关系。 G+细菌：肽聚糖层厚，含量多，经乙醇处理后使之发 生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细 胞内而不被脱色，复染后不着色，保持结晶紫的颜色； G-细菌：肽聚糖层很薄，含量少，脂肪含量高，经乙 醇处理后部分细胞壁脂类可能被溶解并改变其组织状态， 细胞壁孔径变大或通透性增加，不能阻止溶剂透入，酒精 将结晶紫与碘的复合物洗脱，细菌被脱色，经复染后染成 红色。
兔病的综合诊断
王海荣
流行病学诊断
临床诊断
被检材料
病理诊断
增菌培养
镜检 生化试验 （种属）
纯培养
动物试验
培养特性
血清学试验
活苗
药敏试验
灭活苗
微生物(Microorganism) 形体微小、结构简
单，须借助于光学显微镜或电子显微镜进行观 察。 病毒(包括噬菌体)； →非细胞型微生物 细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣 →单细胞原核微生物 原体、螺旋体等； 真菌：包括酵母菌（单细胞）、霉菌（多 →真核微生物 细胞）； 单细胞的藻类以及原生动物等。
细菌(bacteria)的细胞形态
1、球菌
单独存在时为圆球形，几个细菌联在一起时其 接触面稍为扁平。按其分裂方向和分裂后排列状态， 可以分为：单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、 链球菌、葡萄球菌。
2、杆菌
细胞呈杆状或圆柱状，各种杆菌的长度与直径 比例差异很大，有的粗短，有的细长，短杆菌近似 球状，长杆菌近似丝状。一般来说，同一种杆菌其 粗细比较稳定，而长度则经常因培养时间、培养条 件不同而有较大变化。有的杆菌很直，有的稍弯， 有的两端截平如炭疽芽孢杆菌，有的略尖，有的半 圆。
健康兔只有22～23，＜24。
RHD组织灭活苗的制造与检验
病料：PBS=1:10 ，生理盐水也可。 捣碎、滤过，加入甲醛，使之含0.4%， 37℃ 12—24小时，摇匀/2小时。
用0.8%甲醛生理盐水对倍稀释，分装，37℃温 箱内灭活48小时，每2小时摇匀一次，备检。
方 法：
100g+400ml灭菌生理盐水——高 速组 织、捣碎碎机匀浆（13）——过滤——用 0.8%甲醛生理盐水对倍稀释——分装—— 37℃温箱内灭活24小时，每2小时摇匀一次， 备检。
外膜
肽聚糖 脂蛋白
染色操作步骤—涂片固定
干燥
取菌液一环 涂片 干燥
滴生理盐水
挑取菌苔一环
涂片
热固定
革兰氏染色法
1. 涂片、干燥及固定 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染 液，染1-2分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫 色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而 后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色 约25秒，后立即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染2分钟，水洗后 用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果图。
兔病毒性出血症的诊断及其组织 灭活苗的制造
王海荣
兔的病毒性出血症（rabbit viral hemorrhagic diseaze）是兔的一种急性败 血性传染病，RHDV抗原性强，组织灭活苗 效果极佳，安全可靠，目前广泛使用的是 肝组织甲醛灭活苗，联苗兔瘟、巴分加佐剂和不加佐剂两种。含佐 剂苗所产生的抗体水平较高于无佐剂苗，但产生 免疫力的时间迟于无佐剂苗，而且生产程序较为 复杂，成本也高。 当发生免瘟时，作为紧急接种，选用无佐剂苗 更为理想，因产生免疫力较快，可提早控制疫情， 即使平时预防接种，无佐剂苗也极为有效。
细水冲洗 细水冲洗 结晶紫初染2min 碘液媒染1min
细水冲洗 蕃红复染 1~2min 95%酒精脱色 20s
革兰氏染色成败关键：
酒精脱色，脱色不够将G-转变为G+，脱 色过度将G+变成G-； 涂片要均匀、薄； 菌龄影响染色，菌龄老、陈旧的细菌培 养物，往往G+转变成G-，一般做革兰氏染色 用18小时左右的细菌培养物，不要超过24小 时，以免影响染色性。
（1）抗生素可先配制成高浓度的原液， -20℃保存。 （2）抗生素的最高使用浓度。 青霉素钾1万单位/ml 链霉毒钾：20mg/ml即 1mg=1000Iu 2万Iu/ml。 抗生素的配置： 1先配浓溶液20万/ml，25万/ml
2、RHD的临床诊断及实验室诊断
临床上，RHD以神经症状为主，在免疫压力可 表现出非典型变化。 剖检以呼吸系统的严重出血和内脏实质器官的 淤血肿大为特征。 人工感染后的发病高峰时间 接种后36～72小 时。
一 材料
（1）种毒 强毒株组织毒1:10悬液感染成 兔肌注1ml，48～72小时引起发病死亡。 （2）制苗动物 3月龄以上未感染本病和未接种本病疫 苗的健康免。 ⑶ 组织捣碎机等
二、操作方法
1、攻毒 取种毒2-5g制成1:10组织悬液，每毫 升各加青链霉素1000IU单位,在4℃处理4～ 6小时，取上清液皮下或肌肉注射兔子， 1ml/只，实验免接毒后的观察。
油镜操作规程
1. 先用低倍镜和高倍镜观察涂片，待看到目的物后，将其移到 视野中央。 2. 在涂片上滴一滴香柏油，转动换转器使油镜针对通光孔。 3. 使油镜与香柏油接触，这时油镜头几乎与载玻片相接触，切 记不能使用粗调，以免压碎载玻片。 4. 用细调旋钮慢慢提升镜头高度，直至物像清晰。切勿拧反方 向。 5. 观察完毕后，使镜筒远离载物台。取下载玻片。用擦镜纸擦 去镜头上的香柏油：先用干的擦镜纸擦1～2次，把大部分油去 掉，再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦2次，最后再用干擦镜纸擦1次。 擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。擦拭要细 心，动作要轻 。
五、结果：
绘模式种、自 选种镜检油镜 视野图（比例 、形状准确， 注放大倍数， 染色特性）
G+ (金黄色葡萄球菌)
G-（枯草芽孢杆菌）
G-（大肠杆菌）
Gram Stain of Staphylococcus aureus
Gram Stain of Escherichia coli
A Gram Stain of a Mixture of Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria.
RHDV可凝集人的O型红细胞，温度对血 凝无显著影响，PH4.4-7.2时血凝稳定，血 凝具有特异性，能被高免血清所抑制。
10%肝悬液4000rpm，10-15分钟离心后取上清， 1%人O型红细胞做HA，放置20-30分钟出结果， 血凝现象的观察时间不超过45分钟。 HA≥1︰160即为阳性 阳性病料无论是自然死亡 还是人工感染致死，其血凝价一般不低于25。
细胞壁 厚度与强度 肽聚糖数量、含量 脂类含量 磷壁酸（垣酸）
革兰氏阳性菌 (G+) 厚、致密、坚韧 多层、含量高、占细胞 干重40—90% 少、占细胞干重1-4% +
革兰氏阴性菌 (G-) 薄、疏松 单层、含量低、占细胞 干重5—10% 多、占细胞干重11-22% -
脂多糖、磷脂、脂蛋白
-
+
磷壁酸
检验：
①安全检验：2—3倍接种量 1ml—3ml(血液琼脂斜面，厌氧肉肝汤) ②无菌检验：培养基接种。 ③效力检验：
③ 效力检验：
试验： 对照：7——10天产生免疫力→攻毒。对 照免三分之二或100%死亡。 保护率应>80%
4、免疫期测定 5、疫菌的保存 4℃ 25℃ 保存6个月
七 思考题
1 兔瘟的病变有哪些？ 2 如何制备兔瘟组织灭活苗？