第二章药物分析基础分析方法验证
药物分析方法的开发与验证
药物分析方法的开发与验证药物分析方法的开发与验证药物分析方法是药物研究的重要环节之一，它的开发和验证对于药物的质量控制和治疗效果的保障至关重要。
药物分析方法的开发和验证需要遵循一定的规范和流程，本文将从这两个方面进行阐述。
一、药物分析方法的开发药物分析方法的开发是指根据药物的特性和需求，设计出一种可靠、准确、灵敏、重复性好的分析方法。
药物分析方法的开发需要进行以下几个步骤：1. 确定分析目标：首先需要确定要分析的药物种类、成分及其含量范围等，以及需要达到的分析指标和要求。
2. 确定分析方法：根据药物的化学特性、分子结构等，选择合适的分析方法，如色谱法、质谱法、光谱法等。
3. 优化实验条件：进行实验前，需要对实验条件进行优化，如样品前处理、色谱柱选择、流速和波长等参数的调整等。
4. 确定分析参数：根据实验结果，确定分析参数，如检测限、定量限、线性范围、精密度和准确度等。
5. 编写操作规程：根据实验结果，编写操作规程，确保实验的可重复性和准确性。
二、药物分析方法的验证药物分析方法的验证是指通过一系列实验，证明该方法能够满足预期的分析指标和要求。
药物分析方法的验证需要遵循以下几个步骤：1. 确定验证参数：根据药物特性和需求，选择适合的验证参数，如精密度、准确度、线性范围、检测限和定量限等。
2. 进行实验验证：根据操作规程进行实验验证，并记录实验结果。
3. 数据处理：对实验结果进行数据处理和统计分析，计算出各项验证参数。
4. 判断结果：根据验证结果，判断该方法是否符合预期要求，并进行合理解释。
5. 编写报告：根据验证结果，编写验证报告，并加以存档。
总之，药物分析方法的开发和验证是药物研究中不可或缺的环节。
只有通过科学规范的方法开发和验证出可靠的分析方法，才能保证药物质量的稳定性和治疗效果的有效性。
因此，在药物研究中，应高度重视药物分析方法的开发和验证工作。
药物分析--知识点
第一章药物分析的任务与发展药物分析是一门研究药品及其制剂的组成、理化性质、真伪鉴别、纯度检查及其有效成分的含量测定等的一门学科。
目的是保证人们用药安全、合理、有效。
药品用于防病、治病、诊断疾病、改善体质、增强机体抵抗力的物质。
药典是一个国家关于药品标准的法典，是国家管理药品生产与质量的依据。
第二章药物分析的基础知识第一节药品检验工作的基本程序一般为取样、鉴别、检查、含量测定、写出报告。
取样：鉴别：判断真伪。
检查：称纯度检查，判定药物优劣。
含量测定：测定药物中有效成分的含量。
检验报告必须明确、肯定、有依据。
计量仪器认证要求：县级以上人民政府计量行政部门负责进行监督检查。
符合经济合理、就地就近。
第二节药品质量标准分析方法验证目的是证明采用的方法适合于相应的检测要求。
验证内容：准确度、精密度(包括重复性、中间精密度和重现性)、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。
一、准确度：是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以百分回收率表示。
至少用9次测定结果进行评价。
二、精密度：是指在规定的条件下，同一个均匀样品，经过多次取样测定所得结果之间的接近程度。
用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。
1、重复性：相同条件下，一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。
至少9次。
2、中间精密度：同一个实验室，不同时间不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。
3、重现性：不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。
分析方法被法定标准采用应进行重现性试验。
三、专属性：指在其他成分可能存在的情况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，用于复杂样品分析时相互干扰的程度。
鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，圴应考察专属性。
四、检测限：指试样中被测物能被检测出的最低量，无须定量。
用百分数、ppm或ppb表示。
五、定量限：指样品中被测物能被定量测定的最低量，测定结果应具一定的精密度和准确度。
六、线性：系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。
药物分析 第二章 药物的鉴别试验
药物分析教研室
1
主要内容
第一节 药物鉴别试验的定义及目的
第二节 药物试验的项目 第三节 鉴别方法 第四节 鉴别试验的条件及方法验证
2
第一节 药物鉴别试验的定义及目的
▪ 定义：根据药物的分子结构、理化性质，采用 物理、化学或生物学方法来判断药物的真伪。
▪ 目的：不是对未知物进行定性分析，而是证实 贮藏在有标签容器中的药物是否为其所收载的 药物。
HO—CH—COOH
水浴中
HO—C—COONH4
2Ag+
+2NH3+2H2O
HO—C—COONH4
18
（三）芳香第一胺类
稀盐酸
供 试
+ 0.1mol/L亚硝酸钠
品
碱性-萘酚试液
N2+Cl-.
橙黄色到猩红色 沉淀
+NaNO2+2HCl
+NaCl+2H2O
N2+Cl-.
+
+NaOH
+NaCl+2H2O
31
（三）荧光反应鉴别法 ①药物本身在可见光下发射荧光
如：硫酸奎宁溶液显蓝色荧光 ②药物及适当试剂反应后发射荧光
如：氯普噻吨+HNO3后，紫外下显绿
碱性 VB1 K3Fe(CN)6 硫色素（蓝色荧光）
32
（四）气体生成反应鉴别法 ①大多数伯胺（铵）类药物、酰尿类以及某些酰
胺类药物，可经强碱处理后加热产生氨气。 红色石蕊试纸变蓝 硝酸亚汞试液湿润的试纸显黑色
对照品法：将供试品与对照品在同样的条件下绘制 红外图谱，彼此对比是否一致的方法。可消除不 同仪器和操作条件造成的误差。USP多采用对照 品法。
药物分析第二章药物的鉴别试验
5、芳香第一胺类
供试品 + 稀盐酸 + 亚硝酸钠 + 碱性β 萘酚试液 ----橙黄色到猩红色沉淀
6、托烷生物碱类 供试品+ 发烟硝酸（在水浴上蒸干）---------黄色殘渣（冷却）
乙醇（2D）+氢氧化钾（1粒）
------------------------------------------深紫色 （三）专属鉴别试验 在一般鉴别试验的基础上，证实是某一种药物（详见各论）。
E:制备氧化铝方法代号
原点至色谱斑点中心的距离 (2)比移值Rf == -----------------------------------------原点至展开剂前沿的距离 供试品的Rf值与标准品的Rf值比较,由此确定供试品的成份.
例:硫酸阿米卡星的薄层色谱法鉴别试验(P35) (1)布板:硅胶H (2)配溶液(供试品)
折光率(20℃):指光线在空气中进行的速度与供试品中 进行速度的比值 n t
D
t 比旋度:一定波长与温度下，偏振光透过长1dm且每1ml中含 [ ]D 有旋光性物质1g的溶液时测得的旋光度
例：称取葡萄糖10.00g，加水溶解并稀释至100.0mL， 于20℃用2dm测定管，测得溶液的旋光度为+10.5°， 求其比旋度？ 解：溶液厚度：2dm: +10.5 ° 1dm: +5.25 ° 浓度：10g/100ml=0.1g/ml 比旋光度： +5.25 °×10=+52.5°
4、核磁共振（NMR） H核或C核的化学位移
(三)X射线粉末衍射法 布拉格方程
（四）色谱鉴别法 1、薄层色谱 将吸收剂或支持剂均匀铺在玻璃板上（或聚酯薄膜塑料或 铝箔上），把要分离分析的样品点在薄层色谱板上，用溶剂展 开，在日光或紫外光下观察所获得的斑点，从而达到分离、 分析、鉴定目的。 例: 药物中特殊杂质的检查 (醋酸可的松中其他甾体的检查) (1)布板 (2)点样 (3)显色
药物分析 药物分析方法的验证
2. 验证方法
（1） 含量测定
1）基质无（原料药）/可模拟（制剂）
回收率(%)=
测得量 加入量
100
2）基质不可模拟（制剂、中药）
回收率(%)=
测得量 - 本底值 加入量
100
（2） 杂质检查——方法同2）
2. 验证方法（其他方法）
• 可与已知准确度的另一方法的测定结果比较 ——药典标准方法 / 经过验证的方法
• LOD是一种限度检验效能指标， 反映方法的灵敏度
1 直观法
目视法评价的方法: 化学反应 / TLC ——鉴别的显色法； 杂质检查的TLC
2 信噪比法
3 标准偏差/ 标准曲线
显示信号与噪声水平的方法: HPLC ——S/N=3（2） 时的相应浓度或量
其他分析方法: UV-Vis法
LOD 3.3 / S δ空白响应偏差
含量水平
限度（%）
100 % 10 % 1% 0.1%
98~101 95~102 92~105 90~108
0.01 % 10 g/g （ppm） 1 g/g （ppm） 10 g/kg （ppb）
85~110 80~115 75~120 70~125
（二） 精密度
1. 定义 • 同一均匀供试品多次取样测定 所得结果之间的接近程度 • 相对标准偏差（%， RSD）；
• 也可由所测定的精密度、线性和专属性推算 ——原料药含量HPLC测定法
3. 数据要求 • 9个测定结果（n=9）
3水平×3样品 • 化药：1 ︰ 0.8、1 ︰ 1、1 ︰ 1.2 • 中药: 1 ︰ 0.5、1︰1、1︰1.5
3. 数据要求
样品中被测成分的含量水平 与回收率限度 要求的关系
药物分析 第二章鉴别
药品的熔点与分子结构有关，当构成晶 格的单位（对有机化合物来说一般是分子， 无机化合物的是离子或原子组成）受热， 动能增加到足以克服各单位间相互作用力 即格子力，晶格崩溃涣散，这时的 温度 就是固体的熔点。每种纯的固体有机化 合物都有自己的独特的晶型结构和分子间 力，因此要熔化固体，就需要一定的热能， 所以每种固体物质都有独特的熔点。
5、制备衍生物测定熔点法
药物＋试剂 新化合物有一定mp; 药物酸化或碱化生成游离酸或碱。操作繁琐费时 间，应用较少。
二、光谱鉴别法
测定最大吸收波长，或同时测定最小吸收波长 规定浓度的供试液在最大吸收波长测定吸收度 规定吸收波长和吸收系数法 规定吸收波长和吸收度比值法 经化学处理后, 测定其反应产物吸收光谱特性
比旋度：指在一定波长下，偏振光透过1dm且每1ml中含有
旋光性物质1g的溶液时测得的旋光度。可用于鉴
别药物、检查药物的纯度和含量测定。
[n]TD = 100α/dL 摩尔吸收系数εh.P收载的方法）E1%1cm=A/CL
二、一般鉴别试验 （general identification test）
注意事项：
1、由于受薄层板质量、边缘效应等因素的影响，实际操作 中有时会遇到同一物质在同一薄层板上的Rf值不一的情 况，操作中可增加将供试品溶液与对照品溶液等量混合， 点样后出现单一斑点作为鉴别依据。
2、单独使用TLC鉴别时，需要进行色谱系统适应性试验内 容，对斑点的比移值和分离效能进行考察。必要时进行 灵敏度考察。
（二）提高反应灵敏度方法 1. 加入与水不混溶的有机溶剂提取浓集
2. 改变观测方法
溶解度
物理常数: 相对密度、馏程、熔点、比旋度、吸收系数 、 折光率、黏度、酸值、碘值、皂化值、羟值
药物分析药物的鉴别试验
➢ 规定λ和Aλ1/Aλ2 ➢ 经化学处理后，测定其反应产物的吸收光谱 特性。
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55
2021/3/11
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例1：布洛芬
【鉴别】 (1) 取本品，加0.4％氢氧化钠溶液 制成每1ml中含0.25mg的溶液，照分光光度 法（附录Ⅳ A）测定，在265nm与273nm的 波长处有最大吸收，在245nm与271nm 的波 长处有最小吸收，在259nm的波长处有一肩 峰。
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2.有机酸盐
水杨酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、 枸橼酸盐
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（1）水杨酸盐
① FeCl3反应
COOH
6
OH+FeCl3
弱酸性
COO-
O- Fe 2
Fe
+ 12HCl
3
中性
②加稀HCl，即析出白色沉淀；分离，沉淀溶
于醋酸铵溶液。
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例：水杨酸镁
【鉴别】 (1) …… (2)取本品约0.3g，置洁净 的试管中，加水10ml溶解，加硝酸银试液过 量，即生成白色沉淀，滴加氨试液恰使沉淀溶 解后，将试管置水浴中加热，银即游离并附在 管的内壁成银镜。
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3.芳香第一胺
NH2
重氮化-偶合反应
R
取供试品约5mg，加稀盐酸1ml，必要时缓缓
+NaCl + H2O
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氨苯砜
【鉴别】 (1) 本品显芳香第一胺类的鉴别 反应（附录Ⅲ）。 (2) ……。
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药物分析的方法学验证
药物分析的方法学验证一、药物分析的方法学验证所要做到的事项新药申报时，药品质量标准中分析方法必须验证；药物生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法必须进行验证；药物分析检验时药品生产的GMP的药物分析的方法学验证，是保证药物分析结果准确性的前提和基础，也是实现药物分析检测GMP的必然要素。
构成药物分析中的检测方法验证，这要涉及到以下些方面的内容：1、分析方法验证成功的前提条件：（1）仪器已经确认、校正并在有效期内（2）经过培训的人员（3）可靠稳定的对照品（4）可靠稳定的实验试剂（5）确认受试溶液的稳定性，在规定时间内无降解。
2、分析方法学验证所要求验证的内容：（1）含量的测定（2）杂质的含量测定（3）药物的定性鉴定（4）药物的含量均匀度测定（5）药物的微生物检测（6）药物的细菌内毒素的检测二、验证内容：1、准确度：准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。
测定回收率R（recovery）的具体方法可采用加样回收试验法来进行测定。
加样回收试验已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。
数据要求:规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次2、精密度：（重复性、中间精密度和重现性精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。
（1）重复性(repeatability):在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价（2）中间精密度同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度（3）重现性(reproducibility)不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度（4）数据要求：需报告SD，RSD和可信限。
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回收率（%）
测得量 加入量
100（%）
9个测定结果
回收率（%）
测得总量 样品含量 加入量
100（%）
(二) 杂质定量测定
3个不同浓度 (80,100,120％)
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加入已知量杂质进行测试
每个浓度各3份
2
二、精密度
1.重复性
同一分析人员 连续测定所得结 果的精密度; 也称批内精密 度或日内精密度
药品质量标准分析方法验证
需验证的项目
•鉴别试验 •杂质检查 •含量测定 •防腐剂 •溶出度,释放度
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验证的内容
准确度
精密度
重复性 中间精密度 重现性
专属性
检测限 定量限 线性 范围 耐用性
1
一、准确度
定义
❖ 准确度系指用该方法测定的结果与 真实值或参考值接近的程度
❖ 一般用回收率(%)表示
LOD
f
3S空
C样 A样
3S空
5
五、定量限
定量限(limit of quantitation, LOQ )是指试样 中被测物能被定量测定的最低量; 反映方法的灵敏度
2020/8/5
测定结果应具有一定准确度和精密度
杂质和降解产物用定量方法研究时, 应确定LOQ
LOQ的测定方法与LOD相同 相应的系数(倍数)不同, 如信噪比S/N=10
3
三、专属性
定义 与应用
❖ 在其他成分(杂质,降解产物,辅料等)可能 存在下,方法能正确测定出被测物的特性
❖ 鉴别,杂质检查和含量测定方法
(一) 鉴别反应 空白, 结构相
似物或有关物质呈 负反应
2020/8/5
(三) 含量与杂质测定 含杂质或降解产
物的试样中各峰能 获得分离
4
四、检测限
检测限(limit of detection, LOD)是指试样中被 测物能被检测出的最低浓度或量 LOD是一种限度检验效能指标,反映方法灵敏度
➢ GC法典型因素有: 不同厂牌或批号的色谱柱,
固定相, 不同类型的担体, 柱温, 进样口和检
测器温度等
2020/8/5
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八、验证内容的选择
验证内容选择的一般原则: ➢ 非定量分析方法 如鉴别,杂质的限度检查法: 验
证“专属性”,“检测限”和“耐用性”
➢ 定量分析方法 如原料药或制剂的含量测定及含
1.目视法
2.信噪比法
2020/8/5
3.标准偏差 法
➢ 适用于可用目视法直接评价结果的 分析方法, 非仪器分析法
➢ 鉴别的显色法;杂质检查的TLC
适用于能直观显示信号与基线噪声 水平的分析方法, 如HPLC法
信噪比S/N=3(2)时的相应浓度或量
适用于不能直观比较信噪比的仪器
分析方法, 如UV-Vis法
6
六、线性与范围
2020/8/5
线性系指在设计的“范围”内, 响应值(y)与 被测物浓度(x)直接呈正比关系的程度 y = ax +b
系列(n≥5)供试样品测定,以响应信号作为被测 物浓度的函数作图
用最小二乘法进行线性回归; 或经数学转换后 再进行线性回归
➢ 范围系指方法适用的高低限浓度或量的区间 ➢ 在试验研究开始前确定验证的范围和方法 ➢ 在范围内应能达到一定精密度,准确度和线性
2.中间精密度
不同时间不同 分析人员用不同 设备测定结果之 间的精密度 批/日间精密度
3.重现性
在不同实验室 不同人员测定结 果之间的精密度
法定标准采用的 分析方法进行
定义
2020/8/5
❖同一均匀供试品多次取样测定所得 结果之间的接近程度
❖标准偏差(s,SD);相对标准偏差(RSD) ❖数据要求同“准确度”
量均匀度,溶出度或释放度的测定方法: 除“检测 限”和“定量限”外, 其余均验证
➢ 微量定量分析方法 如杂质的定量测定方法: 除
“检测限”视情况而定外, 其余均验证
2020/8/5
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八、验证内容的选择
验证内容
准确度
重复性
精密度
中间精密度
专属性 检测限 定量限
线性 范围 2020/8/5 耐用性
鉴别 试验
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六、线性与范围
涉及定量测定的项目均需对范围进行验证 如: 含量测定, 含量均匀度, 溶出度或释放 度, 特殊元素或特殊杂质的定量检查
2020/8/5
➢ 原料药/制剂含量测定: 80%~120%
➢ 制剂含量均匀度检查: 70%~130%
➢ 溶出度或释放度检查: 下限-20%~上限+20%
➢ 特殊元素含量测定: 下限-20%~上限+20%
➢ 杂质测定:
限度±20%
如果杂质检查与含量测定同时进行, 杂质限度-20％~含量上限+20%
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七、耐用性
➢ 耐用性系指在测定条件有小的变动时, 测定
结果不受影响的承受程度; 体现测定条件的
允许变动范围
➢ HPLC法典型因素有: 流动相的组成和pH值
及流速, 不同厂牌或不同批号的同类型色谱
柱, 柱温等
+ + +
分析项目
元素或杂质检查 含量测定及 限度 定量 溶出量测定
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ 11
练习
1．相对标准差表示的应是（ ） A．准确度 B．回收率 C．精密度 D．纯净度 2．药物分析方法的效能指标有（ ）
A．检测限 B．耐用性 C．准确度 D．专属性